短期不同耕作方式對水稻根際土壤細菌群落結構多樣性的影響

周佳 周靈芝 勞承英 申章佑 李艷英 胡泊 黃渝嵐 韋本輝

摘要：【目的】研究短期不同耕作方式對水稻根際土壤細菌群落結構多樣性的影響，為闡釋耕作對稻田土壤微生物多樣性的形成機制提供科學依據。【方法】以旋耕、免耕和粉壟3種不同耕作方式下的水稻根際土壤為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術結合土壤理化性質，分析不同耕作方式下水稻根際土壤細菌群落多樣性特征及其與土壤理化因子的關系。【結果】旋耕、免耕和粉壟處理文庫覆蓋率均較高，分別為98.96%、98.93%和99.04%。Alpha多樣性分析結果顯示，粉壟處理水稻根際土壤細菌群落多樣性Shannon指數顯著高于免耕處理（P<0.05，下同）。旋耕、免耕和粉壟處理分別獲得2747、2734和2813個OTUs，處理間無顯著差異（P>0.05）。各樣本共檢測到細菌類群206個種，隸屬于47門48綱85目134科217屬。物種群落組成分析表明變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門是水稻根際土壤細菌主要優勢菌群，共占比69.96%～73.51%;不同耕作處理水稻根際土壤細菌群落結構差異主要表現在菌群的相對豐度上，變形菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、放線菌門和綠菌門的相對豐度在3種耕作方式間差異顯著。旋耕和免耕處理間OTU水平相似性較高。主成分分析結果顯示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）菌群結構的差異性貢獻率分別為43.15%和23.79%，細菌群落結構表現為粉壟處理受PC1影響明顯、旋耕和免耕處理受PC2影響明顯。冗余分析結果表明前2個排序軸共解釋69.09%細菌群落變化;速效磷、堿解氮和pH是影響細菌群落的重要因子，與變形菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、放線菌門和綠菌門的群落分布顯著相關。【結論】短期不同耕作方式可在一定程度上改變稻田土壤細菌群落多樣性，不同耕作方式間的差異主要體現在細菌群落相對豐度上;土壤速效磷、堿解氮和pH是影響水稻根際土壤細菌群落分布的重要因素。從土壤微生物群落形成角度考慮，粉壟栽培優于旋耕和免耕。

關鍵詞： 水稻;粉壟栽培;旋耕;免耕;土壤細菌;群落結構多樣性;高通量測序

中圖分類號： S154.3;S341.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2401-11

Effects of short-term different tillage methods on the diversity of bacterial community in rice rhizosphere soils

ZHOU Jia， ZHOU Ling-zhi， LAO Cheng-ying， SHEN Zhang-you， LI Yan-ying，

HU Po， HUANG Yu-lan， WEI Ben-hui*

（Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】In order to provide scientific basis for elucidating the formation mechanisms of soil microbial diversity in paddy soils by tillage，the present experiment was conducted to study the effects of short-term different tillage practices on the diversity of bacterial community in rice rhizosphere soils. 【Method】Rice rhizosphere soils under different cultivation modes of rotary tillage，no tillage and Fenlong cultivation were studied by Illumina MiSeq high-throughput sequencing，combined with soil physiochemical traits，to analyze the bacterial diversity characteristics and major microbial communities of rice rhizosphere soils under different cultivation modes，and the correlation between bacterial communities and soil physiochemical traits. 【Result】The results of high-throughput sequencing analysis showed that the library covera-ge of rotary tillage，no tillage and Fenlong cultivation treatments were 98.96%，98.93% and 99.04%，respectively. Alpha diversity analysis showed that the Shannon index of bacterial community diversity of soil rhizosphere in Fenlong cultivation treatment was significantly higher than in no tillage treatment（P<0.05，the same below）. The Venn diagram analysis showed that 2747，2734，and 2813 bacterial OTUs were obtained from rotary tillage，no tillage and Fenlong cultivation treatments，respectively，with no significant differences among three treatments. A total of 206 species of bacteria were detected in the samples，belonging to 47 phyla，48 classes，85 orders，134 families，217 genera. The analysis of the species community composition showed that Proteobacteria，Chloroflexi，Acidobacteria and Nitrospirae were the dominant flora of rice rhizosphere soils，totaling about 69.96%-73.51%. The relative abundance of Proteobacteria，Nitrospirae，Planctomycetes，Actinobacteria and Chlorobi were significantly different? among three tillage treatments. Cluster analysis showed a high OTU level similarity between rotary tillage and no tillage treatments. Principal component analysis of soil bacterial community at the OTU level showed that the contribution rates of principal component 1（PC1） and principal component 2（PC2） flora structure were 43.15% and 23.79%，respectively，and the bacterial flora structure was influenced by PC1 in the Fenlong cultivation treatment and by PC2 in the rotary tillage and no tillage. Redundancy analysis revealed that the first two ranking axes together explained 69.09% of the variation in the bacterial community. Available phosphorus，alkaline nitrogen and pH value were important factors affecting the bacterial community，which were significantly correlated with the community distribution of Proteobacteria，Nitrospirae，Planctomycetes，Actinobacteria and Chlorobi. 【Conclusion】Short-term differences in tillage practices can alter the diversity of bacterial communities in rice paddies to some extents，and the differences between tillage practices are mainly reflected in the relative abundance of bacterial flora. The available phosphorus，alkaline nitrogen and pH of the rhizosphere soils in rice are important factors influencing the distribution of bacterial communities. From the perspective of soil microbial community formation，Fenlong cultivation is pre-ferable to rotary tillage and no tillage.

