UFLC-MS/MS法測定句容蟬花中核苷類成分肌苷、尿苷的含量

楊燕飛 顧媛 劉源 竇金鳳

【摘?要】?目的：建立同時測定蟬花中肌苷、尿苷含量的方法。方法：采用Shim-pack XP-ODSⅢ（1.6μm，75mm×2.0mm）為色譜柱，甲醇-水 （5∶95） 流動相，流速：0.2mL·min-1，柱溫：40℃，進樣量：1μL，多反應監(jiān)測（MRM）和電噴霧離子化（ESI+）。結果：肌苷和尿苷分別在2.04～13.60ng·mL-1、15.72～104.80ng·mL-1范圍內線性關系良好（R2>0.99）。肌苷和尿苷的平均回收率分別為90.58%、91.72%。結論：該方法具有測定快速、選擇性好、靈敏高的特點，可用于蟬花的質量控制。

【關鍵詞】?蟬花;肌苷;尿苷;UFLC-MS-MS

【中圖分類號】R284.2?【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）24-0028-03

Abstract：Objective To o establish an UFLC-MS/MS method for the simultaneous determination of inosine and uridine in Jurong Cordyceps cicadae. Methods Shim-pack XP-ODSⅢ C18 column（2.0mmL.D ×75mm，1.6μm），the methanol and water（5∶95） as mobile phase.The flow rate was 0.2mL·min-1 and the column temperature was 40℃.MS instrument was equipped with positive electrospry ionization mode （ESI+） and multiple reaction monitoring（MRM）.Result Inosine and uridine had good linear relationship in the range of 2.04～13.60ng·mL-1 、15.72～104.80ng·mL-1 （R2>0.99）. The average recovery rate of Inosine and uridine was 90.58% and 91.72%. Conclusion This method has the characteristics of fast selectivity and high sensitivity， and can be used for quality control of Cordyceps cicadae.

Keywords：Cordyceps cicadae;UFLC-MS/MS;Inosine;Uridine

蟬花別名冠蟬（《綱目》引《禮》注）、蟲花《四川中藥志》、蝘花《新華本草綱要》，為麥角菌科棒束孢屬真菌蟬棒束孢菌的孢梗束、蟲草屬真菌大蟬草的子座及其寄生的蟲體[1]。其味甘、性寒、疏散風熱、熄風止痙、明目退翳[2]。研究發(fā)現，蟬花含有含肝糖、蟲草酸、多種必需氨基酸、D-甘露醇、多種生物堿、麥角甾醇等有效成分。具有調節(jié)神經系統(tǒng)、增強免疫、抗炎、抗菌等保健和藥用活性[3]。

核苷類成分對人體免疫、代謝、心血管等有重要生理作用，具有抗菌等活性[4-8]，有研究表明尿苷有預防細胞損害和肝臟機能失調的作用，肌苷有助于受損肝細胞功能的恢復，促進肝細胞的活化，提高肝臟功能。核苷的測定方法有薄層色譜法[9]、毛細管電泳法[10]、高效液相色譜法[11] ，其中以HPLC法較為普遍。目前，蟬花的質量標準在浙江、四川等省有收載，內容僅包括性狀、鑒別和檢查項。由于鎮(zhèn)江市句容地區(qū)環(huán)境適合蟬花的生長，而江蘇省目前未收載蟬花標準，故本文采用超高效液相色譜-質譜聯用（Ultra fast liquid chromatography-mass- mass spectrometry，UFLC-MS-MS）方法對句容蟬花中核苷類成分肌苷、尿苷進行含量測定，為蟬花的質量評價提供方法和依據，對句容蟬花進一步開發(fā)利用提供參考。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?Shimadzu LC-MS-MS-8050（日本島津，含LC-30AD二元高壓泵， DGU-20A在線脫氣機，CTO-30A柱溫箱，SPD-M30A二極管陣列檢測器，三重四級桿質譜儀;CPA225D電子天平（賽多利斯公司，精度為0.01mg）。

1.2?試藥?肌苷對照品（中國食品藥品監(jiān)督檢驗研究院 批號140669-201606，98.6%），尿苷對照品（中國食品藥品監(jiān)督檢驗研究院 批號110887-201803，99.5%），甲醇為質譜純，水為Milli-Q超純水。6批蟬花均采收于句容茅山，由江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為Cordyceps cicadae。

