骶神經根磁刺激對神經源性膀胱大鼠膀胱尿流動力學及M3受體表達的影響

王彥彬 李瑞鵬 樓揚鋒 楊龍飛 季澤益 宋晨

中樞神經系統或周圍神經系統損傷導致的膀胱功能障礙稱為神經源性膀胱[1]，臨床表現為膀胱高壓、尿失禁、反復尿流感染、腎積水、尿毒癥等，治療相當棘手，是迄今尚未解決的醫學難題。近年來，隨著神經泌尿領域的快速發展，骶神經根磁刺激技術作為一種非侵入性、無創的神經刺激系統的新技術，顯示出良好的應用前景。本實驗通過制備大鼠神經源性膀胱模型，觀察骶神經根磁刺激對脊髓損傷后膀胱尿流動力學及膀胱逼尿肌組織中M3受體表達的影響，探討潛在的機制，以期為解決臨床難題提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雌性成年SD大鼠60只，購自上海斯萊克[合格證號：SCXK（滬）：2017-004]。

1.2 動物分組與處理 按隨機數字表法將60只大鼠分為3組：正常組、模型組、磁刺激組，每組20只。除正常組（不作任何處理）外，其余兩組采用脊髓橫斷切除法建立神經源性膀胱動物模型[2]：大鼠腹部皮下注射2%戊巴比妥鈉作麻醉處理，四肢外展固定于實驗木板上，剃毛，常規消毒。依次切開大鼠背部皮膚及皮下組織，沿棘突縱行劈開大鼠雙側豎棘肌，在T9節段切除脊髓組織，清除損傷腔內殘留的淤血及神經組織，后逐層縫合傷口，消毒，模型構建完畢。每只大鼠單籠飼養，初期采用腹部按壓方式輔助排尿。磁刺激組大鼠造模成功1 d后給予第1次骶神經根磁刺激治療：使用武漢依瑞德公司生產的磁刺激儀，將圓型線圈放置在大鼠骶骨處，磁刺激儀連接電源，頻率設置為0.5 Hz，以大鼠骶部和（或）尾部顫動而不致全身顫動的表現為宜，給予1次/d，每次30個刺激沖動，每個刺激沖動間隔2 min，連續治療8周。模型組將圓型線圈放置在大鼠骶骨處，但不連接電源，不進行磁刺激。3組大鼠均常規飼養。在建模及治療期間，模型組死亡4只，磁刺激組死亡5只，最終正常組、模型組、磁刺激組分別有20、16、15只大鼠完成實驗。治療結束后，麻醉大鼠行膀胱尿流動力學測定，處死大鼠取膀胱逼尿肌組織行HE染色和超微結構觀察，同時檢測膀胱逼尿肌組織中M3受體表達水平。

1.3 膀胱尿流動力學測定 乙醚麻醉大鼠，插入F2測壓導管至膀胱，與尿動力學測壓管連接，調零后用微量灌注泵以2 ml/h速率灌注0.9%氯化鈉溶液[3]。記錄膀胱最大容量、膀胱漏尿點壓力、膀胱順應性等尿流動力學參數。其中膀胱最大容量為當出現尿道口連續漏尿時膀胱的總灌注量；膀胱順應性=灌注量/漏尿點壓力。

1.4 膀胱逼尿肌組織學觀察 采用HE染色法。切取大鼠膀胱全層組織，10%甲醛固定、石蠟包埋、切片，置于68℃烤箱烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇（濃度從高到低）脫水，流水沖洗數分鐘，蘇木素染色0.5 h，流水返藍數分鐘，伊紅染色5 s，梯度乙醇（濃度從低到高）脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，在光鏡下觀察。

1.5 膀胱逼尿肌超微結構觀察 取大鼠膀胱逼尿肌組織（約1 mm×1 mm×1 mm），置于4%戊二醛溶液低溫固定、石蠟包埋、預切片（厚4～6 mm），鋨酸染色定位后進行超薄切片（厚0.1 μm），在透射電鏡下觀察。

1.6 膀胱逼尿肌組織中M3受體表達水平檢測 采用免疫組化SP法（免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司）。取大鼠膀胱逼尿肌組織，石蠟包埋、切片、脫蠟、梯度乙醇水化，3% H2O2、37℃孵育，PBS沖洗，枸櫞酸鈉高溫高壓抗原修復3 min后自然冷卻；山羊血清封閉10 min后，傾去血清，滴加一抗（兔抗M3R受體）室溫孵育1 h，陰性對照用PBS代替一抗，PBS洗滌5 min×3次，滴加兔型二抗，室溫孵育0.5 h，PBS沖洗5 min×3次，行DAB顯色，在光鏡下觀察，細胞質呈棕黃色為陽性表達。使用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統，利用Image pro-plus 6.0軟件計算平均吸光度（A值），即大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體表達水平。