Key words： rice; Fenlong cultivation; rotary tillage; no tillage; soil bacteria; diversity of community structure; high-throughput sequencing

Foundation item： Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFAA281012）; Guangxi Science and Technology Key Project（Guike AA16380017）; Science and Technology Development Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2016JZ02）

0 引言

【研究意義】土壤微生物作為土壤生態系統中最活躍的部分，通過分解動植物殘體參與土壤微生態的營養物質轉化循環和能量傳遞，是衡量土壤肥力的重要指標之一（Brussaard et al.，2007;Heijden and Wagg，2013）。土壤細菌作為土壤微生物中最大的類群（Nacke et al.，2011），約占微生物總量的70%～90%，可調節土壤結構與肥力的穩定性、養分利用效率和植物生長發育等（Sims et al.，2013;Edwards et al.，2015）。同時，土壤細菌比較敏感，其群落結構組成及多樣性易受土壤類型、土壤理化性質、施肥方式、耕作方式和植被類型等多方面因素的影響（鐘文輝和蔡祖聰，2004;Gil et al.，2011;劉昌等，2018;袁仁文等，2020）。已有研究表明，少免耕、輕耕、旋耕、翻耕和深松等耕作措施能不同程度改變土壤微生物學特性（樊曉剛等，2010;路丹等，2015;陳力力等，2018;潘孝晨等，2019）。因此，研究稻田短期不同耕作方式對水稻根際土壤細菌群落結構組成和多樣性的影響，對解析水稻根際土壤微生物的形成機制及水稻種植耕作方式的選擇具有重要意義。【前人研究進展】近年來，不同耕作方式研究已從宏觀的作物產量和養分效率等逐漸轉向微觀的土壤微生態方面。但由于土壤微生物對環境條件非常敏感，采樣時期、土壤耕作年限、土壤深度及研究方法等不同也導致研究結果對土壤微生物數量、微生物生物量碳氮和多樣性等的影響各不相同（景依葶和毛寧，2018;潘孝晨等，2019）。Minoshima等（2007）研究認為耕作可改變土壤微生物群落的動力學特征;陳冬林等（2010）研究表明耕翻可增加好氣性細菌并減少嫌氣性細菌的數量;孔凡磊等（2011）研究發現，長期免耕處理土壤微生物生物量碳在0～5 cm土層增加，翻耕和旋耕處理則在5～10和10～20 cm土層顯著增加;姬艷艷等（2013）采用Biolog-ECO微平板檢測法研究發現，免耕處理的土壤微生物功能多樣性指數、優勢度指數和豐富度指數比翻耕和旋耕處理顯著增加;郭梨錦等（2013）研究表明，與翻耕相比，短期免耕表層土壤革蘭氏陽性菌/陰性菌顯著提高、Shannon-Winner指數顯著降低;路丹等（2015）采用高通量測序研究發現，免耕和壟作有利于提高稻田土壤微生物多樣性指數;趙亞麗等（2015）研究表明，深松耕作對土壤微生物多樣性影響最大，微生物多樣性指數表現為深松耕作>傳統旋耕>免耕; 程教擘等（2017）采用平板培養計數法研究發現免耕土壤的細菌總量高于翻耕;陳力力等（2018）研究發現稻田免耕和翻耕處理間的細菌多樣性指數和菌群物種相對豐度差異不顯著;劉洪坤和嚴賢春（2019）研究結果顯示，果園土壤細菌數量表現為翻耕>旋耕>免耕，且不同耕作方式間差異顯著。