牛肉酶解工藝優(yōu)化及其氨基酸組成分析

劉斯汝 羅龍龍 任衛(wèi)合 丁功濤 謝雕雕 冶文博 陳士恩 Sharizah ALIMAT

摘 要：采用牛肉屠宰加工中廢棄碎肉渣制成的凍干肉粉為原材料，以蛋白酶解度為評價指標(biāo)，探究堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合酶最佳酶解條件。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用5因素3水平正交試驗對酶解條件進行優(yōu)化，并測定最終酶解液中游離氨基酸的種類與含量。結(jié)果表明：最佳酶解工藝為酶添加量4%、堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比1∶5、酶解溫度50 ℃、pH 8.5、肉粉蛋白添加量5%、酶解時間8 h，在該條件下，牛肉蛋白水解度為（45.7±0.6）%;酶解液中氨基酸分為3 個含量區(qū)段，其中脯氨酸含量最高，為（256.20±18.65） mg/100 mL，甘氨酸含量最低，為（4.46±0.56） mg/100 mL。

關(guān)鍵詞：風(fēng)味蛋白酶;堿性蛋白酶;牛肉;氨基酸

Abstract： Beef trimmings as a waste from beef slaughter and processing were ground and freeze-dried before being hydrolyzed with combinations of alkaline protease and flavourzyme. Hydrolysis conditions were optimized using?one-factor-at-a-time method combined with a five-factor， three-level orthogonal array design based on degree of hydrolysis （DH）. The amino acid composition of the hydrolysate prepared using the optimized conditions was determined. The optimum hydrolysis conditions were found to be total enzyme amount of 4%， alkaline protease/flavourzyme ratio of?1：5 （m/m）， temperature of 50 ℃， pH of 8.5， substrate concentration of 5%， and time of 8 h. Experiments conducted under these conditions gave a DH of （45.7 ± 0.6）%. In the resulting hydrolysate， the contents of proline and glycine were the highest and lowest， （256.20 ± 18.65） and （4.46 ± 0.56） mg/100 mL， respectively.

Keywords： flavourzyme; alkaline protease; beef; amino acid

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200824-206

中圖分類號：TS201.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）11-0021-06

重豬肉、輕牛羊肉的肉品消費結(jié)構(gòu)一直是我國人民的消費現(xiàn)狀[1]，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，自2012年后我國牛肉的消費需求迅速上升，這其中主要以受到西餐文化影響的沿海發(fā)達地區(qū)為主，且城鎮(zhèn)明顯高于鄉(xiāng)村，截止到2017年，我國牛肉消費總量為794 萬t，位居世界第一[2]。目前我國肉牛生產(chǎn)養(yǎng)殖與初級屠宰加工地大多位于我國西部與北方地區(qū)，隨著牛肉供求矛盾的日益上升，加上當(dāng)?shù)亟?jīng)濟水平低下，使得肉牛屠宰加工規(guī)范的監(jiān)管力度嚴(yán)重不足，這導(dǎo)致牛肉在屠宰初加工中產(chǎn)生了大量副產(chǎn)品與廢棄物[3-4]。其中骨、血液、內(nèi)臟、油脂及碎肉殘渣等為主要副產(chǎn)品，對于這些副產(chǎn)品的處理，目前主要用于制備工業(yè)油、骨粉、肥料及燃料等，現(xiàn)有的研究對于此類副產(chǎn)品的處理多采用酶解法、化制法及微生物發(fā)酵法等[5]，其中酶解法是最為環(huán)保、安全、高效及高質(zhì)量的方法。由于不同酶切割位點不同，單一酶的酶解效果普遍較差，而復(fù)合酶可以使得不同酶切割位點相互補充，因此成為目前常用的酶解方法之一[6]。目前常用的酶制劑有風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶及木瓜蛋白酶等，木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶常用于植物的酶解及肉的嫩化工藝[7-8]，而Drenth等[9]發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶對蛋白胨的酶解效果較差。Pavan等[10]在菠蘿蛋白酶的研究中發(fā)現(xiàn)其對肌纖維蛋白原酶解效果較差。目前堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶是肉類酶解中常用的酶，堿性蛋白酶對肽鍵、酰胺鍵及酯鍵等均有良好的水解效果，而風(fēng)味蛋白酶具有改善酶解產(chǎn)品質(zhì)量、降低成本及提高水解度等優(yōu)點[11-12]。另外，以往研究牛肉酶解的工藝較為單一，酶解效率低下，時間成本高昂，因此提出利用堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合酶對牛肉的酶解工藝進行優(yōu)化，選出最優(yōu)酶解條件，并測定酶解液中氨基酸成分及含量，為牛肉副產(chǎn)品酶解產(chǎn)物在氨基酸有機肥及動物氨基酸飼料添加劑等方面的應(yīng)用提供參考，為屠宰副產(chǎn)物高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉屠宰加工廢棄副產(chǎn)品，即牛肉碎渣邊角料來自甘肅天祝縣華藏寺屠宰場的西門塔爾牛，以下簡稱牛肉副產(chǎn)品。

