HPLC法測定野蠶豆根中桃葉珊瑚苷含量的研究

吳銀雙 李莉 單蕊 陳燕 杜冰 李海寧 姚政

【摘?要】?目的：建立HPLC法測定栽培野蠶豆根中桃葉珊瑚苷含量。方法：采用外標法，XBridge Shield C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），甲醇-水（2∶[KG-*3/5]98）為流動相，梯度洗脫;流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長203nm。結果：桃葉珊瑚苷的質量濃度在：12.8～74.4μg/mL內與峰面積呈良好的線性關系，R=0.9990。平均加樣回收率為100.98%，RSD值為0.695% （n=9）。結論：栽培野蠶豆根中桃葉珊瑚苷2年生根、1年生根、2年生莖葉、1年生莖葉的平均含量分別為：2.4815%、0.9759%、0.3758%、0.0266%;實驗采用的HPLC法操作簡便、快速、準確，樣品處理簡便易行，適于野蠶豆根中桃葉珊瑚苷的質量控制。

【關鍵詞】?野蠶豆根;桃葉珊瑚苷;HPLC法

【中圖分類號】R284.2?【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）24-0021-04

Abstract：Objective To establish a HPLC method for the determination of the aucubin content in the cultivated Centranthera grandiflora benth. Methods Quantitative tests were carried out by external standard method， inw which XBridge Shield C18 column （250nmx4.6nm，5μm） with methanol-water （2∶[KG-*3/5]98） as mobile phase was used for gradient elution. The chromatographic conditions were as follows： flow rate 1.0mL/min， column temperature 30℃， detection wavelength 203nm. Results The mass concentration calculated by peak area showed a good linear relationship （R=0.9990） was within 12.8～74.4μg/mL. The average recovery was 100.98%， and the RSD value was 0.695%（n=9）. Conclusion According to our experimental study， the average aubucin contents of 2-year rooting，1-year rooting， 2-year stems and leaves and 1-year stems and leaves were 2.4815%， 0.9759%， 0.3758% and 0.0266%， respectively. Results of the study showed that the HPLC method is not only simple， rapid and accurate but also has the characteristics of simple and easy sample treatment， which means it is suitable for the quality control of aubucin in the Centranthera grandiflora benth.

Keywords：Centranthera grandiflora Benth;Aubucin;HPLC

野蠶豆根，又名化血丹、小紅藥、金貓頭（廣西）、靈芝草（云南） ，原植物來源于玄參科（ Scrophulariaceae） 胡麻草屬（ Centranthera） 植物大花胡麻草Centranthera grandiflora Benth，主要分布于云南、貴州、廣西等地， 越南、緬甸、印度也有分布[1]。以根入藥，主要載于《中華本草》《全國中草藥匯編》《天然藥8404種詮釋》《云南中草藥》《中國民族藥志要》《紅河天然藥物》等書，具有消腫止痛、散瘀止血的功效，外用治外傷出血[2]。在云南省紅河州等地，野蠶豆根主要被用于防治多種心腦血管疾病，且療效顯著，系當地苗族地區名貴地方藥。迄今為止，有關野蠶豆根的主要化學成分研究報道，主要含有環烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、類胡蘿卜素類、紫羅蘭酮苷類、單萜苷類等豐富的生物活性物質[3-5]。其中環烯醚萜苷類化合物是其主要化學成分，環烯醚萜苷具有抗炎、抗腫瘤、保肝、降糖、神經系統保護作用等廣泛的藥理活性[6-7]，最新的研究還發現環烯醚萜苷類具有DNA合成酶抑制劑的作用，可開發成抑制DNA合成的抗腫瘤新藥[5]。桃葉珊瑚苷是野蠶豆根中含量最高的環烯醚萜苷類成分[3]。桃葉珊瑚苷在抗氧化、抗炎、抗菌、抗糖尿病、保肝、抗腫瘤、神經保護及促進傷口愈合作用等功效顯著[8]，能明顯抑制乙型肝炎病毒DNA的復制和促進干細胞再生[9]。[JP+1]藥理研究顯示，野蠶豆根用藥安全，無明顯毒性反應，有抗凝血及抗炎活性[10-11]，對心血管疾病和大鼠急性缺血模型所到處心肌損傷有保護作用 [12-13]，泡制的酒可以防治腦血栓、腦梗[14]。該民族藥療效確切，有較好的應用前景。目前，隨著野蠶豆根臨床需求量的增加，其野生資源已屬瀕危，當地已開展人工種植。

有關HPLC法測定野蠶豆根中桃葉珊瑚苷的含量，張傳利等[15-16]對其野生（根、莖、葉、花）、栽培的野蠶豆根不同部位（根、莖、葉、花、混合樣）的桃葉珊瑚苷、梓醇進行含量了測定，野生的野蠶豆根桃葉珊瑚苷的含量高低為：根>莖>花>葉，根的含量遠高于其他部位;栽培的野蠶豆根桃葉珊瑚苷的含量高低為：根>葉>混合樣>莖>花，根中的最高含量為0.930mg/g;兩種野蠶豆根中梓醇在葉中含量都是最高的。色譜柱：Agilent TC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動相：乙晴-水（3∶[KG-*3/5]97），檢測波長205nm。本研究對栽培野蠶豆根1年生根、莖葉;2年生根、莖葉中的桃葉珊瑚苷分別進行含量的測定，色譜柱：XBridge Shield C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動相：甲醇-水（2∶[KG-*3/5]98），檢測波長203nm。建立HPLC法測定野蠶豆根中桃葉珊瑚苷含量的方法，為栽培野蠶豆根藥材質量評價及采收的合理性提供科學依據。