可見，不同耕作方式間土壤微生物數量、群落結構及多樣性和微生物生物量均存在一定差異，也必然影響土壤微生物多樣性，特別是在土壤中占比最高的細菌類群。關于短期耕作對土壤微生物變化的影響，有學者認為短期耕作可改變土壤微生物群落的動力學特征、細菌和真菌的生物量（Minoshima et al.，2007;郭梨錦等，2013），但也有研究認為土壤微生物多樣性相對穩定，短期耕作不會對其產生影響，只有長期耕作才能改善土壤微生物的群落結構和多樣性（Luo et al.，2015;孫瑞波等，2015）。【本研究切入點】粉壟耕作是一種新型全耕層深耕深松耕作技術，已有研究證實，粉壟耕作能降低土壤容重、增加土壤蓄水量（楊雪等，2013），可改變土壤團聚體顆粒組成、增加土壤孔隙度（王世佳等，2020），同時提高作物產量和養分效率，且其優勢可保持多年（韋本輝等，2012;甘秀芹等，2014;Zhai et al.，2017，2019）。目前，關于粉壟耕作栽培對水稻根際土壤微生物影響的研究較少，也缺乏短期耕作條件下粉壟與其他耕作方式對水稻根際土壤細菌群落多樣性影響的對比研究。【擬解決的關鍵問題】利用Illumina MiSeq高通量測序技術，研究短期不同耕作方式下水稻根際土壤細菌多樣性的變化差異，探索耕作方式對水稻根際土壤主要優勢細菌群落結構和多樣性的影響，為闡釋耕作對稻田土壤微生物多樣性的形成機制提供科學依據，也為今后水稻種植耕作方式的選擇提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗于2017年2—7月在廣西農業科學院經濟作物研究所試驗基地進行（東經107°86′，北緯23°03′）。供試水稻品種為H兩優991，購自廣西兆和種業有限公司。供試土壤為紅壤，耕作前采集0～15 cm土層土壤，測定土壤理化性質：pH 6.12（土水比1∶2.5），有機質含量26.73 g/kg，全氮1.46 g/kg，全磷0.88 g/kg，全鉀13.62 g/kg，堿解氮71.80 mg/kg，速效磷48.03 mg/kg，速效鉀181.74 mg/kg。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗方法 試驗采用大田小區試驗，小區面積30 m2（5 m×6 m），小區四周用寬42 cm的塑料隔板隔開（隔板插入土壤約30 cm深），隨機區組排列，3次重復。設旋耕、免耕和粉壟等3種耕作處理：旋耕，即常規漿耕，移栽前1 d在稻田灌水后用傳統拖拉機一次性進行漿耙耕作，深度約15 cm;免耕，即不進行耕作，于移栽前1 d 進行稻田灌水軟土;粉壟，干田時使用自走式粉壟深耕深松機械（廣西五豐機械有限公司）進行耕作整地，耕作深度28 cm，移栽前1 d灌水至干土吸飽水并保持約5 cm水層。

水稻于3月21日采用塑盤漿播進行育秧，秧苗3葉1心時進行拋秧，拋栽密度為30萬蔸/ha。水稻生育期內共施用N 225.0 kg/ha、P2O5 112.5 kg/ha和K2O 270.0 kg/ha，分為基肥和3次追肥（拋秧后7和12 d、幼穗分化前7 d）分次施入。水分干濕交替管理，除種植前耕作方式不同外，其他田間管理措施一致。

