枯草芽孢桿菌Czk1與化學殺菌劑復配對橡膠樹炭疽病菌的抑菌活性

謝立 賀春萍 梁艷瓊 李銳 鞏佳莉 翟純鑫 吳偉懷 易克賢

摘要：【目的】探究枯草芽孢桿菌與化學殺菌劑協同防治橡膠炭疽病的可行性，構建由生防菌與化學殺菌劑組成的菌藥復配劑，為橡膠炭疽病的可持續防治提供科學依據。【方法】以6種化學殺菌劑（咪鮮胺、百菌清、根康、嘧霉胺、丙環唑和嘧菌酯）及2株菌株（枯草芽孢桿菌Czk1和橡膠膠孢炭疽菌RC178）為試驗材料，采用菌絲生長速率法測定6種化學殺菌劑對RC178的室內毒力，稀釋平板涂布法測定6種殺菌劑與Czk1的相容性，抑菌圈法測定Czk1對RC178的室內毒力，Horsfall法明確菌藥的復配方案。【結果】室內毒力測定研究結果顯示，6種殺菌劑中咪鮮胺對RC178的抑菌效果最好，其有效抑制中濃度（EC50）僅為0.0778 μg/mL，其次為百菌清和根康，EC50分別為0.4694和0.4733 μg/mL。化學殺菌劑與Czk1的相容性測定結果表明，嘧霉胺、嘧菌酯、丙環唑、根康和咪鮮胺與Czk1的相容性均較好，其中根康在中高濃度下還能促進Czk1菌落數量的增長。將濃度為4.75×107 CFU/mL的Czk1分別與濃度為10.4733 μg/mL的根康和濃度為0.0778 μg/mL的咪鮮胺混配，Czk1∶根康=7∶3（v/v）時對RC178抑制的增效作用最強，增效比率（IR）為1.36;Czk1∶咪鮮胺=8∶2（v/v）時對RC178抑制的增效作用最強，IR為1.65。【結論】枯草芽孢桿菌Czk1與咪鮮胺和根康具有較好的相容性，Czk1發酵液分別與咪鮮胺和根康復配對橡膠炭疽病菌RC178的抑菌活性具有明顯增效作用，具有開發成菌藥制劑的潛力。

關鍵詞： 枯草芽孢桿菌;橡膠炭疽病;化學殺菌劑;協同防治

中圖分類號： S476;S435.76? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2480-08

Antimicrobial activity of Bacillus subtilis Czk1 compounded with chemical fungicides against Colletotrichum gloeosporioides

XIE Li1，2， HE Chun-ping1*， LIANG Yan-qiong1， LI Rui1，? GONG Jia-li3，

ZHAI Chun-xin3， WU Wei-huai1，YI Ke-xian1

（1Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou? 571101， China; 2Institute of Forestry， Hainan University，Haikou? 570228， China; 3China College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing? 210095， China）

Abstract：【Objective】To explore the feasibility of synergistic control of rubber anthracnose by Bacillus subtilis and chemical fungicides， and construct a bacteria-fungicide compound composed of bio-control bacteria and chemical fungicides to provide a basis for the sustainable control of rubber anthracnose. 【Method】Six chemical fungicides， prochloraz， chlorothalonil， Genkang， pyrimethanil， propiconazole and azoxystrobin， and two strains of B. subtilis Czk1 and Colletotrichum gloeosporioides RC178 were used as test materials. The hypha growth rate method was used to determine the indoor toxicity of six chemical fungicides to RC178， the dilution plate coating method was used to determine the compatibility of six fungicides with Czk1， the inhibition zone method was used to determine the indoor toxicity of Czk1 to RC178， Horsfall method to clarify the compound plan of bacteria and medicine. 【Result】The results of laboratory toxicity testing showed that prochloraz had the best antibacterial effect on RC178 among the six fungicides， with an median effect concentration（EC50） of only 0.0778 μg/mL， followed by chlorothalonil and Genkang with EC50 of 0.4694 and 0.4733 μg/mL.Compatibility test results of chemical fungicides and Czk1 showed that pyrimethanil， azoxystrobin， propiconazole， Gen-kang and prochloraz had good compatibility with Czk1. Genkang at medium to high concentrations promoted the growth of the number of Czk1 colonies. Mixing Czk1 at? concentration of 4.75×107 CFU/mL with Genkang at concentration of 10.4733 and mixing 4.75×107 CFU/mL ber of Czk1 and prochloraz at 0.0778 μg/mL. When Czk1∶Genkang=7∶3（v/v）， the synergistic effect on the inhibition of RC178 was the strongest， the synergistic ratio（IR） was 1.36; when Czk1∶prochlorazide=8∶2（v/v）， the synergistic effect on the inhibition of RC178 was the highest， and IR was 1.65. 【Conclusion】B. subtilis Czk1 has good compatibility with prochloraz and Genkang. Czk1 fermentation liquor with prochloraz and with Genkang have obvious synergistic effect on the antibacterial activity of C. gloeosporioides RC178， which have the potential to develop a bacterial medicine preparation potential.

