啤酒酵母基因工程菌種的構建方法研究現狀與應用

于洪梅

摘 ?要：啤酒酵母的質量控制決定了啤酒的質量，基因工程育種技術具有定向性，可以對啤酒酵母進行育種、改良及風味改進。利用基因工程技術，在不改變酵母原有特性的基礎上，能賦予酵母新的特性。可以有效利用麥芽汁中的營養物質，降低不利的副產物生成量，改良發酵性能等。該文簡述基因工程育種的主要方法及在啤酒酵母育種中的應用情況。

關鍵詞：啤酒酵母 ?基因工程 ?育種 ?菌種

中圖分類號：TS262 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A文章編號：1672-3791（2020）12（c）-0044-03

Research Status and Application of Genetically Engineered Strains of Beer Yeast

YU ?Hongmei

（Changchun Vocational Institute of Technology， Changchun， Jilin Province，130033 ?China）

Abstract： The genetic engineering breeding technology is directional and can be used to breed and improve the beer yeast and make the flavor of beer yeast better. Using genetic engineering technology， the yeast can be given new characteristics without changing the original characteristics of the yeast. This article briefly describes the main methods of genetic engineering breeding and its application in beer yeast breeding.

Key Words： Beer yeast; Genetic engineering; Breeding; Strain

酵母是一種單細胞真菌微生物，已知的種類約有56屬500多種[1]。啤酒酵母是啤酒釀造的靈魂，啤酒的風味主要由啤酒酵母代謝產生的風味物質綜合形成，風味穩定性是啤酒最重要的質量指標之一[2]，啤酒酵母的質量控制決定了啤酒的質量[3]。因此，選育性能優良的啤酒酵母，是啤酒生產企業長期而艱巨的任務。微生物育種的方法有很多，隨著DNA重組技術的發展，啤酒酵母的定向育種迅速發展起來。基因工程技術包括雜交、細胞融合、稀有交配、轉化、突變、DNA重組技術等，近年來，多株Lager酵母菌株陸續完成了全基因組測序，為探索不同類型Lager酵母起源提供了基因組學基礎[4]。利用基因工程技術，可以對啤酒酵母進行育種、改良及風味改進。該文主要介紹基因工程菌種的構建方法及在啤酒酵母育種方面的應用。

1 ?基因工程技術

基因工程技術也稱為DNA重組技術，是從生物體內提取出一定的DNA或人工合成DNA，把它和作為載體的質粒或噬菌體在體外重組，再轉移到另一生物體內，從而改變生物的遺傳性狀。基因工程技術包括4個步驟：目的基因的獲取;載體與工具酶的選擇;DNA體外重組;外源基因的無性繁殖和表達。基因敲除技術又稱基因打靶技術，將構建的打靶載體導入靶細胞后，通過載體DNA序列和靶細胞染色體的同源序列進行重組，將靶細胞基因組上的某一確定片段置換，使特定基因失活或缺失，從而改變細胞遺傳特性[5]。

2 ?基因工程技術在啤酒酵母育種的應用

2.1 有效利用糊精

糖化過程中形成的高分子糊精不能被酵母利用，而葡萄糖苷酶能將其水解為葡萄糖，將葡萄糖苷酶的基因引入酵母中，可以有效利用麥芽汁中的糊精，改善啤酒的過濾性能，提高啤酒的發酵度。葡萄糖苷酶由同源基因STA1（DEX1）、STA2（DEX2）、STA3（DEX3）控制，能水解β-1，4糖苷鍵和β-1，6糖苷鍵，使糊精轉化為葡萄糖。有報道顯示克隆葡萄糖苷酶的酵母能水解麥芽汁中70%的糊精。

2.2 分解β-葡聚糖

β-葡聚糖的黏度很高，不利于麥芽汁和啤酒的過濾性能以及啤酒的風味穩定性。β-葡聚糖酶可以水解β-1，4和β-1，3葡萄糖苷鍵，將β-葡聚糖降解，從而降低醪液的黏度。含有細胞外β-葡聚糖基因的酵母能降解β-葡聚糖，改善啤酒的過濾性能。Meaden.P.G和PentJIia.M分別克隆了枯草芽孢桿菌和真菌的葡聚糖基因，并獲得了具有葡聚糖分解能力的酵母，從而解決葡聚糖引起的渾濁問題。