1. 2. 2 土壤樣品采集 在水稻成熟期，各處理隨機采集5株水稻根際土壤。具體方法：先去掉表層1 cm 左右的土壤，從土中挖出水稻植株抖掉根系上松散的土，然后刷下與根系緊密結合的土即為根際土壤，土樣在田間充分混勻，并剔除動植物殘體、石塊等雜物后，用四分法取適量過20目篩，裝入無菌離心管后立即用液氮速凍，存放于-80 ℃冰箱用于土壤細菌群落結構多樣性分析，其余土壤置于通風處風干用于測定土壤pH、有機質和速效氮磷鉀等養分。每處理各設3個生物學重復。

1. 2. 3 MiSeq文庫制備及高通量測序 采用 MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取不同處理的水稻根際土壤基因組DNA，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至微基生物科技（上海）有限公司進行文庫構建和Illumina MiSeq高通量測序。采用兩步PCR擴增構建文庫：采用特異引物515F（5'-GTGCC AGCMGCCGCGGTAA-3'）和926R（5'-CCGTCAA TTCMTTTGAGTTT-3'）擴增16S rRNA序列的V4～V5目的片段，將目的片段用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行膠回收，以回收產物為模板進行二次PCR擴增，再次進行二次PCR擴增產物膠回收;采用FTC-3000TM real-time PCR儀對回收產物進行實時熒光定量PCR檢測土壤基因組DNA拷貝數;最后，進行Illumina MiSeq 2x300 bp高通量測序。

1. 2. 4 測序數據生物信息學分析 對MiSeq測序得到的PE reads首先根據Barcode區分每個樣本，接著對序列質量進行質控和過濾，再根據重疊關系進行拼接，拼接后的序列再次進行質控和過濾，最后得到優化序列。利用USEARCH將拼接好的優化序列在97%相似性下進行聚類，得到各樣品OTU的代表序列，利用Mothur和Adobe Illustrator CS6繪制Venn圖。通過Mothur將OTU代表序列在Silva 128、Greengene和RDP數據庫中進行物種注釋分析，分別統計各樣品在不同分類水平上的序列數。同時采用Mothur對OTU進行Alpha多樣性分析，計算Chao、ACE、Shannon和Simpson指數;基于分類學信息分析其Beta多樣性，運用主成分分析方差分解將多組數據的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸取能最大反映方差值的2個特征值，即有效反映樣品間的差異和距離。經Weighted UniFrac分析后，使用非加權組平均法（UPGMA）構建樣品樹狀結構聚類圖，對各樣品OTU的組成情況進行相似性分析。此外，采用Canoco 4.5對土壤優勢細菌門群落和土壤理化性質進行冗余（RDA）分析。

1. 2. 5 土壤理化性質測定 土壤pH采用酸度計法（土水比為1∶2.5）測定，土壤有機質采用重鉻酸鉀容量法測定，土壤全氮采用半微量開氏法測定，土壤全磷采用NaOH熔融鉬銻抗比色法測定，土壤全鉀采用NaOH熔融火焰光度法測定，土壤堿解氮采用堿解擴散法測定，土壤速效磷采用NH4F/HCl浸提鉬銻抗比色法測定，土壤速效鉀采用醋酸銨浸提火焰光度法測定。

1. 3 統計分析

土壤理化性質試驗數據采用Excel 2019進行整理，并以SPSS 22.0進行方差分析（ANOVA）、細菌豐度差異顯著性分析及細菌菌群與土壤理化性質間的Pearson相關分析。

2 結果與分析

2. 1 不同耕作處理水稻根際土壤細菌群落高通量文庫評價結果

基于細菌16S rRNA序列分析，從各處理中共得到有效序列687725條，對原始數據進行Barcode標簽序列過濾后，旋耕、免耕和粉壟處理分別得到優化序列42512條（有效率69.13%）、41701條（有效率69.15%）和46813條（有效率68.16%）（表1）。旋耕、免耕和粉壟處理樣品文庫覆蓋率均較高，分別為98.96%、98.93%和99.04%，說明即使開展更深的測序幾乎也不會產生更多OTUs，即樣品土壤的測序文庫已達飽和狀態，所構建文庫包含樣品中大部分細菌種類，能較好地反映土壤細菌群落結構。