Key words： Bacillus subtilis; rubber anthracnose; chemical fungicide; synergistic control

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0201100）; National Natural Rubber Industry Technical System Construction Special Project（CARS-33-BC1）

0 引言

【研究意義】橡膠樹炭疽病主要由膠孢炭疽菌（Colletortrichum gloeosporioides Penz. Sace）和尖孢炭疽菌（C. acutatum Simmons）引起，是橡膠樹上的一種主要葉部病害（李繼鋒，2010）。橡膠炭疽病在世界各植膠區普遍發生（Zheng，2007），1906年在斯里蘭卡首次報道。我國于1962年在海南大豐農場開割膠樹上首次發現該病，其造成膠樹整年落葉而不能割膠，經濟損失嚴重（王紹春和馮淑芬，2001）。橡膠炭疽病菌侵染可引起橡膠樹葉片脫落、嫩梢回枯和果實腐爛，對橡膠的質量和產量帶來嚴重影響，造成重大的經濟損失。現階段對該病害的防治仍以化學防治為主，農業防治為輔。長期使用化學藥劑防治會引起病菌抗藥性及環境污染等問題，農業防治只是在膠樹越冬期至抽芽初期及在病害流行末期通過施用硫酸銨速效肥以促進膠樹快速恢復生長，從而提高其抗病能力（古鑫，2012），但長期施用化肥會導致土壤肥力下降，生產成本增加，環境污染和橡膠品質下降等。因此，篩選防治橡膠炭疽病的高效低毒殺菌劑，開展生物—化學協同防治研究，對橡膠炭疽病的可持續防治具有重要意義。【前人研究進展】目前，國內外針對橡膠炭疽病的研究主要集中在橡膠炭疽病菌生物學特性、侵染特征（馮淑芬等，1998;崔昌華，2006;Liu et al.，2018），以及殺菌劑對橡膠炭疽病菌的毒力測定和殺菌劑篩選試驗方面，利用化學防治橡膠炭疽病的方法主要有化學殺菌劑、煙霧劑（范會雄等，1996）和熱霧劑防治（蔡志英和黃貴修，2011;許麗月等，2012）。王蘭英等（2010）開展8種殺菌劑對橡膠炭疽菌的抑制活性試驗，證明百菌清、抑霉唑和嘧菌酯對橡膠炭疽病的抑制效果較好。鄭肖蘭等（2014）通過開展戊唑醇與苯醚甲環唑混配對橡膠樹炭疽病菌的聯合毒力測定試驗，結果發現戊唑醇與苯醚甲環唑以1∶3混配對膠孢炭疽菌的抑制作用增效明顯。至今，針對該病害開展生物防治方面的研究鮮見報道。樊蘭艷（2013）研究發現，枯草芽孢桿菌Czk1抗菌活性物質為脂肽類粗提物，其對橡膠炭疽病有一定的抑制及抗性誘導作用。生物—化學協同防治在煙草青枯病、油茶炭疽病和芒果炭疽病等多種植物病害防治研究中均有良好效果（黃小琴等，2015;李昕，2015）。韓麗等（2013）開展了枯草芽孢桿菌B26與化學藥劑協同防治木材藍變研究，結果表明，枯草芽孢桿菌B26與戊唑醇按體積比6∶4復配時對藍變菌的抑制有明顯增效作用。谷春艷等（2018）用解淀粉芽胞桿菌WH1G與咪鮮胺復配協同防治草莓炭疽病，室內生物測定結果表明，當咪鮮胺∶WH1G配比為5∶5（v/v）時對病菌抑制的增效作用和防治效果最佳，毒性比率為1.432，防效為69.94%;復配劑對草莓炭疽病的田間防效達67.91%，二者復配不僅可提高對草莓炭疽病的防效，還能有效減少化學藥劑的使用量。謝立等（2020）用枯草芽孢桿菌Czk1與化學殺菌劑協同防治橡膠樹根病，當Czk1∶根康配比為7∶3（v/v）時，對紅根病菌的增效比率（IR）為1.86，對褐根病菌的IR為1.51，增效作用最佳。【本研究切入點】前期研究發現枯草芽孢桿菌Czk1對橡膠炭疽病菌具有較好的抑制作用，亦可誘導橡膠植株產生系統抗性（趙璐璐，2011），具有開發成為微生物農藥的潛力，但單一的生物防治缺乏防治效果的穩定性和長久性，且在大田防效上不顯著。目前，關于橡膠炭疽病的生物—化學協同防治研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】篩選生產中常用防治橡膠炭疽病且能與枯草芽孢桿菌Czk1具有很好相容性的化學殺菌劑并與Czk1進行復配，測定復配劑對橡膠炭疽病菌的抑菌活性，構建由生防菌與化學殺菌劑組成的菌藥復配劑，為橡膠炭疽病的可持續防治提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試殺菌劑 咪鮮胺、百菌清、根康、嘧霉胺、丙環唑和嘧菌酯。6種化學殺菌劑的劑型、含量、生產廠家及供試濃度見表1。