1.7 統計學處理 采用SAS 8.0統計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠膀胱尿流動力學參數比較 3組大鼠膀胱最大容量、漏尿點壓力、膀胱順應性等尿流動力學參數比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中磁刺激組膀胱最大容量、膀胱順應性均高于模型組（均P＜0.05），漏尿點壓力低于模型組（P＜0.05）；而磁刺激組與正常組上述3個參數比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 1。

表1 3組大鼠膀胱尿流動力學參數比較

2.2 3組大鼠膀胱逼尿肌HE染色結果觀察 正常組大鼠膀胱逼尿肌纖維排列整齊，細胞未見明顯增大，未見炎細胞浸潤，見圖 1a（插頁）；模型組大鼠膀胱壁結構不清，未見黏膜上皮，壁內大部分區域高度充血、出血，水腫，且壁內有少量壞死的肌纖維平行排列，并有輕度炎細胞浸潤，見圖1b（插頁）；磁刺激組大鼠膀胱黏膜上皮細胞形態及排列接近正常組，局部細胞排列紊亂，肌層水腫，有輕度單個核炎細胞浸潤，漿膜面增厚，漿膜下組織中度充血、水腫，有輕度單核巨噬細胞浸潤，并有少量成纖維細胞增生，見圖1c（插頁）。

2.3 3組大鼠膀胱逼尿肌超微結構比較 正常組大鼠膀胱逼尿肌細胞結構正常，細胞間隙較窄，細胞器結構完整，見圖2a；模型組大鼠膀胱逼尿肌細胞大小不一致，細胞間隙變寬，分布錯亂，部分細胞線粒體腫脹破裂且呈空泡狀，細胞連接纖維化、排列紊亂，見圖2b；磁刺激組大鼠膀胱逼尿肌細胞表面平滑，細胞間隙稍寬，排列尚均勻，胞質內線粒體結構較完整，無腫脹破裂現象，見圖2c。

2.4 3組大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體表達水平比較 3組大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中磁刺激組明顯高于正常組、模型組（均P＜0.05）；模型組與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2和圖3（插頁）。

圖1 3組大鼠膀胱逼尿肌組織學觀察所見（a：正常組；b：模型組；c：磁刺激組；HE染色，×400）

圖2 3組大鼠膀胱逼尿肌超微結構比較（a：正常組；b：模型組；c：磁刺激組；×10 000）

圖3 3組大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體陽性表達檢測所見（a：正常組；b：模型組；c：磁刺激組；免疫組化SP法，×400）

3 討論

中樞神經系統或周圍神經系統損傷導致的膀胱功能障礙稱為神經源性膀胱[1]，這類疾病在脊髓損傷患者中較為多見[4]，常見的臨床表現有尿頻、排尿費力、尿失禁、反復尿路感染等，嚴重者可出現腎積水、腎功能衰竭。因此，盡早干預治療十分重要。目前臨床上采取的治療方法主要有留置尿管、藥物治療、手術治療、骶神經調控等[5]，但各自都有一些弊端。比如留置尿管或自我清潔導尿需要患者自行操作，若操作不當，極易引發下尿路感染；而藥物治療作用進展緩慢或效果欠佳；手術治療后需要長期帶管生活，對患者造成極大不便。骶神經調控是一種微創可逆的治療方法[6]，能取得一定的治療效果，但也存在有創治療、設備昂貴、易引發感染、病情反復等問題，因此限制了其大規模開展。

骶神經根磁刺激是一種電療法。證據表明，它具有與骶神經電刺激相同的影響，可產生類似的電場，但磁刺激的阻抗更小，衰減更少[7-8]。另有研究表明，骶神經根磁刺激既能促進與抑制排尿相關物質的釋放，也能起到改善膀胱排尿功能的作用[9-10]。本實驗結果也發現，磁刺激組大鼠膀胱最大容量、膀胱順應性均高于模型組，膀胱漏尿點壓力低于模型組。M3受體存在于膀胱逼尿肌細胞膜上，介導逼尿肌細胞收縮[11]。有學者在大鼠去神經損傷模型中，發現M3受體表達水平明顯升高，可能與大鼠去神經損傷后乙酰膽堿遞質減少，逼尿肌收縮力下降，M3受體代償性上調以維持逼尿肌收縮功能有關[12-13]。在本實驗中，磁刺激組HE染色可見漿膜下組織中度充血、水腫，有輕度單核巨噬細胞浸潤，并有少量成纖維細胞增生，但黏膜上皮細胞形態及排列較模型組接近正常；在透射電鏡下可見逼尿肌細胞表面平滑，細胞間隙稍寬，排列尚均勻，胞質內線粒體結構較完整；而免疫組化結果顯示膀胱逼尿肌組織中M3受體表達水平較正常組和模型組明顯升高。

表2 3組大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體表達水平比較

綜上所述，骶神經根磁刺激對神經源性膀胱大鼠的膀胱功能有一定的改善作用，可能與膀胱逼尿肌組織中M3受體表達升高有關，其具體作用機制有待進一步探討。