紅麻谷胱甘肽還原酶基因（HcGR）的克隆及鹽脅迫下表達分析

梁國旺 李增強 周步進 常蒙蒙 陳濤 陳鵬

摘要：【目的】克隆紅麻谷胱甘肽還原酶基因（HcGR）并分析其組織表達特性及不同鹽脅迫下的表達模式，為深入研究HcGR基因在響應鹽脅迫的分子調控機制提供理論參考。【方法】基于紅麻轉錄組測序結果，克隆HcGR基因，對其序列進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR檢測HcGR基因在紅麻不同組織及不同鹽度脅迫[CK（0 mmol/L NaCl）、T1（50 mmol/L NaCl）、T2（100 mmol/L NaCl）和T3（200 mmol/L NaCl）]下的表達情況。【結果】克隆獲得的HcGR基因開放閱讀（ORF）長度為1698 bp，其編碼蛋白相對分子量為60 kD，由555個氨基酸殘基組成，理論等電點（pI）為8.46，為親水性蛋白，定位于葉綠體;HcGR蛋白二級結構以無規則卷曲為主，以α-螺旋、延伸鏈和β-轉角為輔，所占比例分別為44.14%、27.75%、22.16%和5.95%，其三級結構由無規則卷曲、α-螺旋和延伸鏈3種結構元件相互盤繞而成;該蛋白與榴蓮GR蛋白親緣關系較近。HcGR基因在紅麻根、莖和葉中均有表達，且相對表達量存在顯著差異（P<0.05，下同），相對表達量排序為葉>根>莖，表明HcGR基因具有明顯的組織表達特異性。在紅麻的根和葉中，HcGR基因相對表達量隨NaCl脅迫濃度增加整體上呈先升高后降低的變化趨勢，且均在T1處理下達峰值，顯著高于CK、T2和T3處理。HcGR基因在莖中的相對表達量隨NaCl脅迫濃度增加呈波動變化趨勢，但T1、T2和T3處理均高于CK，其中T1和T3處理顯著高于CK。【結論】HcGR基因在紅麻根、莖和葉中的表達具有明顯組織特異性，且可被不同濃度NaCl誘導響應鹽脅迫信號，并通過上調各組織中的轉錄水平以提高抗鹽脅迫能力，故推測該基因在紅麻抗鹽脅迫機制中發揮重要調控作用。

關鍵詞： 紅麻;谷胱甘肽還原酶（GR）;基因克隆;鹽脅迫;實時熒光定量PCR;表達分析

中圖分類號： S563.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2412-08

Cloning of glutathione reductase gene（HcGR） and its expression in response to salt stress of kenaf （Hibiscus cannabinus）

LIANG Guo-wang1， LI Zeng-qiang1， ZHOU Bu-jin1， CHANG Meng-meng1，

CHEN Tao2， CHEN Peng1*

（1College of Agriculture， Guangxi University/Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Plant Genetics and Breeding，Nanning? 530004， China; 2Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】To clone the glutathione reductase gene（HcGR） of kenaf（Hibiscus cannabinus） and analyze its tissue expression pattern under different concentrations of salt stress，so as to provide theoretical reference for further study on the molecular regulation mechanism of HcGR in response to salt stress. 【Method】The HcGR gene of kenaf was cloned based on the related fragments of kenaf transcriptome and analyzed by bioinformatics; the expression of HcGR in different tissues and salt stress[CK（0 mmol/L NaCl）， T1（50 mmol/L NaCl）， T2（100 mmol/L NaCl） and T3（200 mmol/L NaCl）] was studied by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The length of HcGR open reading frame（ORF） was 1698 bp，the relative molecular weight of encoded protein was 60 kD， encoding 555 amino acids，with theoretical isoelectric point（pI） of 8.46，and was predicted to be a hydrophilic protein and located in chloroplast. HcGR protein se-condary structure was dominated by irregular curl，α- helix，extension chain and β- turn，each with 44.14%，27.75%，22.16，and 5.95%. The tertiary structure consisted of irregular curl，α- helix and extension chain，and with a high homology with GR protein in durian. HcGR gene was expressed in the roots，stems and leaves of kenaf，and showed significant difference in tissue expression（P<0.05， the same below）， with the relative expression level of leaf>root>stem. This indicated that HcGR had tissue expression specificity. The relative expression level in the roots and leaves increased firstly and then decreased with the increase of NaCl stress concentration，and reached the peak value under T1 treatment，which was significantly higher than that of CK， T2 and T3. In stem， the HcGR showed a fluctuated trend with the increase of NaCl concentration， however， the expression level under T1， T2 and T3 treatments（T1 and T3 reached significantly level） were higher than that in CK. 【Conclusion】The expression of HcGR in the roots，stems and leaves of kenaf has obvious tissue specificity and can be induced by NaCl at various concentrations to respond salt stress. up-regulating transcriptional level in different tissues can increase salt resistance ability. It is speculated that HcGR plays an important regulatory role in the mechanism of resistance to salt stress in kenaf.