1. 1. 2 供試培養基 PDA培養基、LB培養基和固體培養基的制備參照謝立等（2020）的方法。

1. 1. 3 供試菌株 枯草芽孢桿菌（Bacillus subti-lis）Czk1和橡膠膠孢炭疽菌RC178均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所分離和保存。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 6種化學殺菌劑對RC178的毒力測定 采用菌絲生長速率法測定6種化學殺菌劑對RC178的室內毒力。參照謝立等（2020）的方法，配制含不同濃度供試6種化學殺菌劑的PDA培養基，接入RC178菌餅，置于培養箱中培養，測定并計算不同殺菌劑對RC178的平均抑制率。

1. 2. 2 Czk1與6種化學殺菌劑的生物相容性測定

采用稀釋平板涂布法測定6種殺菌劑與Czk1的相容性。將實驗室保存的Czk1菌液平板劃線純化分離后獲得Czk1單菌落，取Czk1菌株單菌落1 μL接入99 mL已滅菌的LB液體培養基中，于37 ℃恒溫條件下培養12 h備用。參照謝立等（2020）的方法，配制含不同濃度供試6種化學殺菌劑的LB培養基，平板稀釋涂布法將100 μL Czk1稀釋菌懸液均勻涂布在LB含藥培養基表面，置于37 ℃下恒溫培養。分別于培養第2、5和10 d檢測Czk1菌體情況，取樣涂片用尼康生物顯微鏡NI-E檢查孢子萌發情況，孢子分離取樣參照張筱梅等（2016）的方法。每處理5次重復，以加等量無菌水為空白對照（CK）。

1. 2. 3 單劑Czk1對橡膠樹炭疽病菌的毒力測定

采用抑菌圈法測定Czk1對RC178的室內毒力。根據1.2.2方法，將單劑Czk1搖菌12 h后，配制其含菌量濃度分別為1.00×104、1.00×105、1.00×106、1.00×107、1.00×108和1.00×109 CFU/mL。參照謝立等（2020）平板對峙法的濾紙片法，計算其平均抑制率、有效抑制中濃度（EC50）、有效抑制75%真菌生長所需的濃度（EC75）和相關系數（r）。

1. 2. 4 復配劑對橡膠炭疽病菌的毒力測定 根據單劑毒力測定結果，以對橡膠炭疽菌抑制效果較佳且與Czk1具有較好相容性的殺菌劑進行菌藥復配，單劑EC50為基礎，配制兩單劑的有效抑制中濃度藥液，并按體積比Czk1∶殺菌劑=0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1和10∶0不同配比進行復配。參照謝立等（2020）的方法，計算平均抑制率、理論抑菌率;并采用Horsfall法計算聯合毒力增效（尹敬芳，2006）。