2. 2 水稻根際土壤細菌Alpha多樣性分析結果

為了解旋耕、免耕和粉壟處理下水稻根際土壤細菌多樣性差異，分別對細菌菌群豐富度（Chao指數和ACE指數）和細菌群落多樣性（Shannon指數和Simpson指數）進行分析。結果（表1）顯示，3種耕作處理水稻根際土壤細菌的Chao指數范圍在2544.83～2675.01，ACE指數范圍在2542.82～2654.11，Simpson指數范圍在0.0038～0.0045，以上Alpha多樣性指數在不同處理間的差異均未達顯著水平（P>0.05，下同）;Shannon指數范圍在6.377～6.529，排序為粉壟>旋耕>免耕，粉壟與免耕處理間差異顯著（P<0.05，下同）。說明不同耕作方式下水稻根際土壤細菌群落豐富度差異不明顯，但粉壟處理的細菌群落多樣性高于免耕處理。

2. 3 不同耕作處理水稻根際土壤細菌OTUs分布情況

對有效序列進行質控、拼接和優化，通過RDP數據庫注釋及對97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析，結果表明，在旋耕、免耕和粉壟處理水稻根際土壤中分別獲得2747、2734和2813個OTUs。OTU均一化處理后繪制Venn圖（圖1），發現3個耕作處理共有OTU為2493個，旋耕、免耕和粉壟處理特有OTU分別為23、21和67個，旋耕和粉壟處理共有132個OTUs，免耕和粉壟處理共有121個OTUs，旋耕和免耕處理共有99個OTUs。說明3種耕作處理的水稻根際土壤中細菌群落OTU分布既有共性又存在差異。

2. 4 基于物種分類的水稻根際土壤細菌群落結構組成及多樣性分析結果

利用Illumina MiSeq高通量測序技術和物種分類分析土壤細菌群落，結果顯示，3種耕作處理水稻根際土壤微生物細菌群落共得到206個種，隸屬于47門48綱85目134科217屬。

為了解不同耕作處理下水稻根際土壤物種群落組成多樣性，在門分類水平上對細菌群落組成和相對豐度進行分析，結果（圖2）顯示，旋耕、免耕和粉壟處理水稻根際土壤微生物細菌群落組成多樣性豐富，3種耕作方式下細菌物種總相對豐度分別為98.05%、98.23%和98.32%，主要含有變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、綠菌門（Chlorobi）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、Latescibacteria、浮霉菌門（Planctomycetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）等12個已知菌門，共占比90.88%～93.81%。其中，變形菌門（占比平均數23.06%～28.63%）、綠彎菌門（占比平均數21.32%～25.92%）、酸桿菌門（占比平均數9.53%～15.88%）和硝化螺旋菌門（占比5.11%～7.49%）在3種處理耕作土壤細菌群落結構中占主導地位，是最主要的細菌類群，共占比69.96%～73.51%。

從門分類水平上對物種相對豐度進行Duncans多重比較分析，結果（圖3）顯示，旋耕、免耕和粉壟處理有14個菌門存在顯著差異，分別為變形菌門、硝化螺旋菌門、放線菌門、浮霉菌門、綠菌門、Ignavibacteriae、Candidatus_Woesebacteria、螺旋菌門（Spirochaetae）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、Candidatus_Berkelbacteria、Parcubacteria、異常球菌—棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、Candidatus_Amesbacteria和Nitrospinae。其中，變形菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、放線菌門和綠菌門等主要優勢菌門的相對豐度在3種耕作方式間差異顯著，具體表現：變形菌門相對豐度為粉壟（28.63%）顯著高于免耕（23.06%）;硝化螺旋菌門相對豐度為免耕（8.43%）顯著高于粉壟（6.35%）;浮霉菌門相對豐度為粉壟（3.37%）顯著高于旋耕（2.99%）和免耕（2.89%）;放線菌門相對豐度為粉壟（3.97%）和免耕（3.04%）顯著高于旋耕（1.70%）;綠菌門相對豐度為旋耕（3.01%）和免耕（2.62%）顯著高于粉壟（1.74%）;Ignavibacteriae和螺旋菌門相對豐度為旋耕（1.18%和0.46%）顯著高于粉壟（0.61%和0.31%），免耕（0.88%和0.36%）與其他2種耕作方式間無顯著差異;Candidatus_Woesebacteria、Candidatus_Berkelbacteria、纖維桿菌門、Parcubacteria和異常球菌—棲熱菌門5個細菌門都是旋耕顯著高于免耕和粉壟;Candidatus_Amesbacteria和Nitrospinae相對豐度為粉壟顯著高于免耕，旋耕與其他2種耕作方式間無顯著差異。說明不同耕作處理水稻根際土壤的細菌門水平群落結構組成基本相同，但其群落相對豐度差異較明顯。