1?儀器與材料

1.1?儀器?Waters e695型高效液相色譜儀、萬分之一電子天平（恒平，FA2004型）、十萬分之一電子天平（島津，SHIMADZU）、超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司，SK3300LH）、萬能高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司，DFY-C）、旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-2000A）、電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司，DZKW-D-4）、循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司，SHZ-ⅢA）。

1.2?試劑?桃葉珊瑚苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號：111761-200601）。所用試劑均為分析純，使用娃哈哈純凈水，甲醇為色譜醇。野蠶豆根采自云南省紅河州屏邊縣國云種植有限公司栽培基地，經云南中醫藥大學李海寧老師鑒定為玄參科胡麻草屬植物大花胡麻草Centranthera grandiflora Benth.的根及根莖。

2?方法與結果

2.1?對照品溶液的制備?精密稱取桃葉珊瑚苷對照品6.20mg，置50/mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成0.124mg/mL對照品溶液，避光冰箱保存，備用。

2.2?供試品溶液的制備[17]?分別精密稱取1年生根、莖葉、2年生根、2年生莖葉（1.0g），置于具塞錐形瓶中，加氯仿20mL，超聲處理20min，濾過。藥渣自然晾干后，加60%乙醇30mL，稱定質量，超聲處理30min，再稱定質量，用60%乙醇補足損失的質量，用0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3?色譜條件及適用性實驗[18-19]?色譜柱：XBridge Shield C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動相：甲醇（A）-水（B）;梯度洗脫程序：0～25min 2%～98% B;25～30min 80%～20% B;30～35min 2%～98% B;流速1.0mL/min，檢測波長203nm，柱溫30℃，進樣量：20μL。在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液2μL，注入液相色譜儀。

2.4?線性關系考察?精密量取“2.1”對照品溶液1、2、3、4、5、6mL分別置于10mL容量瓶中，依次稀釋定容，分別進樣20μL，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得線性回歸方程為：Y=6326522.085X-1747.411（R=0.9990），線性范圍為：12.8～74.4μg/mL。

2.5?精密度實驗?取“2.1”對照品溶液適量，按“2.3”色譜條件重復進樣6次，每次20μL，記錄色譜圖，按峰面積計算相對偏差。桃葉珊瑚苷對照品的相對標準偏差（RSD）為1.44%，表明儀器精密度良好。

2.6?穩定性實驗?取“2.2”供試品溶液，按“2.3”色譜條件，精密吸取同一供試品溶液20μL，分別于0、2、4、6、8、10、12、24h進樣，其相對標準偏差（RSD）為1.92%，表明供試品溶液在24h內表現出良好的穩定性。

2.7?重復性實驗?精密稱取6份藥材，按“2.2”制備供試液，按“2.3”色譜條件分別進樣測定，每次20μL，記錄色譜圖，按峰面積計算相對偏差。其相對標準偏差（RSD）為1.21%，表明該方法重復性良好。

2.8?加樣回收率實驗?精密稱取9份已知含量的野蠶豆根藥材粉末，每份0.50g，按“2.2”制備供試液，分別精密加入一定量的對照品溶液，按“2.3”項色譜條件測峰面積，計算回收率，結果顯示桃葉珊瑚苷的平均回收率為100.98%，RSD=0.695%。

2.9?供試品含量測定?分別取野蠶豆根（1年生根莖、莖葉;2年生根莖、莖葉）粗粉適量，平行稱取6份，按“2.2”制備供試液，按“2.3”色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用Excel 2010處理計算桃葉珊瑚苷的含量。

3?討論

野蠶豆根主要化學成分為環烯醚萜苷類化合物，其中含量最高的桃葉珊瑚苷，也是其中的活性成分之一，是評價野蠶豆根質量標準的一個重要指標。本研究以桃葉珊瑚苷為測定指標，采用流動相甲醇-水溶液（2∶[KG-*3/5]98）梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長203nm的色譜條件，從而研究野蠶豆根中桃葉珊瑚苷的含量。實驗結果表明在此條件下峰形對稱性較高，無拖尾現象，測得含量穩定，重現性好，為野蠶豆根的開發與應用提供實驗依據，同時也為其它藥材測定桃葉珊瑚苷化合物提供參考。

野蠶豆根在云南省紅河州一帶資源豐富，被當地苗族廣泛用于心血管系統疾病的防治，由于大量采集，現野生資源枯歇，目前在云南省紅河州已經開展了大量人工種植，由于3年生野蠶豆根多發生根的腐敗而導致產量降低，故一般采收1～2年生藥材。本研究以桃葉珊瑚苷的含量為評價指標，對栽培野蠶豆根1年生、2年生根以及地上部份莖葉進行含量測定，桃葉珊瑚苷2年生根、1年生根、2年生莖葉、1年生莖葉的平均含量分別為：2.4815%、0.9759%、0.3758%、0.0266%。

2年生根、莖葉的桃葉珊瑚苷含量遠遠高于1年生根、莖葉的含量，為野蠶豆根藥材2年采收的合理性提供理論依據。

野蠶豆根主要化學成分是環烯醚萜苷類化合物，環烯醚萜苷類化合物在自然界中分布廣泛，是具有多種藥理活性的天然產物，有很高的藥用價值，其根中的桃葉珊瑚苷是含量最高的化合物。近代研究，野蠶豆根泡制的酒可以防治腦血栓、腦梗[14]，也明確了野蠶豆根作為防治心腦血管疾病候選新藥的開發價值，根作為原料還可以在新型藥物、抗腫瘤、保健食品、化妝品的添加劑等開發方面具有廣闊的前景。

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（收稿日期：2020-04-29?編輯：程鵬飛）