Key words： kenaf; glutathione reductase（GR）; gene cloning; salt stress; real-time fluorescence quantification PCR; expression analysis

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31560421，31960368）;National Hemp Industry Technology System Construction Project（CARS-16-E14）

0 引言

【研究意義】土壤鹽漬化是阻礙農業生產可持續發展的主要因素之一，已成為世界性的環境問題（趙可夫和范海，2002）。在鹽脅迫的生長條件下，植物細胞代謝受阻而產生大量O2-、OH-及H2O2等活性氧（Reactive oxygen species，ROS），進而破壞ROS產生和清除間的動態平衡，致使蛋白質降解及核酸水解，最終引起細胞程序性死亡（Iahikawa et al.，2010;王康君等，2018）。谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）是植物抗氧化酶類中的關鍵成員之一，也是生物體中廣泛存在的一種黃素蛋白氧化還原酶，對還原型谷胱甘肽（L-glutathione reduced，GSH）再生、維持胞內GSH/GSSG的高比率及細胞氧化還原平衡等植物生命過程和抗性生理發揮重要作用（鄧治等，2014）。紅麻（Hibiscus cannabinus）是錦葵科（Malvaceae）木槿屬（Hibiscus）的一年生草本韌皮纖維作物，具有耐鹽堿、易栽種等特性，是鹽堿地改良的優勢作物（陳濤等，2011）。因此，探究鹽脅迫對紅麻生長發育的影響，了解紅麻耐鹽機制，對增強紅麻的鹽堿地抗性和經濟產量具有極其重要的社會經濟和生態效應。【前人研究進展】GR通過抗壞血酸—谷胱甘肽（Ascorbate-glutathione，ASA-GSH）循環參與清除植物體內多余的ROS（Noctor et al.，2012;Gill et al.，2013），具體清除機制：GR將NADPH作為唯一的還原力和電子供體，催化氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）還原為GSH（趙可夫和范海，2002）。目前，已從水稻（Wu et al.，2013）、苧麻（朱守晶等，2015）和擬南芥（Garnik et al.，2016）等植物中克隆鑒定出GR基因，并分析其表達模式，結果證實GR參與響應逆境脅迫。宋貴方等（2012）研究顯示，陸地棉GR基因受干旱脅迫誘導上調表達;康太等（2016）研究表明，隨著干旱程度的加深，檸條錦雞兒葉片中CkGR基因的表達量與其酶活性呈逐漸上升趨勢，說明CkGR基因對提高檸條錦雞兒的耐旱性具有重要調控作用;張騰國等（2018）研究表明，高鹽、高溫、干旱和低溫脅迫可誘導油菜GR1和GR2基因表達;李慧等（2019）研究表明，鎘脅迫下豆梨PcGRchl和PcGRcyt基因在葉片中的表達量與對照（無鎘脅迫）相比呈明顯上調趨勢。【本研究切入點】至今，鮮見有關紅麻GR基因的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】基于紅麻轉錄組測序結果，克隆紅麻GR基因（HcGR），對其序列進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR檢測HcGR基因在紅麻不同組織及不同鹽脅迫下的表達模式，為深入研究紅麻耐鹽性的分子調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為廣西大學農學院周瑞陽教授饋贈的紅麻P3A。主要試劑：FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、Taq Master Mix、FastPure Plasmid Mini Kit、DNA Marker、RNase A、DNase I（RNase-free）及HiScript? III RT SuperMix for qPCR反轉錄試劑盒等均購自北京全式金生物技術有限公司;其他化學試劑如氯化鈉（NaCl）、苯酚、過硫酸銨和異戊醇等為進口或國產分析純。主要儀器設備：紫外分光光度計（Thermo Scientific，美國）、PCR儀（BIO-RAD，美國）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 鹽脅迫處理及樣品采集 2019年4月選取籽粒飽滿、大小均勻的紅麻種子，經清水沖洗干凈置于40 ℃蒸餾水中浸種1 h，再用3% H2O2消毒10 min，蒸餾水沖洗5遍后，播種在墊有2層浸濕衛生紙的塑料盒中，置于恒溫光照培養箱中發芽。培養箱晝夜溫度為30和26 ℃，光照周期14 h/d，相對濕度62%～66%。每天向塑料盒中添加適量蒸餾水，5 d后選取生長健康、長勢一致的幼苗，隨機均分為4個組（每組35株），分別在1/2 Hoagland營養液中添加不同濃度的NaCl對幼苗進行鹽脅迫處理：CK（0 mmol/L NaCl）、T1（50 mmol/L NaCl）、T2（100 mmol/L NaCl）和T3（200 mmol/L NaCl）。處理后移入育苗盤進行水培，間隔2 d更換1次處理液，7 d后分別收集植株根、莖和葉，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 參照賈瑞星（2019）改良的CTAB法提取紅麻總RNA，用DNase I（RNase-free）去除RNA中殘留的少量DNA，然后分別用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000/2000c紫外分光光度計檢驗RNA完整性、純度和濃度。以提取的總RNA為模板，按照HiScript? III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA，于-20 ℃保存備用。然后用紅麻跨內含子引物COXⅡ-F/COXⅡ-R（表1）檢測逆轉錄產物cDNA中是否存在總DNA。所有引物均委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1. 2. 3 HcGR基因克隆 基于紅麻轉錄組GR基因序列（TRINITY_DN18735_c0_g1_i7_2），利用Primer 5.0設計引物GR-F/GR-R（表1）。采用2×Super Pfx Master Mix進行PCR擴增，陰性對照以ddH2O為模板。反應體系20.0 μL：cDNA模板1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq Master Mix 2.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s，進行34個循環;72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒進行回收純化，將目的片段連接至Trans-blunt載體（pEASY?-Blunt Cloning Kit）上，然后轉化Trans5α化學感受態細胞，涂布于含50 mg/L卡那霉素（Kan）的LB瓊脂培養基上，37 ℃培養8～10 h。挑取單個菌落，接種于1 mL含50 mg/L Kan的LB液體培養基中，37 ℃下搖床（200 r/min）培養4～6 h，菌液PCR鑒定呈陽性的單克隆送至深圳華大基因科技有限公司進行測序。