1. 3 統計分析

采用SPSS 11.0、Excel 2019.0和JMP 10.0進行數據統計分析，采用Duncans新復極差法進行數據差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2. 1 6種化學殺菌劑對RC178的室內毒力測定結果

6種化學殺菌劑對RC178均具有不同程度的抑制作用，且隨著藥劑質量濃度增加其毒力不斷增強，但不同化學殺菌劑對RC178的抑制效果存在明顯差異（表2）。6種殺菌劑中咪鮮胺對橡膠炭疽菌的抑菌效果最好，其EC50僅為0.0778 μg/mL，其次為百菌清和根康，EC50分別為0.4694和0.4733 μg/mL;嘧霉胺和丙環唑的抑菌效果一般;嘧菌酯的EC50最大，為3.8388 μg/mL，在6種供試殺菌劑中其抑菌效果最差。

2. 2 Czk1與殺菌劑的相容性測定結果

由表3可知，Czk1與6種化學殺菌劑的相容性存在差異，在化學殺菌劑較低濃度（0.05～0.10 μg/mL）時Czk1均能正常生長;當化學殺菌濃度≥0.25 μg/mL時百菌清出現明顯的抑制效果，基本抑制Czk1的生長和孢子萌發，不能與Czk1很好相容;嘧菌酯、嘧霉胺、丙環唑和根康4種殺菌劑無論在高濃度或低濃度條件下，Czk1均能正常生長，相容性較好，且根康在中高濃度條件下還會促進Czk1菌落數量的增長;咪鮮胺與Czk1的相容性也較好，但當濃度達1.00 μg/mL時會輕微抑制Czk1生長。綜合6種化學殺菌劑的毒力測定及與Czk1相容性測定結果，分別選擇咪鮮胺和根康作為菌藥復配因子。

2. 3 根康和咪鮮胺與Czk1復配劑對RC178的毒力測定結果

2. 3. 1 單劑Czk1對RC178的毒力測定 由表4可知，隨著Czk1菌落數量的增加，Czk1對RC178的生長抑制效果越明顯，Czk1菌落數量在1.00×109 CFU/mL時對RC178的抑制率達60.25%，而菌落數量稀釋至1.00×104 CFU/mL時其抑制率只有11.89%。通過毒力回歸方程測定Czk1菌液對RC178的EC50為4.75×107 CFU/mL。

2. 3. 2 復配劑對橡膠炭疽病菌的聯合毒力測定

根據以上試驗結果，將濃度為0.0778 μg/mL的咪鮮胺與濃度為4.75×107 CFU/mL的Czk1發酵液按不同體積比進行復配，聯合毒力測定結果見表5。Czk1與咪鮮胺以體積比1∶9、5∶5、6∶4、7∶3和8∶2復配時對RC178的抑制效果有明顯增效作用，實際抑菌效果分別為56.54%、75.39%、65.97%、65.45%和81.15%，對應的IR為1.35、1.64、1.40、1.36和1.65;其中復配比例為8∶2時的IR最大，增效作用最強，防效最好，因此選取Czk1∶咪鮮胺=8∶2作為最佳復配比。

將濃度為4.75×107 CFU/mL的Czk1發酵液與濃度為0.4733μg/mL的根康以不同體積比進行復配，Czk1與根康體積比分別為4∶6、5∶5、6∶4、7∶3和8∶2時對RC178的抑制效果具有明顯增效作用，實際抑菌效果分別為74.78%、76.37%、82.54%、88.32%和80.60%，對應的IR分別為1.26、1.25、1.31、1.36和1.21;其中復配比例為7∶3時的IR最大，增效作用最強，防效最好，因此選取Czk1∶根康=7∶3為最佳復配比。