堿性蛋白酶（400 000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（200 000 U/g） 廣西龐博生物工程有限公司;甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、三氯乙酸、茚三酮（均為分析純） 武漢賽維爾有限責(zé)任公司蘭州分公司。

1.2 儀器與設(shè)備

0.45 μm、0.22 μm濾膜 天津津騰實驗設(shè)備有限公司;LGJ-20F真空冷凍干燥機 北京松源華興生物技術(shù)有限公司;JRJ-100絞肉機 瑞恒食品機械公司;XL-06A粉碎機 旭朗機械有限公司;J-HH-4A恒溫水浴鍋 上海勝衛(wèi)電子科技公司;Kjeltec8200凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器公司;Seven2Go酸度計 瑞士梅特勒-托利多集團;HT-1010全自動氨基酸分析儀 青島海泰億諾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

肉樣經(jīng)絞肉機攪碎后置于真空冷凍干燥機中-45 ℃冷凍干燥36 h后取出，凍干樣品用粉碎機粉碎后置于干燥的藍口瓶中，封口膜密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品蛋白質(zhì)含量測定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用凱氏定氮法測定。測得干燥后的肉粉中蛋白質(zhì)含量為73.6%。

1.3.3 蛋白水解度測定

參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》，采用甲醛滴定法測定。

1.3.4 單因素試驗

取500 mL錐形瓶，加入100 mL蒸餾水，加入凍干肉粉，根據(jù)凍干肉粉加入量及其蛋白質(zhì)含量計算得到肉粉蛋白添加量，加入不同比例的堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶（加入量為在凍干肉粉蛋白中占比），將酶解體系放入恒溫搖床定時反應(yīng)，每個實驗重復(fù)5 次。

以蛋白水解度為指標(biāo)，分別按酶添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、酶添加比例（堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、肉粉蛋白添加量（4%、5%、6%、7%、8%）、pH值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解時間（2、4、6、8、10 h）的順序?qū)Ω鱾€單因素對蛋白水解度的影響進行研究，且以堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比1∶1、肉粉蛋白添加量5%、pH值7.5、酶解溫度45 ℃、酶解時間6 h作為起始條件，前一因素單因素試驗中蛋白水解度最大值對應(yīng)的條件作為后一因素水平，依次類推。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以蛋白水解度為指標(biāo)，以酶解溫度、pH值、肉粉蛋白添加量、酶添加量、酶添加比例為考察指標(biāo)，設(shè)計L18（35）正交試驗，優(yōu)化酶解工藝，正交試驗因素水平見表1。

1.3.6 酶解液中氨基酸組成測定

按照最佳酶解條件酶解后，酶解液置于100 ℃水浴中滅活15 min，待酶解液冷卻，紗布粗濾后將樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，靜置20 min;向1 mL樣品中加入0.25 mL 37 g/100 mL三氯乙酸，混勻，4 ℃過夜（12 h）。過夜樣品8 000 r/min離心3 min后取上清液，0.22 μm過膜稀釋20 倍后，使用全自動氨基酸分析儀測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對單因素試驗結(jié)果進行Duncans新復(fù)極差法差異顯著性分析，正交試驗結(jié)果采用多因素方差分析進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 酶添加量對牛肉副產(chǎn)品蛋白水解度的影響

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，蛋白水解度不斷上升，在酶添加量為3%時達到最大，酶添加量增加至4%時，蛋白水解度略微下降但與酶添加量3%時差異不顯著，當(dāng)酶添加量增加至5%時，蛋白水解度出現(xiàn)顯著下降趨勢。由此可見，在底物充分的情況下，在一定范圍內(nèi)增加酶的用量反應(yīng)速率也會相應(yīng)增加，因此酶解效率得以顯著提升[13]。當(dāng)酶添加過量時，水解度出現(xiàn)下降趨勢，原因可能是過量的酶分子相互競爭，使其無法與底物分子的活性位點高效結(jié)合，導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率下降，單位時間內(nèi)的水解度降低[14]。綜合考慮選擇酶添加量2%～4%作為酶添加量優(yōu)化水平。