1. 2. 4 生物信息學分析 利用NCBI的ORF Finder對克隆獲得序列進行開放閱讀框（ORF）預測，采用DNAMAN 6.0對最長ORF進行序列分析，并推導其氨基酸序列。利用ExPASy的ProtParam分析編碼蛋白的理化性質;應用SOMPA預測其二級結構、SWISS-MODEL預測其三級結構;使用TargetP 1.1 Server和WoLF-PSORT預測蛋白的亞細胞定位情況。將克隆獲得的HcGR基因序列提交至NCBI數據庫，將其推導氨基酸序列與其他已報道物種GR氨基酸序列進行BLASTp比對，并下載26個具有代表性物種的GR氨基酸序列，利用MEGA 7.0進行序列比對后以鄰接法（Neighbour-jaining，NJ）構建系統發育進化樹。

1. 2. 5 實時熒光定量PCR檢測 根據實時熒光定量PCR引物設計原則設計HcGR基因的熒光定量引物（表1），選取紅麻管家基因Histone3為內參基因。反應體系15.0 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5 ?L，10 μmol/L上、下游引物各0.3 ?L，1.0 ?L cDNA模板，ddH2O（RNase-free）補充至15.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進行39個循環;72 ℃延伸7 min。在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀中進行實時熒光定量PCR檢測，標準品和樣品均設3次重復，以ddH2O替代cDNA模板作為陰性對照。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量（Li et al.，2015;馮嬌等，2018）。