3 討論

膠孢炭疽菌可通過風雨、昆蟲等媒介傳播，從植株傷口、氣孔和表皮等途徑入侵，一旦感病暴發流行不易控制，嚴重影響橡膠的產量和質量（孟祥春等，2018）。現階段防治橡膠炭疽病仍以化學防治為主，但化學防治藥劑品種較單一，長期施用同一殺菌劑易使病菌產生抗藥性。羅大全等（2003）、曹學仁等（2015）對海南墾區橡膠炭疽病菌對多菌靈抗性室內測定結果表明，長期施用多菌靈的農場炭疽菌對多菌靈的敏感性明顯降低，產生一定抗藥性。林春花等（2017）測定了我國2種橡膠樹炭疽病菌對咪鮮胺的敏感性，發現我國4個植膠區2種類型橡膠炭疽病菌對咪鮮胺的敏感性無明顯差異，對橡膠炭疽病菌抑菌效果較好，可作為生產上的防治藥劑。本研究通過6種常見化學殺菌劑對橡膠炭疽病菌的毒力測定表明，內吸式殺菌劑咪鮮胺對RC178的抑菌效果最好，廣譜性殺菌劑百菌清次之，三唑類殺菌劑根康對RC178的抑菌效果也較好。這與生產中主要采用咪鮮胺和百菌清等藥劑防治橡膠炭疽病害結果一致（Guyot et al.，2001）。

本研究通過化學殺菌劑與Czk1的相容性測定，發現嘧霉胺、嘧菌酯、丙環唑、根康和咪鮮胺與生防菌Czk1的相容性均較好，其中咪鮮胺在較高化學濃度下仍能使Czk1正常生長，對其無明顯抑制;同時發現中高濃度的根康不僅未抑制Czk1生長，還會促進Czk1菌落數量的增長。根康對橡膠紅根病和褐根病的防治效果顯著，田間平均防效可達78%以上（賀春萍，2016），選用根康與枯草芽孢桿菌進行復配，篩選出最佳復配組合，有望獲得兼治橡膠根病和炭疽病等多種病害復配劑組合，起到一藥多效的作用。本研究通過室內毒力測定及相容性測定，最終選用咪鮮胺和根康分別與Czk1混配。唐文（2016）進行枯草芽孢桿菌對橡膠樹體內的定殖及防病促生機理研究，結果表明，Czk1不僅能誘導橡膠樹產生系統抗性防治橡膠炭疽病害，還對橡膠生長具有促進作用。本研究發現，Czk1菌落數量在1.00×109 CFU/mL時對RC178的抑制率達60.25%，表明Czk1與咪鮮胺、根康具有開發成菌藥制劑的潛力。

本研究結果突破防治橡膠樹炭疽病以化學藥劑為主要防治手段的局限性，采用生物與化學協同防治新策略，在提高防效的同時有效減少了化學農藥使用量，不僅能發揮化學殺菌劑抑菌效果快、防治效果穩定的優勢，還彌補了微生物在生防防治過程中存在易受環境影響、抗菌譜窄、防效緩慢等不足，從而延緩病原菌對化學殺菌劑的抗藥性，提高生防菌抑菌效果的穩定性（陳志誼等，2002;邱雪迎等，2019）。化學藥劑能降低習居微生物（包括病原菌）對生防微生物的排斥作用，使其能順利定殖、生長，并逐步發展成優勢種群微生物，更好地發揮生物防治的作用（劉曉妹等，2013;Ogbebor et al.，2015）。通過菌藥復配協同作用達到菌藥優勢互補、化學農藥用量減少、田間防效增加的目的，實現對多種病害的兼治作用與持續效果，具有廣闊的推廣應用前景（畢秋艷等，2018）。由于本研究僅針對室內復配研究，室外環境因子如溫度、濕度和光照對RC178的孢子定殖、生長以及對枯草芽孢桿菌在植株上的定殖、生長影響明顯，因此，需進一步對盆栽和大田試驗進行防效驗證，以便更好地為復配劑的使用提供科學依據。

4 結論

枯草芽孢桿菌Czk1與咪鮮胺和根康具有較好的相容性，Czk1發酵液分別與咪鮮胺和根康按體積比8∶2和7∶3進行復配時對橡膠炭疽病菌RC178的抑菌效果最佳，混劑的防治效果明顯優于單劑Czk1、根康和咪鮮胺，增效作用明顯，具有開發成菌藥制劑的潛力。

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（責任編輯 麻小燕）