miR-124通過hClock調控人結直腸癌進展的機制研究

楊沔 沈迎春 賀海斌 錢海龍 俞仲輝 江州華 裘豐

生物節律的破壞是導致人類結直腸癌（colorectal cancer，CRC）發生、發展的內源性因素之一[1-3]。盡管哺乳類動物的晝夜節律已被廣泛研究，但多數研究只是基于轉錄水平的負性調控及轉錄后水平的修飾[4]。近年來，有學者致力于微小RNA（microRNA，miRNA）的研究。miRNA幾乎可以調控整個細胞代謝進程，如細胞增殖、凋亡等[5-7]。miR-124作為腫瘤抑癌基因，通過一些特殊靶點（如STAT3、SMC4、iASPP等）發揮CRC抑制作用也常被報道[8-11]。但是，miR-124與生物鐘基因hClock之間是否存在調控作用尚未清楚。本研究就miR-124通過hClock調控人CRC進展的機制作一探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年12月至2016年12月在寧波市醫療中心李惠利醫院東部院區行CRC根治術的50例患者為研究對象，所有患者術后病理檢查證實為CRC，術前均未行放化療。其中男28例，女22例；年齡35～82（56.3±13.8）歲。術中將患者的癌組織標本立即投入液氮中暫存，術后放入-80℃冰箱保存待檢。

1.2 hClock蛋白表達檢測 采用免疫組化染色法。取癌組織標本，甲醛固定、石蠟包埋、切片（4 μm 厚）；脫蠟、切片、水化、枸櫞酸緩沖液（0.01 M，pH 6.0）10 min微波抗原修復；單克隆抗體 hClock（cat#5157，1:100 dilution，美國Cell signaling Technology公司）4℃孵育過夜。PBS簡單清洗后，加二抗（#A31460，1:500 dilution，美國Thermo Fisher公司）37°C孵育60 min。PBS再次清洗，DAB顯色試劑盒染色5～10 min，常規蘇木素復染細胞核1 min，在光學顯微鏡（×400）下觀察細胞染色情況。由2位病理科醫生獨立評估染色強度（無著色為0分，弱著色為1分，中度著色為2分，強著色為3分）及染色細胞百分比，計算免疫組化評分。免疫組化評分=染色強度評分×染色細胞百分比，≥1.5分為hClock蛋白高表達，＜1.5分為hClock蛋白低表達。

1.3 miR-124表達檢測 采用qPCR法。（1）RNA抽提及逆轉錄：用Trizol試劑提取CRC組織樣本中的總RNA，分光光度計檢測總RNA含量。總RNA通過特異的miRNA逆轉錄試劑盒及miR-124莖環結構逆轉錄引物進行逆轉錄。引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCATTC-3'。（2）PCR反應：加入SYBR-green的成熟miR-124的PCR擴增反應體系，在PCR儀（Corbett，美國Bio-Rad公司）上進行反應，反應體系包括 cDNA 4 μl、10 mmol/L引物4 μl（上、下游引物各2 μl）、PCR Master Mix 10 μl、水2μl，最終配成20 μl反應體系。反應參數：95℃5 min；95℃5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 s，40個循環。qPCR 引物序列：正義為 5'-GCTAAGGCACGCGGTG-3'，反義為 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。根據每例患者癌組織與癌旁正常組織miR-124相對表達量的比值不同分為兩組，即miR-124低表達組（比值＜2）和miR-124高表達組（比值≥2）[12-13]。

1.4 miR-124生物信息學靶點預測 采用雙熒光素酶報告實驗。使用3種靶點預測軟件TargetScan（http://www.targetscan.org）、PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/cgibin/new_vertebrare.org）、miRNA.org（http://www.microrna.org）對miRNA在hClock 3'-非翻譯區上的靶點進行預測。將野生型或突變型的hClock 3'-非翻譯區基因克隆到雙熒光素酶報告基因中，進一步驗證hClock是否為miR-124的直接調控靶點。