1. 3 統計分析

試驗數據采用SPSS 20.0進行單因素方差分析，利用Duncans新復極差法對平均值進行差異性比較分析，并以Excel 2016制圖。

2 結果與分析

2. 1 紅麻總RNA和cDNA質量檢測結果

如圖1-A所示，提取紅麻總RNA條帶清晰，且A260/A280在1.90左右，A260/A230在2.15左右，純度較高。由圖1-B可看出，擴增產物條帶單一，表明反轉錄產物cDNA已不存在總DNA，可用于后續試驗。

2. 2 HcGR基因克隆結果

HcGR基因PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖2）顯示，PCR擴增產物長度與預期結果（1698 bp）一致，該特異性條帶清晰且無拖尾現象。膠回收該條帶進行測序，結果發現其與轉錄組數據中的HcGR基因序列完全一致。

2. 3 HcGR蛋白理化性質及其結構分析結果

應用DNAMAN 6.0推導HcGR基因ORF編碼的氨基酸序列（圖3），并用ProtParam分析HcGR蛋白理化性質，結果顯示其相對分子量為60 kD，由555個氨基酸殘基組成，其中酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）58個，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）62個，蛋白理論等電點（pI）為8.46，不穩定指數為36.22，總平均疏水指數為-0.130，故推測該蛋白為親水性蛋白。

利用SOPMA預測HcGR蛋白二級結構，結果表明該蛋白含豐富的二級結構，以無規則卷曲為主，α-螺旋、延伸鏈和β-轉角為輔，所占比例分別為44.14%、27.75%、22.16%和5.95%。采用SWISS-MODEL預測HcGR蛋白三級結構，結果如圖4所示。HcGR蛋白的主要結構元件是無規則卷曲、α-螺旋和延伸鏈，由這3種結構元件相互盤繞而成。利用TargetP 1.1 Server和WOLF-PROST對HcGR蛋白進行亞細胞定位預測，結果表明，HcGR蛋白定位于葉綠體。

2. 4 HcGR蛋白同源性比對及進化分析結果

為研究HcGR蛋白在不同生物中的進化關系，將HcGR氨基酸序列與海島棉、長果黃麻、橡膠樹和麻瘋樹等高等植物的GR氨基酸序列進行BLASTp同源比對分析，結果表明，在不同物種間GR蛋白保守，其氨基酸序列相似性為77.82%～88.04%（圖5）。基于構建的系統發育進化樹（圖6）分析不同物種GR蛋白的進化關系，結果顯示HcGR蛋白與榴蓮GR蛋白的親緣關系較近。

2. 5 HcGR基因組織表達特異性分析結果

以正常生長的幼齡紅麻根、莖和葉cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR檢測HcGR基因在紅麻不同組織中的相對表達量，結果（圖7）顯示，HcGR基因在紅麻根、莖和葉中均有表達，且相對表達量存在顯著差異（P<0.05，下同），其中，以在葉中的相對表達量最高，其次是根，二者分別是莖中相對表達量的3.40和1.38倍，表明HcGR基因具有明顯的組織表達特異性。

2. 6 鹽脅迫下HcGR基因表達模式分析結果

以正常生長的紅麻植株為對照，采用實時熒光定量PCR檢測不同鹽脅迫處理下HcGR基因的相對表達量，結果如圖8所示。在紅麻的根和葉中，HcGR基因的相對表達量隨NaCl脅迫濃度增加整體上呈先升高后降低的變化趨勢，且均在T1處理下達峰值，顯著高于CK、T2和T3處理，但根中HcGR基因的相對表達量在CK、T2和T3處理間無顯著差異（P>0.05），葉中HcGR基因的相對表達量在CK、T2和T3處理間也存在顯著差異（圖8-A和圖8-C）。HcGR基因在莖中的相對表達量隨NaCl脅迫濃度增加呈波動變化趨勢，且T1、T2和T3處理均高于CK，其中T1和T3處理顯著高于CK（圖8-B）。可見，不同濃度的NaCl均能誘導HcGR基因響應鹽脅迫信號并通過上調各組織中的轉錄水平以提高抗鹽脅迫能力，故推測該基因在紅麻抗鹽脅迫機制中發揮重要調控作用。