2.1.2 酶添加比例對牛肉副產(chǎn)品蛋白水解度的影響

由圖2可知，酶添加比例為1∶4時，蛋白水解度達到最大，且較其余各添加比例均存在顯著差異（P<0.05）。之后，隨著酶添加比例升高，蛋白水解度逐漸下降，這可能與堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶切位點不同有關(guān)[15]，堿性蛋白酶作為內(nèi)切酶，在水解過程中能切斷多肽內(nèi)部的肽鍵，形成短的肽鏈[16]，能更大程度將蛋白質(zhì)水解為大分子肽段，而風(fēng)味蛋白酶具有內(nèi)切酶與外切酶2 種活性，能更好地將大分子肽段分解為氨基酸和小分子多肽[17]，因此隨著風(fēng)味蛋白酶添加比例的增加，蛋白水解度有一定程度的下降。綜合考慮選擇酶添加比例1∶3～1∶5作為復(fù)合酶添加比例優(yōu)化范圍。

2.1.3 肉粉蛋白添加量對牛肉副產(chǎn)品蛋白水解度的影響

由圖3可知，當(dāng)肉粉蛋白添加量為6%時，蛋白水解度達到最大，之后隨著肉粉蛋白添加量的升高，蛋白水解度逐漸下降。這是由于在酶添加量保持不變條件下，一定范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速率與肉粉蛋白添加量呈正比，但是過量的底物會增大水解液的黏稠程度，導(dǎo)致蛋白酶在水解液中分布不均，蛋白酶分子與底物分子結(jié)合效率降低，從而抑制水解反應(yīng)的進行;過量的底物與酶分子結(jié)合，生成無活性的中間產(chǎn)物，也會影響酶的活性[18]。因此選擇肉粉蛋白添加量5%～7%作為優(yōu)化范圍。

2.1.4 pH值對牛肉副產(chǎn)品蛋白水解度的影響

酶在最適的pH值范圍表現(xiàn)出較好活性，過高或過低的pH值均會導(dǎo)致酶活性降低[19]。由圖4可知，pH值較低時，蛋白水解度隨著pH值升高不斷上升，在pH 8.0時達到峰值，之后隨著pH值升高蛋白水解度顯著下降（P<0.05），其原因可能為過高的pH值改變了酶分子與底物分子的帶電狀態(tài)，從而降低了酶與底物的結(jié)合效率，過低或過高的pH值都會影響酶的穩(wěn)定性，因此導(dǎo)致蛋白水解度逐漸下降。綜合考慮選擇pH 7.5～8.5作為pH值的優(yōu)化范圍。

2.1.5 酶解溫度對牛肉副產(chǎn)品蛋白水解度的影響

由圖5可知，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時，蛋白水解度達到最大，較其他各組均有顯著差異（P<0.05），而后隨著酶解溫度的升高，蛋白水解度逐漸下降，這是由于隨著酶解溫度升高，反應(yīng)物分子獲得能量，分子運動速率加快，使得有效碰撞次數(shù)增加，酶促反應(yīng)速率加快，但過高或過低的酶解溫度均會影響酶的活性，溫度過低不僅影響酶活力，還會使得酶與底物結(jié)合效率降低，抑制酶促反應(yīng)速率，溫度過高則會導(dǎo)致蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的破壞，從而影響酶解效果[20]，因此選擇酶解溫度45～55 ℃作為優(yōu)化水平。

2.1.6 酶解時間對牛肉副產(chǎn)品蛋白水解度的影響

由圖6可知，在8 h前，隨著酶解時間的延長，蛋白水解度逐漸升高，8 h后增加趨于平緩，且隨著酶解時間的延長，蛋白水解度無顯著增加，這可能是由于長時間的酶促反應(yīng)使得反應(yīng)體系中底物含量降低，從而導(dǎo)致酶分子與底物分子結(jié)合速率減慢，反應(yīng)速率下降，最終導(dǎo)致水解度增加趨勢平緩。另外，水解產(chǎn)物使得反應(yīng)體系的pH值逐漸下降，酶的活性也會受到一定程度的影響[21]。繼續(xù)延長反應(yīng)時間，反應(yīng)效果并不顯著，增加反應(yīng)時間還會增加成本。因此選擇8 h作為復(fù)合酶酶解時間。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以蛋白水解度作為指標(biāo)，選擇酶添加量、酶添加比例、肉粉蛋白添加量、酶解溫度、pH值為自變量，進行5因素3水平的正交試驗。

由表2～3可知，各因素對于酶解效果的影響程度為C>E>D>B>A，即酶解溫度>肉粉蛋白添加量>pH值>酶添加比例>酶添加量，酶解最佳工藝為A3B3C2D2E1，即酶添加量4%、酶添加比例1∶5、酶解溫度50 ℃、pH 8.5、肉粉蛋白添加量5%、酶解時間8 h。因素A，即酶添加量對酶解效果的影響極顯著（P<0.01），從而進一步說明酶添加量在反應(yīng)中的重要作用。