2?方法與結果

2.1?溶液的制備

2.1.1?對照品溶液的制備?對照品溶液的制備 分別精取肌苷13.79mg、尿苷10.53mg，加水溶解稀釋至100mL容量瓶中，作為對照品儲備液。

2.1.2?供試品溶液的制備?取樣品約0.10g（過四號篩），置50mL量瓶中，加水40mL超聲30min，定容至刻度，搖勻，濾過，精取續(xù)濾液1mL，稀釋至50mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.2?分析條件

2.2.1?色譜條件?Shim-pack XP-ODSⅢ（2.0mmI.D×75mm，1.6μm）為色譜柱;流動相：水-甲醇（95∶5），柱溫：40℃，流速：0.2mL·min-1，進樣量：1μL。

2.2.2?質譜檢測條件?離子化模式：電噴霧離子化（ESI），正離子模式;掃描模式：多反應檢測（MRM）;離子噴霧電壓：+4.0KV;ESI源溫度：300℃;脫溶劑溫度：250℃;加熱塊溫度：400℃;霧化氣流速：氮氣，3.0L·min-1;干燥氣流速：氮氣，10.00L·min-1;碰撞氣：氬氣。MRM優(yōu)化參數見表1，圖譜如圖1、2、3所示。

2.3?方法學考察

2.3.1?標準曲線的制備?分別精密量取對照品儲備液適量，稀釋成含肌苷2.04ng·mL-1、4.08ng·mL-1、5.44ng·mL-1、6.80ng·mL-1、9.52ng·mL-1、13.60ng·mL-1和尿苷15.72ng·mL-1、31.44ng·mL-1、41.92ng·mL-1、52.40ng·mL-1、73.36ng·mL-1、104.80ng·mL-1的混合對照品溶液。分別進樣，以峰面積與濃度計算標準曲線。肌苷的回歸方程為Y=2.53207×103X+180.804，R2=0.9941，尿苷的回歸方程為Y=324.641X+2496.57，R2=0.9969。肌苷和尿苷的濃度線性范圍分別在2.04～13.60ng·mL-1和15.72～104.80ng·mL-1時，線性關系良好。

2.3.2?精密度試驗?精取肌苷和尿苷濃度分別為6.80ng·mL-1和41.92ng·mL-1的對照品溶液連續(xù)進樣6次，肌苷和尿苷峰面積的RSD分別為2.73%和2.79%，精密度良好。

2.3.3?重復性試驗?取樣品0.10g，按“2.1.2”供試品溶液制備方法平行提取樣品6份，按UFLC-MS-MS方法測定面積。結果尿苷的平均含量為1227.7μg·g-1，肌苷的平均含量為72.94μg·g-1，RSD分別為2.82%、3.45%。

2.3.4?檢測限和定量限?取尿苷和肌苷對照品儲備液逐級稀釋，至信噪比（S/N）為3和10。此時尿苷的檢測限為1.05ng·mL-1，定量限為4.51ng·mL-1;肌苷的檢測限為0.47ng·mL-1，定量限為1.36ng·mL-1。

2.3.5?穩(wěn)定性試驗?取供試品溶液，分別于0、2、4、8h進樣測定，尿苷和肌苷峰面積RSD分別為1.63%，1.49%。結果供試品溶液在8h內穩(wěn)定。

2.3.6?回收率試驗?取6份已測含量的蟬花，分別精密加入尿苷和肌苷對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定峰面積計算回收率。結果尿苷和肌苷的平均回收率分別為91.72%，90.58%，RSD為2.42%、3.70%，表明該試驗方法可靠。見表2。

2.4?樣品測定?取6批蟬花粉末0.1g（過四號篩），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，根據回歸方程計算供試樣品的含量。結果見表3。

3?討論

本實驗對提取方法進行考察，考察溶劑（水、50%甲醇、甲醇），提取時間（10min、30min、60min）結果選用溶劑水超聲提取30min，具有操作簡單、含量提取充分。

比較不同的流動相組成（甲醇-水、0.1%甲酸水-甲醇、乙腈-水），實驗結果顯示以甲醇-水為流動相洗脫時，分離時間短，峰形對稱，檢測靈敏度高。

本實驗測定方法經各項考察，結果表明方法簡便、結果準確，重現性好，能同時測定2種核苷類物質，可為準確測定蟬花中更多核苷類有效成分提供基礎。

參考文獻

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（收稿日期：2020-07-03?編輯：程鵬飛）