2. 5 水稻根際土壤細菌群落Beta多樣性分析結果

2. 5. 1 基于系統發育的相似度聚類分析 Weighted UniFrac展示各樣品間的關系，即組成越相似的樣品，其聚類關系越近。聚類分析結果（圖4）表明，相同耕作方式土壤樣品的OTU水平相似，不同耕作方式下旋耕和免耕樣品的相似性較高，粉壟與旋耕和免耕的相似性相對較低。

2. 5. 2 基于OTU的主成分分析 為了解不同耕作方式下水稻根際土壤微生物群落組成的結構特征，通過分析不同樣品OTU（97%相似性）組成，對不同耕作處理水稻根際土壤細菌群落數據進行主成分分析。由圖5可看出，3種不同耕作處理的水稻根際土壤樣品分布離散，并未聚在一起，表明樣品間細菌群落存在差異。以縱橫坐標軸的零基準線為參考進行主成成分分析，第一主成分（PC1）樣品中菌群結構的差異性貢獻率為43.15%，粉壟處理與PC1軸相距較近，說明粉壟處理水稻根際土壤細菌菌群結構受PC1影響明顯;第二主成分（PC2）的樣品中菌群結構的差異性貢獻率為23.79%，旋耕和免耕與PC2軸相距均較近，說明旋耕和免耕處理根際土壤細菌菌群結構受PC2影響明顯。因此，通過主成分分析可知，細菌群落PC1和PC2共解釋66.94%的樣品間差異性，旋耕、免耕和粉壟處理的水稻根際土壤細菌群落結構存在明顯差異。

2. 6 水稻根際土壤細菌主要群落與理化性質的關系

2. 6. 1 不同耕作處理水稻根際土壤理化性質分析

由表2可知，3種耕作處理水稻根際土壤的pH為4.48～4.95，均偏酸性，表現為粉壟處理顯著高于旋耕和免耕處理;土壤有機質含量為22.68～27.04 g/kg，粉壟處理顯著低于旋耕和免耕處理;土壤堿解氮含量為81.86～100.16 mg/kg，粉壟處理顯著低于旋耕和免耕處理;土壤速效磷含量為36.36～69.94 mg/kg，旋耕處理最高，粉壟處理最低，各處理間差異顯著;土壤速效鉀含量為171.45～246.80 mg/kg，免耕處理最高，旋耕處理最低，各處理間差異顯著。由此可知，不同耕作方式處理下水稻根際土壤理化性質存在明顯差異。

2. 6. 2 不同耕作處理水稻根際土壤細菌優勢菌群與土壤理化性質的RDA分析 為了解旋耕、免耕和粉壟3種不同耕作方式下水稻根際土壤細菌群落與土壤理化性質的關系，將pH、有機質、堿解氮、速效磷和速效鉀土壤理化因子與土壤優勢細菌門進行RDA分析。結果（圖6）顯示，RDA1和RDA2的特征值分別為45.05%和24.04%，說明前2個排序軸共解釋69.09%細菌群落變化。土壤pH與RDA1軸呈正相關，堿解氮、速效磷、速效鉀和有機質則與RDA1軸呈負相關;5個土壤因子均與RDA2軸呈負相關。不同耕作處理的樣品分布在不同象限內，粉壟處理與土壤pH分布在同一象限內，免耕和旋耕處理與堿解氮、速效磷和有機質等土壤因子更接近，說明不同耕作處理水稻根際土壤細菌群落分布受不同土壤環境因子的影響。

