一種太子參環肽單體的分離制備及結構表征

賀瀟宇 趙立 魏丹 蔣靜怡 龐文生 胡娟

【摘 要】 目的：建立一種太子參環肽單體的分離制備方法。方法：采用硅膠柱層析分離制備太子參環肽粗分物，經制備級高效液相色譜（HPLC）純化，使用質譜（MS）、核磁共振波譜（NMR）及二維核磁共振波譜對其結構進行表征。結果：通過質譜、核磁共振波譜法確定了所得環肽為太子參環肽Pseudostellaria A（PA）。結論：建立一種太子參環肽PA的分離制備方法，提取率為32.5 μg/g，純度為95.16%。

【關鍵詞】 太子參;環肽;核磁共振波譜法;質譜法;柱層析

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）21-0047-06

Isolation，Preparation and Structural Characterization of a kind of Pseudostellaria heterophylla Cyclic Eeptide Monomer

HE Xiaoyu1 ZHAO Li1 WEI Dan1 JIANG Jingyi1 PANG Wensheng1 HU Juan1，2*

1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China;

2.The Second Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China

Abstract：Objective To establish a method for the separation and preparation of Pseudostellaria heterophylla cyclic peptide monomer.Methods The crude cyclic peptide of Pseudostellaria heterophylla was separated and prepared by silica gel column chromatography，purified by preparative High Performance Liquid Chromatography（HPLC），and its structure was characterized by Mass spectrometry （MS），Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy （NMR） and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy.Results The obtained cyclic peptide was determined to be Pseudostellaria A （PA） by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy.Conclusion A method for the separation and preparation of Pseudostellaria heterophylla cyclic peptide PA has been established，the extraction rate is 32.5 μg/g，and the purity is 95.16%.

Keywords：Pseudostellaria heterophylla; Cyclic Peptide; Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; Mass Spectrometry; Column Chromatography

環肽（Cyclic Peptide）是指氨基酸以肽鍵的形式連接形成的環狀化合物[1]。研究結果表明環肽類化合物僅存在于一些高等植物體內存在，這些環肽結構新奇多樣，骨架中除了肽鍵外還有酯鍵、醚鍵、二硫鍵等，很多環肽具有良好的生物活性，如抗菌、抗腫瘤和免疫抑制等活性[2]。環肽能夠形成穩定的限制性空間構象，而且其在生物體內抗降解的能力也強于線性多肽。奇特的結構和豐富的活性使天然活性環肽成為化學家和藥學家研究的熱點。

太子參，系石竹科孩兒參Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根[3]，其含有多種生物活性成分，如多糖類、環肽類、微量元素、皂苷類、揮發油類、油脂類、氨基酸類、脂肪酸類等[4]。目前已報道的太子參環肽有16種，有環八肽、環七肽、環五肽等數種大小不同的環肽[5]。本課題組建立了一種太子參環肽提取物（CPE）的制備方法，并且研究了環肽提取物抗慢性阻塞性肺病（COPD），結果表明CPE給藥組大鼠肺氣道阻力急劇下降，動態肺順應性升高。肺組織切片圖像分析顯示，CPE可減輕肺泡破壞程度，減輕肺組織炎癥，增加肺泡間隙，改善COPD大鼠肺通氣功能，這可能與其抑制TLR4-MyD88-JNK/p38通路異常激活有關[6-7]。李軍等[8]

發現太子參環肽HB具有酪氨酸酶抑制活性，可以用于色素沉積引起的皮膚病。

本實驗利用柱層析、制備級高效液相色譜等技術，分離純化得到一種太子參環肽單體，并對其結構進行表征，確定了該環肽的化學結構，為太子參環肽單體的分離制備提供了一種方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備 Shimazu LC-8A 型制備液相色譜儀（日本島津公司）;KQ-500DV型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）;Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）;600Y型多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）;AE240s型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;DW-86L728J超低溫冰箱（青島海爾集團）;MODULYOD-230真空冷凍干燥機（美國Thermo公司）;R-100型旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI公司）;GZY-P2D-W型超純水機（湖南科爾頓水務有限公司）;Bruker Esquire 2000 MS（德國布魯克公司）;Bruker AV400 NMR（德國布魯克公司）。玻璃器皿均購于天津玻璃儀器廠。