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。CRC患者癌組織miR-124表達與hClock蛋白表達的相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床特征CRC患者癌組織hClock蛋白高表達率比較 CRC患者癌組織hClock蛋白高表達率為52.0%（26/50）。不同TNM分期及有無淋巴結轉移患者癌組織hClock蛋白高表達率比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；不同性別、年齡及腫瘤位置、組織學分級、浸潤深度的患者癌組織hClock蛋白高表達率比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 不同臨床特征CRC患者癌組織miR-124低表達率比較 CRC患者癌組織miR-124低表達率為68.0%（34/50）。有無淋巴結轉移患者癌組織miR-124低表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同性別、年齡及腫瘤位置、組織學分級、浸潤深度、TNM分期的患者癌組織miR-124低表達率比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 2。

2.3 CRC患者癌組織miR-124表達與hClock蛋白表達的關系 CRC患者癌組織miR-124低表達34例，高表達16例。miR-124高表達組hClock蛋白表達的免疫組化評分為（1.13±0.61）分，明顯低于miR-124低表達組的（1.71±0.54）分，差異有統計學意義（t=2.67，P＜0.05），免疫組化染色結果見圖1。CRC患者癌組織miR-124相對表達量與hClock蛋白表達的免疫組化評分呈負相關（r=-0.798，P＜0.01）。

表1 不同臨床特征CRC患者癌組織hClock蛋白高表達率比較[例（%）]

圖1 miR-124高、低表達組結直腸癌（CRC）患者癌組織中hClock蛋白表達情況（a：miR-124高表達組；b：miR-124低表達組；免疫組化染色，×400）

2.4 miR-124生物信息學靶點預測 3種常用的靶點預測信息軟件（TargetScan、PicTar、miRNA.org）都預測到miR-124-3p可能與hClock 3'-非翻譯區相結合；經雙熒光素酶報告實驗驗證，推測hClock可能是miR-124的直接調控靶點，見圖2。

3 討論

當前，雖然CRC的治療策略有了較大的進步，但是患者預后仍較差。對CRC發生、發展的分子機制進行深入研究，可能對進一步完善治療策略具有重要價值[14-15]。生物鐘基因調控的晝夜節律紊亂可能是CRC發生、發展的內源性因素之一。但是作為核心生物鐘基因的hClock在CRC發生、發展中的具體調節機制尚未完全清楚。

表2 不同臨床特征CRC患者癌組織miR-124低表達率比較[例（%）]

本研究通過生物信息學對調節hClock的miRNA進行預測，發現miR-124直接與hClock 3'-非翻譯區相結合。相關研究表明，miR-124在CRC中表達下調，然后通過結合一些特異基因發揮抑癌基因作用；而miR-124表達下調可能與上游啟動子甲基化有關[14]。筆者推測在CRC中，miR-124啟動子甲基化可能是決定其表達下調而hClock表達上調的原因之一。為搞清楚這個問題，本研究對人CRC組織中miR-124及hClock表達進行了檢測，結果顯示不同TNM分期及有無淋巴結轉移患者癌組織中hClock蛋白高表達率比較，以及有無淋巴結轉移患者癌組織中miR-124低表達率比較，差異均有統計學意義；miR-124高表達組hClock蛋白表達的免疫組化評分明顯低于miR-124低表達組，CRC患者癌組織中miR-124相對表達量與hClock蛋白表達的免疫組化評分呈負相關。然后使用3種常用的靶點預測信息軟件，發現都能預測到hClock是miR-124的直接調控靶點。因此，筆者認為hClock是miR-124的直接調控靶點，miR-124通過與hClock 3'-非翻譯區結合，在轉錄后水平對hClock表達進行調節。

圖2 miR-124生物信息學靶點預測（a：在不同物種間，miR-124與hClock的3'-非翻譯區結合的靶序列是段保守序列；b：雙熒光素酶報告實驗）

綜上所述，miR-124通過調控hClock促進人CRC的進展；miR-124表達下調可能是促進人CRC進展的原因之一。本實驗結果為hClock的促癌作用及miR-124的抑癌作用提供了一定的證據，而在CRC細胞中hClock是否為miR-124的直接調控靶點，有待進一步實驗證實。