2. 6. 3 不同耕作處理水稻根際土壤細菌主要菌群與土壤理化性質的Pearson相關分析 為進一步明確不同耕作方式下水稻根際土壤細菌群落與土壤理化性質的相關性，對門分類水平相對豐度大于0.5%的主要細菌群落與土壤理化因子間進行Pearson相關分析，結果（表3）表明，在14個主要細菌門中，有8個細菌門與土壤理化性質顯著相關。其中，變形菌門與pH呈顯著正相關、與堿解氮呈顯著負相關;硝化螺旋菌門和芽單胞菌門與堿解氮呈顯著或極顯著（P<0.01，下同）正相關;浮霉菌門與pH呈顯著正相關、與有機質呈極顯著負相關、與堿解氮和速效磷呈顯著負相關;放線菌門與速效磷呈顯著負相關;綠菌門與有機質和速效磷呈顯著或極顯著正相關、與pH呈顯著負相關;Ignavibacteriae與速效磷呈極顯著正相關;Candidatus_Woesebacteria與速效磷呈顯著正相關、與速效鉀呈顯著負相關。可見，pH、堿解氮和速效磷是影響細菌群落的重要因子，而速效鉀對細菌群落的影響最小。

3 討論

土壤微生物多樣性豐富有利于維持土壤生態系統的穩定（Cardinale et al.，2006）。土壤微生物群落多樣性評價的重要指標就是多樣性指數，多樣性指數越高說明微生物群落多樣性越豐富、菌群分布更均勻（Caporaso et al.，2010）。本研究的Alpha多樣性指數分析結果表明，不同耕作處理的水稻根際土壤細菌群落豐富度指數差異不顯著，群落組成分析結果也表明旋耕、免耕和粉壟3種耕作方式下細菌物種總相對豐度分別為98.05%、98.23%和98.32%，無明顯差異，說明不同耕作方式下的水稻根際土壤細菌群落物種數量無顯著差異。土壤細菌群落豐富度差異不顯著可能與試驗周期較短有關，微生物繁殖增殖和物種數量的提升需經過一定周期，同時存在不同微生物群落間豐度上升和下降的相互抵消，導致短期不同耕作方式處理的細菌群落物種數量無顯著差異。土壤細菌群落的Shannon指數表現為粉壟處理顯著高于免耕處理，表明粉壟處理較免耕處理其細菌群落更具多樣性，與郭梨錦等（2013）研究指出短期免耕顯著降低稻田土壤微生物群落Shannon-Winner多樣性指數的結果一致，可能與不同耕作方式造成根際土壤通氣狀況不同有關，免耕處理有較強的厭氧條件，而短期粉壟耕作改善了土壤通氣狀況，因此造成不同耕作方式下微生物群落豐度的差異。

土壤細菌群落結構組成受種植作物和土壤環境的影響，不同農田生態系統中細菌種群的組成和豐度存在一定差異（Niu et al.，2017）。路丹等（2015）研究發現，稻田短期免耕和壟作土壤優勢微生物為變形菌門、綠彎菌門、硝化螺桿菌門和酸桿菌門等10個菌門。袁紅朝等（2015）研究表明變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門為稻田土壤細菌主要類群。陳力力等（2018）研究顯示，水稻—油菜雙序列復種免耕和翻耕稻田土壤細菌中主要優勢菌群依次為綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和硝化螺桿菌門。本研究的細菌群落組成分析結果表明，3種不同耕作方式下水稻根際土壤細菌主要菌門為綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門等菌群，與路丹等（2015）、袁紅朝等（2015）、陳力力等（2018）對稻田土壤細菌群落的研究結果相似;3種不同耕作處理水稻根際土壤的細菌群落結構組成差異分析顯示變形菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、放線菌門和綠菌門等14個菌門在相對豐度上存在顯著差異;種群相對豐度變化趨勢分析發現，最大優勢菌門變形菌門相對豐度表現為粉壟顯著高于免耕。此外，菌綱水平差異分析顯示3種耕作處理間主要是變形菌門的β變形菌綱（β-Proteobacteria）差異顯著。變形菌門是細菌中的最大菌門，包含多種代謝種類的細菌，其中β變形菌具有共生性，與許多營養物的利用有關（Li et al.，2016）。免耕處理水稻根際土壤中的硝化螺旋菌門相對豐度明顯高于粉壟，旋耕居中，硝化螺旋菌門是亞硝化反應的主要微生物，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，在氮循環中具有不可替代的生態作用（You et al.，2009;曹雁等，2017）。浮霉菌門相對豐度為粉壟顯著高于旋耕和免耕處理，浮霉菌門可利用亞硝酸鹽氧化銨離子生成氮氣以獲得能量，對全球氮循環具有重要意義（曹雁等，2017）。故推測變形菌門、硝化螺旋菌門和浮霉菌門的相對豐度變化可能參與調節不同耕作方式下水稻根際土壤中氮素的循環利用。放線菌門是植物根際土壤中重要的類群，在促進植物生長及防止病害等方面發揮重要作用（Doumbou et al.，2001;Roopa and Gadag，2019）。本研究中，放線菌門相對豐度在旋耕處理（1.70%）中顯著低于粉壟（3.97%）和免耕（3.04%）處理，具體功能還有待深入研究。