1.2 實驗材料 太子參[Pseudostellaria heterophylla（Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.]，購于福建柘榮。甲醇（色譜純，德國默克公司），無水乙醇（AR，西隴化工股份有限公司）、乙酸乙酯（AR，西隴化工股份有限公司）、石油醚（AR，西隴化工股份有限公司）、環己烷（AR，西隴化工股份有限公司）、硅膠（100～200目，北京索萊寶科技有限公司）、硅膠（200～300目，北京索萊寶科技有限公司）、實驗用水為電阻率為18.2 MΩ的超純水。

2 方法與結果

2.1 太子參環肽的柱層析分離 稱取干燥太子參200 g（粉碎過3號篩），按料液比1∶8加入85%乙醇回流提取2 h，減壓濃縮得乙醇浸膏。乙醇浸膏加水溶解，按體積比1∶1加入石油醚萃取3次，棄去水層，合并石油醚層。減壓濃縮，濃縮液置于超低溫冰箱-80 ℃預凍2 h，冷凍干燥;得石油醚萃取部位。

取石油醚萃取部位100 g，等量硅膠拌樣后，600 g 硅膠（100～200目）裝柱，濕法上樣，以石油醚、乙酸乙酯（體積比50∶1→1∶1）系統進行梯度洗脫，每個梯度至少洗5個柱體積，每300 mL為一個餾分，經薄層色譜法定性檢驗，收集可能為環肽的餾分。得粗分片段，減壓濃縮，濃縮液置于超低溫冰箱-80 ℃預凍2 h，冷凍干燥，得粗分物粉末。

取粗分物35 g，50 g硅膠拌樣，300 g硅膠（200～300目）裝柱，經環己烷、乙酸乙酯（體積比100∶0→20∶1→10∶0→8∶1→5∶1）系統進行梯度洗脫，每個梯度至少洗5個柱體積，每300 mL為一個餾分，經薄層色譜法定性檢驗，收集可能為環肽的餾分。

2.2 太子參環肽單體的純化 所得餾分采用制備級HPLC純化。色譜柱為SinoChrom ODS-BP Cl8（250mm×10 mm，5 μm）;流速5 mL/min;柱溫為25 ℃;進樣量1 mL。已甲醇（A）：水（B）=65∶35為流動相;檢測波長203 nm。收集環肽單體峰，減壓濃縮，濃縮液置于超低溫冰箱-80 ℃預凍2 h，冷凍干燥，得到淡黃色粉末。

所收集環肽組分峰HPLC測定純度。采用大連依利特Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱;流速1mL/min;柱溫25 ℃;進樣量20 μL;以乙腈（A）：水（B）=10∶90為流動相，檢測波長203 nm。

2.3 太子參環肽結構表征

2.3.1 MS結構表征 Bruker Esquire 2000 質譜儀進樣條件：離子源：ESI;離子模式：陽離子模式;正負離子切換：關閉;掃描模式：標準/正常;質量范圍50～2200 m/z;毛細出口電壓：116.7 V;透鏡：40.8 V;阱驅動參數：30.1;采集時間：2992 μs。

2.3.2 NMR結構表征 取所得淡環肽10 mg，溶于0.6 mL氘代DMSO中，轉移至直徑為5 mm的核磁管中，使用四甲基硅烷（TMS）作為內標，恒溫25 ℃，由Bruker AV400 NMR測定其1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY及HMBC譜圖。