3 討論

生物和非生物脅迫均會嚴重影響植物的正常生長發育，導致植物細胞內ROS含量大幅增加（Ramel et al.，2009;岳遠征等，2018）。植物體內抗氧化劑含量是影響其抗逆性的重要因素之一，其中，GSH是廣泛存在于生物體內的一種重要抗氧化劑，能與許多化合物發生反應，參與細胞內的諸多生理代謝過程，從而對細胞內硫醇的氧化還原狀態維持發揮重要作用（朱帆等，2015）。在植物的生長發育和抗逆境脅迫過程中，GR對GSH的再生起關鍵作用（郭麗紅等，2006）。目前，已有部分植物的GR基因被克隆鑒定，并進行轉基因功能驗證。Chang（1997）將大腸桿菌GR基因導入雜種楊，從而獲得具有抗ROS特性的轉化體;Rebecca等（2000）將菜豆GR基因導入煙草，結果發現轉基因煙草GR活性較非轉基因植株提高3～7倍;佘瑋（2010）研究表明，轉GR基因的苧麻中GR基因過量表達能明顯提高植株對氧化脅迫或其他逆境的耐受性。

本研究克隆獲得HcGR基因序列，并證實該基因在正常生長的幼齡紅麻根、莖和葉中均有表達，且相對表達量存在顯著差異，表明HcGR基因具有組織表達特異性，推測其能在不同組織中調控合成中間代謝產物和代謝終產物，但不同組織中的合成量存在差異。朱守晶等（2015）研究顯示，苧麻GR基因（BnGR1）在成熟葉中的相對表達量最高，其次分別是幼葉、莖尖和根，在莖中的相對表達量最低。韓瑤（2017）研究發現，在巨尾桉組培苗中以莖中的GR基因相對表達量最高，其次是葉，在根中的相對表達量最低。岳川等（2014）對茶樹GR基因（CsGRs）在不同組織中的表達情況進行分析，結果發現，CsGR1基因在花和根中的相對表達量較葉片和莖高;CsGR2基因在葉和莖中的相對表達量較根和花高。可見，GR基因在不同植物不同組織中的表達情況各不相同。

本研究的亞細胞定位結果顯示，HcGR蛋白主要分布于葉綠體。葉綠體是植物細胞代謝中重要的細胞器。不同植物中占主導地位的GR基因不同，如鎘脅迫處理下，番茄通過上調葉綠體中GR基因表達以響應脅迫信號（Kisa，2017），而白菜通過誘導胞質GR基因轉錄，促使其GR活性上升，以維持細胞氧化還原平衡（Lou et al.，2017）。此外，GR基因的表達受不同外源物質調控，如茉莉酸和H2O2等可誘導橡樹HbGR1基因表達（鄧治等，2014）。本研究對鹽脅迫下HcGR基因的表達模式進行分析，結果顯示，T1（50 mmol/L NaCl）脅迫處理下HcGR基因在紅麻根、莖和葉中的相對表達量均較CK（0 mmol/L NaCl）、T2（100 mmol/L NaCl）和T3（200 mmol/L NaCl）處理高，當NaCl脅迫濃度升至200 mmol/L時，在紅麻根和葉中HcGR基因表達明顯下調，表明HcGR基因在紅麻抵抗鹽脅迫中可能發揮一定的調控作用，與劉瑩（2010）的研究結果相符合。但今后還需進一步研究鹽脅迫下內源GSH含量是否發生變化，為施用外源GSH緩解紅麻鹽脅迫提供理論依據。

4 結論

HcGR基因在紅麻根、莖和葉片中的表達具有明顯組織特異性，且可被不同濃度的NaCl誘導響應鹽脅迫信號，并通過上調各組織中的轉錄水平以提高抗鹽脅迫能力，故推測該基因在紅麻抗鹽脅迫機制中發揮重要調控作用。

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（責任編輯 陳 燕）