土壤理化性狀差異能顯著影響微生物群落組成（Wu et al.，2008;秦紅靈等，2011）。本研究中，不同耕作方式下水稻根際土壤微生物群落結構與環境因子關系的RDA和相關分析結果表明，pH、堿解氮、速效磷、速效鉀和有機質均是影響土壤細菌群落分布的因素，其中pH、堿解氮和速效磷是影響細菌群落的重要因子。pH是影響土壤微生物群落結構的重要因素（Lauber et al.，2009）。不同耕作方式下，水稻根際土壤中變形菌門、浮霉菌門和綠菌門相對豐度與pH均有顯著相關性;種植前耕層土壤pH為6.12，種植后3種耕作處理水稻根際土壤pH較耕層土壤明顯降低，同時粉壟處理的Shannon多樣性指數顯著高于免耕處理，與Hartman等（2008）研究認為在土壤pH低于6.5時，微生物多樣性會隨pH降低而減少的結果吻合。曹雁等（2017）研究表明，變形菌門、浮霉菌門和硝化螺旋菌門是脫氮細菌，與氮素利用相關。本研究發現3種耕作處理水稻根際土壤的堿解氮含量表現為免耕最高、粉壟最低，變形菌門相對豐度表現為粉壟處理顯著高于免耕處理，浮霉菌門相對豐度表現為粉壟處理顯著高于旋耕和免耕處理，硝化螺旋菌門相對豐度則是免耕處理顯著高于粉壟處理，相關分析結果也顯示變形菌門和浮霉菌門相對豐度與堿解氮含量呈負相關、硝化螺旋菌門相對豐度與堿解氮含量呈正相關，說明變形菌門、硝化螺旋菌門和浮霉菌門可能與土壤氮素的利用相關。此外，本研究中的放線菌門和浮霉菌門相對豐度與土壤速效磷含量呈顯著負相關，粉壟處理水稻根際土壤速效磷含量較低，放線菌門和浮霉菌門菌門相對豐度較旋耕和免耕處理增加，說明粉壟處理速效磷含量降低能激發放線菌門和浮霉菌門的增殖增長，與李金融等（2018）研究復墾土壤多樣性時發現放線菌門菌群與速效磷、速效鉀和有機質含量呈負相關，放線菌門喜低水分、低營養土壤環境的結果一致，但與馬壘等（2019）研究認為放線菌門、浮霉菌門和擬桿菌門相對豐度隨著磷肥施入逐漸升高的結果不同，可能與二者土壤環境條件差異較大有關。馬壘等（2019）的研究對象為砂姜黑土，而本研究是在多呈厭氧的水田。此外，本研究中部分優勢菌群與不同耕作處理間的養分指標變化具有相關性，且對種植后耕層土壤的養分分析結果也表明，免耕處理多種養分主要在表層富集，粉壟處理的土壤養分則為上層降低、下層增加，而旋耕處理中堿解氮和速效磷與免耕相比也有在深層增加的趨勢。因此推測不同耕作方式間部分菌群相對豐度的差異，可能與不同耕作處理改變細菌群落可利用的養分狀況，而引起不同菌群特征發生改變有關。

4 結論

短期不同耕作方式可在一定程度上改變水稻根際土壤細菌群落結構分布和多樣性，不同耕作方式間的差異主要體現在細菌群落相對豐度上，而主要優勢菌門群落結構組成種類基本相似。土壤pH、堿解氮和速效磷是影響不同耕作方式下水稻根際土壤細菌群落分布的重要因素。從土壤微生物群落形成角度考慮，粉壟栽培優于旋耕和免耕。

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（責任編輯 王 暉）