2.3 驗證實驗結(jié)果

依據(jù)正交試驗中得到的最佳酶解條件，進行3 次平行驗證實驗，結(jié)果表明，在最佳水解條件A3B3C2D3E1下得到蛋白水解度為（45.7±0.5）%，高于正交試驗中的最高值（43.8±0.8）%，表明本研究的酶解工藝具有較高的可行性。故確定復(fù)合酶對于牛肉蛋白質(zhì)的最佳酶解工藝為酶添加量4%、酶添加比例1∶5、酶解溫度50 ℃、pH 8.5、肉粉蛋白添加量5%、酶解時間8 h。

2.4 酶解液氨基酸組成測定結(jié)果

由圖7可知，最終測定牛肉酶解產(chǎn)物中氨基酸組成后發(fā)現(xiàn)，酶解液中含有20 種氨基酸，其分布可按照含量大致分為3 個區(qū)段，高含量區(qū)段為脯氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸及甲硫氨酸，其中脯氨酸含量最高，中含量區(qū)段為谷氨酰胺、丙氨酸、異亮氨酸及天冬氨酸，剩余均為低含量區(qū)段，其中甘氨酸與蘇氨酸含量最低。

3 討 論

研究表明，分子質(zhì)量較小的氨基酸及多肽能迅速被動植物吸收利用[22]，因此將動物屠宰廢棄物制成氨基酸肥料或飼料添加劑，可以使得屠宰加工廢棄物在種植、養(yǎng)殖行業(yè)實現(xiàn)高價值的回收利用，從而達到循環(huán)經(jīng)濟的目的。現(xiàn)如今氨基酸肥料及飼料添加劑領(lǐng)域大多以發(fā)酵產(chǎn)出及菌類產(chǎn)出為主，而使用動物肉制品酶解生產(chǎn)由于成本較高，幾乎沒有相關(guān)研究[23]，鑒于以往屠宰廢棄物焚燒、粉碎添加飼料等處理方式，酶解法具有高效、安全等傳統(tǒng)方法無可比擬的優(yōu)勢。關(guān)于氨基酸制劑對動植物的影響研究甚多，如陳偉等[24]對草莓的研究中發(fā)現(xiàn)，氨基酸肥能顯著提高草莓綠素含量，從而提高草莓產(chǎn)量，改善草莓果實品質(zhì)。張書強等[25]發(fā)現(xiàn)，多肽肥料具有提高農(nóng)作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提高抗逆性等作用。在動物研究方面，常銀蓮等[26]發(fā)現(xiàn)，增加飼料中支鏈氨基酸水平能夠促進肉雞腸道生長發(fā)育并加快損傷腸道的修復(fù)。另有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中氨基酸的合理添加能顯著提高育肥豬的生長性能，有效改善育肥豬機體的免疫能力并縮短育肥周期[27]。由此可見，動物屠宰副產(chǎn)品酶解產(chǎn)物在動植物肥料、飼料等應(yīng)用方面具有廣闊的前景。

脯氨酸是植物的四大必需氨基酸之一，對促進植物生長具有重要意義，由于哺乳動物可以自身合成脯氨酸，因此外源添加對于動物意義不大[28];賴氨酸對動物而言具有提高免疫力、減少應(yīng)激、緩解焦慮情緒等作用[29]，苯丙氨酸是合成神經(jīng)遞質(zhì)的重要氨基酸，甲硫氨酸具有保護肝臟、減少肝臟毒副作用、合成蛋白及減少動物應(yīng)激等作用[30-31]，高含量的甲硫氨酸可以有效減少酶解產(chǎn)物中丙氨酸及天冬氨酸的肝臟毒副作用[32]。由此可見，牛肉酶解產(chǎn)物適合在植物領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，而在動物飼料添加劑中更適合在動物運輸、外界應(yīng)激較強的情況下使用。

4 結(jié) 論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化屠宰加工中廢棄牛肉碎肉的復(fù)合酶酶解工藝，確定最佳酶解工藝為酶添加量4%、堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加比例1∶5、酶解溫度50 ℃、pH 8.5、肉粉蛋白添加量5%、酶解時間8 h，在此條件下，蛋白酶解度為（45.7±0.5）%，高于正交試驗中的最高值（43.8±0.8）%;酶解液中氨基酸種類豐富，酶解產(chǎn)物在氨基酸液體肥、動物飼料添加劑等方面具有較高的實用價值。

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