2.3 降低雙乙酰的生成量

雙乙酰是啤酒發酵的副產物，對啤酒風味的影響很大，雙乙酰含量的高低作為衡量啤酒是否成熟的指標（0.1 mg/L）。雙乙酰是由丙酮酸在生物合成纈氨酸或異亮氨酸時，中間代謝產物α-乙酰乳酸轉化得到的。雙乙酰在酵母體內可被還原酶作用生成乙偶姻和2，3-丁二醇，或直接被α-乙酰乳酸脫羧酶作用快速生成乙偶姻。李艷等采用基因工程技術降低ILV2的活性，使α-乙酰乳酸生成量減少，缺失ILV2的酵母AHAS活性降低75%，雙乙酰含量降低30%，其他發酵性能均為正常。Mithieux S等將ILV5在啤酒酵母中表達，RI活力可大幅度提高，利用此酵母發酵的啤酒，雙乙酰含量降低50%，縮短了啤酒成熟的時間。Yamano S等將ALDC基因整合到釀酒酵母染色體上，用于啤酒的發酵可顯著降低雙乙酰的生成。用ILV5取代ILV2，降低AHAS的酶活力，減少α-乙酰乳酸生成量，并促進生成的α-乙酰乳酸轉變為纈氨酸，從而降低雙乙酰的生成量。也可通過結構類似物選育低α-乙酰乳酸合成酶活性或雙乙酰還原能力強的抗性突變株，達到降低雙乙酰的目的，但這種方法對降低雙乙酰的程度有限。石婷婷等人采用PCR技術構建了BDH2基因整合過表達的重組酵母菌株B2Z，經啤酒發酵，BDH2基因的過表達使雙乙酰的生成量降低，峰值和還原后的雙乙酰分別降低42.61%和32.73%，其他指標基本符合啤酒發酵的要求[6]。

2.4 降低H2S的生成量

H2S是啤酒中主要的硫化物之一，影響啤酒的風味。主要在發酵過程中形成，酵母對半胱氨酸及硫酸鹽和亞硫酸鹽的同化作用及酵母合成蛋氨酸受抑制時的中間產物。可通過克隆NHS5基因，或將克隆MET25基因置于糖酵解啟動子控制下，并將其整合到酵母的rDNA中，均可降低H2S的生成量。

2.5 降低高級醇的生成量

高級醇是在主發酵期間形成的，是啤酒的主要香味和口味物質之一，是3個碳以上的一元醇類物質的總稱，包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等。適量的高級醇能使酒體豐富，口味協調，給人以醇厚的感覺，但如果含量過高，會導致飲后上頭并使啤酒有異味，應嚴格控制。高級醇產生途徑，一方面來自于氨基酸轉氨途徑;另一方面來自于糖代謝途徑，α-酮酸由葡萄糖經EMP途徑和TCA循環合成。A.Eden等人發現異戊醇、活性戊醇和異丁醇受ecaΔ39、ecaΔ40的影響顯著，BCAT可切斷或減弱氨基酸轉變成α-酮酸的能力，減少纈氨酸到異丁醇、亮氨酸到異戊醇的產生。Dickenson等人的研究顯示，從纈氨酸到異丁醇的代謝途徑中，丙酮酸脫羧酶是合成異丁醇的關鍵步驟，通過構建丙酮酸脫羧酶活性降低的工程菌可降低異丁醇的生成量。正丙醇由α-酮丁酸進一步脫羧脫氫生產成，丙酮酸在合成纈氨酸的過程中會生產異丁醇的前體物質α-酮異戊酸[7]，其能被異丙基蘋果酸合成酶催化生成異戊醇的前體物質α-酮異己酸[8]。石鈺[9]等人通過構建重組質粒pUC-LABK，獲得LA-KanMX-LB重組盒，并利用醋酸鋰轉化法和同源重組技術，篩選出LEU1基因缺失的突變株A-L9，兩種發酵條件下，異戊醇的生成量分別降低了0.29倍和0.51倍。

2.6 解決醇高酯低的問題

啤酒發酵的副產物中，乙酸乙酯和高級醇是影響啤酒風味的重要物質，葛峻伶等人通過對BAT2基因和Lg-ATF1基因的研究[10]，解決啤酒釀造過程中醇類和酯類的生成量的問題。BAT2基因影響高級醇的生成量，Lg-ATF1基因影響乙酸乙酯的生成量，通過酶切連接法重組質粒pUC-PLABBK，獲得重組菌株S5-Lg，過表達Lg-ATF1基因，并敲除BAT2基因，經過發酵后，重組菌株S5-Lg的高級醇降低9.12%，乙酸乙酯升高26.81%。菌株S5-Lg與原菌株S5的生長性能和發酵性能基本保持一致。

2.7 發酵性能的改良

啤酒釀造過程中，酵母凝聚的好壞是至關重要的[11]。絮凝性是啤酒酵母的重要特性之一，良好的絮凝性能使酵母在啤酒發酵后快速沉淀到發酵罐底部，既能降低分離酵母所需的能源，也能避免酵母不及時沉淀，而懸浮在發酵液中造成的酵母自溶現象，并能使啤酒發酵順利進行。在啤酒發酵中使用高PYF活力水平的麥芽時，酵母便會提前絮凝，該現象對啤酒釀造產生不利影響，應設法避免。絮凝是酵母自我保護的方式，在不利環境中，酵母的絮凝可使其避免受到各種因素的脅迫，絮凝基因的改變會影響酵母對抗逆境的能力。李靜怡等人利用PCR介導基因中斷技術，以pUG6為模板，設計含有與flo8基因兩側序列同源的引物，構建帶有KanMX基因的中斷盒，醋酸鋰法轉化啤酒酵母G-03，轉化啤酒酵母，使基因片段同源重組，敲除FLO8基因，會有所削弱啤酒酵母的絮凝力，從而削弱提前絮凝因子對酵母的作用，在高PYF值麥芽汁中發酵能保持很好的發酵性能。

2.8 高溫高濃發酵菌種的構建

啤酒釀造通常采用低溫發酵，而高溫高濃發酵將給啤酒生產企業帶來利益，但會存在酵母回收問題、副產物高級醇生成量過高問題等。孫中貫等人通過以BAT2基因為整合位點過表達FLO5基因構建了酵母菌株[12]，啤酒酵母的凝聚性達到85.44%，與出發菌株相比，提高了63%，通過弱化線粒體支鏈氨基酸轉氨酶（BAT1）的表達，高級醇生成量為142.13 mg/L，降低了18.4%。BAT基因與FLO5基因在改造過程中，不存在互相干擾或協同的現象。通過對FLO5基因和BAT基因的遺傳改造，提高了啤酒酵母高溫高濃發酵的凝聚性能，并降低了高級醇的生成量，此研究對啤酒發酵后酵母的回收及啤酒風味有重要意義。

2.9 抗自溶啤酒酵母菌種的選育

啤酒酵母的自溶會影響啤酒的品質，王金晶等人在啤酒酵母自溶的研究中發現，細胞完整性途徑中，RLM1基因作為重要的轉錄因子，與酵母的自溶性有密切的關系[13]。將RLM1基因敲除后，啤酒酵母的抗自溶性會變差，并影響酵母的抗滲透壓性能，使細胞壁損傷的耐受性、抗氮饑餓性能和溫度耐受性;而RLM1基因過表達則會有助于啤酒酵母的抗自溶。因此，基于同源重組的方法對RLM1基因進行敲除和過表達，獲得重組菌H-rlm1Δ和H-rlm1，啤酒酵母對細胞壁損傷、氮饑餓、滲透壓的耐受性以及溫度的敏感性都受到了影響。通過對RLM1基因的調控，對酵母的抗自溶能力產生影響，為啤酒酵母抗自溶能力菌株的選育提供依據。

3 ?結語

利用DNA重組技術進行啤酒酵母的育種是目前廣泛使用的方法，在基因工程菌種構建的過程中，外源基因應盡可能少，而且其表達一定不能影響到酵母的發酵性能;所用的目的基因需確認是無毒的酵母菌株。利用DNA重組技術對啤酒酵母定向育種，將會獲得更優質的啤酒酵母，釀造出質量更好、風味更佳的啤酒。

參考文獻

[1] 張嬌，吳獻華，荊通，等.啤酒酵母目的基因的提取[J].中外酒業·啤酒科技，2018（23）：47-49.

[2] 楊靜靜.抗老化啤酒酵母研究進展[J].生物工程學報，2017，33（4）：541-551.

[3] 王金晶，楊靜靜，丁華建，等.啤酒發酵過程中酵母環境壓力應答機制研究進展[J].食品與發酵工業，2017（1）：266-270，275.

[4] 尹花，賀揚，候曉平，等.Lager啤酒酵母起源的歷史足跡及基因組學研究[J].食品與發酵工業，2019（9）：274-281.

[5] 李燕，戴佳錕，甄麗莎，等.發酵工業菌種改良中的基因敲除策略及應用[J].中國釀造，2013，32（1）：5-7.

[6] 石婷婷，李憑，肖冬光，等.BDH2基因過表達對啤酒酵母雙乙酰代謝的影響[J].食品與發酵工業，2016（2）：13-17.

[7] chen xiao，kristian f nielsen，lrina borodina，et al.Incrcased isobutanol production in Saccharomyces cerevisiae by overexpession of genes in valine metabolism[J].Biotechnol Biofuels，2011（4）：21.

[8] 佐一含.LEU2基因敲除對工業啤酒酵母高級醇生成量的影響[J].中國釀造，2011（3）：27-30.

[9] 石鈺，陳葉福，肖冬光，等.LEU1基因缺失對釀酒酵母高級醇生成量的影響[J].釀酒科技，2015（2）：12-16.

[10] 葛峻伶，郭瑩，劉小二，等.一次敲除BAT2同時過表達Lg-ATF1對啤酒酵母產醇酯的影響[J].現代食品科技，2019，35（6）：171-176，272.

[11] 張建早，鄭良軍，程麗仙，等.淺析啤酒酵母絮凝性的影響因素[J].中外酒業·啤酒科技，2016（19）：41-43.

[12] 孫中貫，周波，王孟祺，等.高溫高濃發酵工業啤酒酵母菌種的構建[J].生物工程學報，2019，35（3）：522-534.

[13] 王金晶，李孟琦，候丹，等.Lager啤酒酵母RLM1基因調控對其抗自溶性能的影響[J].生物工程學報，2019，35（6）：1059-1070.