2.4 結果

2.4.1 太子參環肽HPLC純度測定 所得太子參環肽單體純度按照面積歸一化法測定為95.16%，HPLC色譜圖如圖1所示，峰面積見表1。

2.4.2 MS譜圖及結構解析 由圖2A可知，正離子模式的分子離子峰為m/z=502.2的[M+H]+峰; m/z=524.2的[M+Na]+峰;由圖2 B可知，負離子模式下的分子離子峰為m/z=500的[M-H]-提示該環肽分子量為501.26。且正離子模式下有m/z=540.1的[M+K]+峰;m/z=474.3的[M-CO]+峰，分子量為單數，提示化合物含有奇數氮原子。表2為環肽正負離子模式下的離子峰質荷比。

2.4.3 NMR譜圖及結構解析 由表3可知，1H-NMR、13C-NMR譜圖中C原子、H原子的化學位值，并給出了基于HMBC、1H-1H COSY的C-H，H-H耦合關系。

由圖3A1H-NMR （400MHz，in DMSO）可知：高場區δ 1.25、0.77、0.95為3個甲基氫;低場區δ 8.50、7.95、7.85、7.23為氨基氫信號;δ6.63、6.93兩組氫信號，為同一個苯環上的4個氫信號。由圖3 B 13C-NMR （400MHz，in DMSO）：該化合物含有25個碳原子，低場區有5個羰基碳信號，還有1個芳香連氧碳信號，5個芳香碳信號，且氫譜數據中有對稱的芳香氫信號，提示此化合物連有1個4-羥基苯。

由圖4 A 1H-1H COSY譜圖可以判斷出質子間的2鍵、3鍵耦合關系;由圖4 B HMBC譜圖可以判斷出碳原子與質子的2鍵、3鍵耦合關系，綜合二維譜圖推測出環肽可能含有的片段如圖5所示。

綜合以上NMR譜圖并結合MS信息確定環肽化學結構，其分子式為C25H35N5O6，并給按照表2中的原子編號順序給出了NMR信號歸屬，如圖6所示。

3 討論

實驗前期對太子參的提取條件進行了考察，以指紋圖譜作為評價指標，確定了以85%乙醇作為提取溶劑，料液比（g/mL）為1∶8，回流提取2 h。柱層析采用濕法裝柱，先在層析柱中加入少量洗脫劑，然后將洗脫劑浸泡的硅膠攪拌成勻漿后倒入層析柱中，用玻璃棒輕輕敲打柱兩側，待硅膠層沉積后，加壓，趕走柱內殘留的小氣泡，最后用真空泵將填料抽實。

太子參環肽作為太子參的特色活性成分，具有多種藥理活性，但由于含量較低，分離制備具有一定的難度，限制了太子參環肽的應用。目前，已經有較多的研究人員從指紋圖譜的角度對太子參環肽進行了研究，但這些研究的重點均在于應用GC-MS、LC-MS對指紋圖譜中的色譜峰進行鑒定。并沒有解決目前太子參環肽單體分離制備方法不足的問題。

4 結論

通過柱層析技術分離獲得環肽粗分物，經制備級HPLC純化獲得環肽單體，對其進行MS、NMR結構表征，并結合參考文獻[9-10]確定其為環肽化合物Pseudostellarin A （PA）。2 kg太子參藥材提取得環肽PA約65 mg，提取率（PA/藥材）為32.5 μg/g，所得環肽PA純度為95.16%。

本實驗建立了一種太子參環肽PA的分離純化方法，通過柱層析初步分離獲得環肽粗分物，再經過制備級HPLC純化獲得純度較高的PA單體，并運用現代波譜分析技術確定了環肽的化學結構，為后續太子參環肽PA藥理活性研究提供了一定的基礎。

參考文獻

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（收稿日期：2020-09-01 編輯：程鵬飛）

基金項目：國家自然科學基金項目（81673575）;國家重點研發計劃“中醫藥現代化研究”重點專項（2019YFC1710504）。

作者簡介：賀瀟宇（1996-），男，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為天然藥物化學活性成分研究。E-mail：975019071@qq.com

通信作者：胡娟（1962-），女，土家族，碩士，教授，研究方向為中藥活性成分與質量標準研究。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn