基于全細胞RC電路的細胞阻抗響應模型的建立與分析

杜向斌，孔金龍，王楷群，黃 棣，1b，陳維毅，1b，單彥虎

(1.太原理工大學 a.生物醫學工程學院，納米生物材料與再生醫學研究中心，b.生物醫學工程研究所，材料強度與結構沖擊山西省重點實驗室，太原 030024；2.中北大學 儀器與電子學院，太原 030051)

細胞是生物體的基本單元。眾多研究已經表明細胞電學特性與細胞分裂、分化、增殖、遷移、凋亡等細胞功能緊密相關。近年來，細胞電學特性的研究，受到科學家們的廣泛關注。MIGUEL et al[1]采用微流控阻抗細胞計數法對骨骼干細胞進行研究發現其在擴增的過程中膜電容增大，其阻抗值也隨增殖過程逐漸增大，該項研究結果可用于區分骨髓中的骨骼干細胞。LIU et al[2]研究表明鐮刀狀紅細胞的血漿電導率低于正常紅細胞，并且其細胞內部的相對介電常數較大。

檢測細胞電學特性的技術手段眾多，其中，細胞阻抗傳感器在細胞功能表征方面得到了非常廣泛的應用，其最先由GIAEVER和KEESE兩人提出[3]，可以實現免標記實時監測細胞的電學特性。當不同生理/病理狀態的細胞在微電極上培養時，細胞及其內部各部分電學特性的異質性影響細胞-電極間的電流通路，整個系統的阻抗發生改變，進而表征細胞實時功能狀態。RAJAPAKSHA et al[4]基于細胞阻抗傳感測試原理，制作了非侵入式生物傳感器，發現不同種類的腫瘤細胞顯示出不同的阻抗值。STANICA et al[5]利用細胞阻抗傳感器發現低氧條件下人結腸癌HT-29細胞在加入碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺時，細胞阻抗實部顯著性降低。LUO et al[6]利用阻抗傳感器研究4種不同的抗癌試劑對胃腸癌細胞阻抗變化的影響，發現加入復方苦參注射液(CKI)后阻抗急劇下降；加入華蟾素注射液后阻抗只產生輕微地變化；轉化生長因子-β1(TGF-β1)和5-氟尿嘧啶(5-FU)也會引起了阻抗的下降。將上述試驗測試結果與簡易RC模型擬合，可以提取出不同生理/病理狀態細胞的等效電容值與電阻值。盡管這些研究可以為細胞功能的表征提供有效的手段，但是對于細胞電學特性的變化對特定細胞功能的阻抗響應機理研究還不夠充分，進而細胞電學特性與細胞功能之間的深入聯系還需進一步的研究。

考慮到細胞電學特性的特異性對于阻抗測試的影響，對細胞電學特性模型的研究就顯得非常有必要，如KOTNIK et al[7]建立了具有介電弛豫的細胞介電模型，來研究細胞處于不同頻率的電場下所引起的功耗；SOLEIMANI et al[8]建立了一種簡潔且可重構的細胞模型，用以表達鈣離子動力學的各種非線性響應；HODGKIN和HUXLEY[9]利用雙電極電壓技術提出細胞膜模型(H-H模型)，該模型不僅揭示了細胞膜的離子交換機制，還預測了細胞膜上的鈉鉀通道；KANAI et al[10]認為細胞外液、細胞質膜、細胞內容物可以分別用并聯的電容和電阻來描述，由此可以得出一個簡單的細胞RC電路模型；MANSOORIFAR et al[11]利用電路模型，直觀地解釋了利用介電譜技術來表征細胞介電特性的原理；姚陳果等[12]將細胞電路模型運用在研究外加不同頻率的電刺激對細胞膜電位的影響。

建立模型定量分析不同細胞電學特性在測試過程中產生不同響應的機理對于細胞電學特性在細胞功能檢測以及表征等方面有著非常重要的作用。針對于不同類型不同功能的細胞的阻抗響應，已有研究僅僅把細胞等效成為一組簡單的RC電路，擬合的結果不能全面反映細胞內部各組件電學特性改變對于阻抗異質性響應的影響。例如，已有研究表明正常紅細胞的細胞質電容遠小于鐮狀紅細胞的細胞質電容[13]，因此，上述等效模型并不能反映阻抗響應的機理。

細胞阻抗響應受頻率調控，其原因是與細胞的電學特性和粘附性有關[14]。因此，本文旨在通過模型分析不同細胞電學特性下細胞阻抗響應異質性的機理。模型中，采用等效電路模型將細胞膜、細胞質、細胞核等組分的電學特性直觀地等效成響應的電學元件。考慮到實際細胞阻抗測試中的環境因素對于整體阻抗響應有很重要的影響，模型中考慮了電極、培養液電學特性以及電極-培養液的電化學反應。本研究為深入分析不同生理/病理狀態下細胞的不同阻抗響應提供了有力的理論支持；同時，本模型可以定量地描述細胞對測量阻抗的影響，以及分析細胞阻抗的頻率特性，并且對實際實驗中參數等的選擇提供參考。

1 實驗方法

當細胞生長在電極上時，電流穿過細胞下面與電極之間的間隙，然后分為穿過細胞膜的電流和穿過細胞間的電流，由于細胞電學特性的異質性，導致不同生理/病理狀態下的細胞中兩部分電流占總電流的比重不同。具體流程如圖1所示。

圖1 細胞生長在電極上的電流通路

1.1 電極等效電路模型

阻抗測試實驗中，電極浸泡于培養液中用于實時免標記檢測細胞的阻抗響應。電極與培養液間的電化學反應可用Randles模型來描述，Randles模型通常用于電化學阻抗譜(EIS)中，是描述電化學界面上反應過程的模型之一，由雙層電容Cdl與法拉第反應阻抗的并聯組合再串聯活性電解質電阻Rs組成，法拉第反應的阻抗由電荷轉移電阻Rct和Warburg擴散元件組成，其等效電路如圖2所示[15]。在Randles模型基礎上，將電極等效電路模型等效成為如圖3所示的電路圖。模型中引入的常相角元件CPE用于解釋實驗過程中電極阻抗對于不同頻率響應的現象。CPE的阻抗值表示為：

(1)

式中：Q是CPE阻抗大小；ω是角頻率；n是常數(0

圖2 Randles模型

圖3 電極等效電路模型

CPE是根據實際觀測結果抽象出來的一種元件。由于其不是實際的電子元件，因此很難直接利用CPE的公式分析電極的電學特性影響。已有研究表明可以采用多個RC電路的組合模擬CPE元件的實際響應。本模型中，將3組RC并聯電路串聯用以實現CPE元件的特性的表征，如圖4所示。該模型部分的阻抗如式(2)所示。模型中的各個參數通過最小二乘法擬合得到[16]。

(2)

圖4 CPE等效電路圖

1.2 細胞-電極等效電路模型

圖5 電極與細胞的等效電路模型

細胞-電極的總阻抗可以表示為：

Ztotal=Zcell+Zelectrode.

(3)

(4)

(5)

式(6)—式(7)顯示了系統總阻抗和總相位角：

Z=R+jX.

(6)

(7)

模型中，采用球形外殼電容器來描述細胞膜和細胞核膜的電學特性，采用導電球體模型描述細胞質的電學特性，進而確定細胞內各結構的電容電阻值。當細胞處于電場中時，由電磁場理論可知，細胞膜和細胞核膜的漏電導與電容值可如式(8)—式(9)來表示，細胞質的漏電導與電容值可如式(10)—(11)來表示[20]。

(8)

(9)

G=4πσR.

(10)

C=4πεε0R.

(11)

式中：內、外半徑分別為r1和r2；電導率和相對介電常數分別為σ與ε.

1.3 模型參數的選擇

不同生理/病理狀態的細胞顯示了不同的介電常數，進而導致不同的細胞電學特性。本模型采用的細胞電學特性參數參考文獻[21-22]，電極參數根據已有實驗文獻中的測試結果擬合得到[23]，全部模型參數如表1所示。

表1 電路模型各參數的值

2 結果與分析

2.1 模型驗證

為了驗證模型的合理性，通過擬合不同尺寸的細胞在不同頻率下的阻抗響應[24]以及細胞種植于導電聚合物基底前后阻抗響應的變化[25]的實驗數據來驗證本文建立的模型的合理性。模型中，細胞直徑的變化會影響細胞膜細胞質的電容電阻值，細胞的數量由細胞間電阻Rcell控制。因此，通過調節細胞膜細胞質電容電阻值以及Rcell來擬合不同尺寸細胞阻抗響應的變化，擬合結果如圖6所示。圖7顯示了阻抗傳感器電極上種植細胞前后系統整體阻抗變化的擬合結果。上述結果表明，本文提出的模型較為合理地用于描述細胞阻抗響應變化的原因。

實線代表實驗結果圖，虛線代表模型擬合結果

實線代表實驗結果，虛線代表模型擬合結果

2.2 細胞膜電阻Rm影響的分析

當細胞功能改變時，細胞膜自身的電學特性發生響應改變。例如，當細胞處于有絲分裂期間，細胞大小和形態的改變，會導致細胞膜電容電阻的變化。圖8(a)顯示隨著頻率增大，系統整體阻抗的幅值逐漸變小。當頻率較小時，初始電流主要從細胞間穿過，當頻率增大時，穿過細胞膜電流的比例逐漸增大，因此，整體阻抗呈現逐步下降的趨勢。當細胞膜電阻隨細胞功能變化而變化時，系統總體阻抗隨頻率變化的趨勢保持一致，但是總體阻抗幅值的低頻增益隨著細胞膜電阻的增加而增加，與此同時，頻率帶寬隨細胞膜電阻的增加而減小，詳細數據如圖9所示。由此可知，細胞膜電阻變化可以表征細胞對應生物功能變化的敏感性。當阻抗虛部小于0時，電路呈現電容特性；當阻抗虛部等于0時，電路呈現電阻特性。圖8(b)顯示了阻抗角與頻率之間的關系。以細胞膜電阻為5.5 kΩ的情況為例，當處于低頻率階段時，系統阻抗角趨近于0，但是在頻率增大的過程中，系統呈現增強的電容特性，在0.4 MHz頻率下，顯示最強的電容特性，在此后階段，系統電容特性稍有減弱。然而，細胞膜電阻增大會導致系統可以在更低的頻率下就出現電容特性，并且系統電容特性進一步增強(Rm=55 MΩ時，在2 kHz頻率下，阻抗角達到最大值-70°)，并且隨著頻率的進一步增大，系統能夠在較強電容特性情況下保持較長階段。可能是因為細胞膜電阻變化時改變了細胞內各結構之間電學參數的耦合關系，使得阻抗虛部在頻率增大時越來越小于0.

圖8 細胞膜電阻對系統整體阻抗幅頻和相頻特性的影響

圖9 細胞膜電阻對于系統阻抗幅值低頻增益以及帶寬變化的影響

2.3 細胞膜電容Cm影響的分析

圖10(a)顯示當頻率增大時，系統整體阻抗幅值下降，但與細胞膜電阻的影響相比，在其生理取值范圍內，細胞膜電容對于阻抗幅值的影響在較高頻率范圍內(>105 Hz)較為明顯。隨著細胞膜電容的增大，系統總體阻抗的幅值可在更小的頻率時下降。圖11顯示了系統阻抗幅值的下降斜率以及帶寬隨細胞膜電容增大時的變化情況，清晰表明了阻抗幅值特性對于細胞膜電容的敏感性。圖10(b)顯示了系統阻抗角隨頻率變化的情況。當Cm取值為0.158 pF時，阻抗角在頻率大于103 Hz時，開始下降，在104 Hz到5 105 Hz范圍內，呈現穩定狀態(≈-20°)，隨后頻率繼續增大時，阻抗角線性下降至-60°.當細胞膜電容增大時，阻抗角隨頻率增大近似線性下降至-60°，電容增大可促進在更小的頻率到達最顯著的電容性特征，隨后系統向電容特征減弱的方向趨近，并無穩定電容特性階段出現。該研究表明細胞膜電容變化導致細胞內部電學參數耦合關系不同，最終導致系統阻抗表現出不同的趨勢。

圖11 細胞膜電容對于系統阻抗幅值帶寬以及下降斜率變化的影響

2.4 細胞間電阻Rcell的影響

細胞增殖或者凋亡的過程中，由于細胞數量的增多或者減小，細胞間距會發生變化，進而會影響穿過細胞間的電流。細胞間電流大小可通過等效成為一個電阻Rcell來表征，電阻連接位置如圖5所示。Rcell增大代表細胞間間距減小。圖12顯示了同樣在頻率增大時系統阻抗幅值響應逐步下降的趨勢，表明系統阻抗對于頻率的依賴特性。在細胞增殖的過程中，細胞間電阻逐步增大，進而使得系統總阻抗幅值呈現增大的趨勢，但是與細胞膜電阻變化下的趨勢相比，系統阻抗幅值在大于截止頻率的范圍內下降較為平緩。圖13顯示的系統阻抗幅值增益、帶寬以及下降斜率清晰地表明了基于阻抗測試下細胞阻抗幅值變化的情況。圖12(b)表明系統阻抗角曲線出現一個波谷，對于細胞間電阻的增加，波谷幅值增大，表明細胞間電阻增大會使系統呈現向電容特性轉變的趨勢(最大阻抗角超過-60°)，并且大的細胞間電阻使得能夠在更小的頻率下顯示更強的電容特性。研究結果表明細胞內部電學特性耦合作用導致的系統阻抗變化與細胞增殖等生理過程的變化同步，可為細胞實時狀態監測提供有效的手段。

圖12 細胞間電阻對系統整體阻抗幅頻和相頻特性的影響

圖13 細胞間電阻對于系統阻抗幅值低頻增益、帶寬以及下降斜率變化的影響

2.5 細胞與電極之間電阻的影響

圖14 細胞電極間電阻對系統整體阻抗幅頻和相頻特性的影響

3 結論

細胞阻抗與細胞生理/病理狀態緊密相關。本文通過建立基于全細胞RC電路的細胞阻抗響應模型來分析細胞內部各結構的電學特性變化導致系統總體阻抗變化的原因。模型中考慮了細胞外液、細胞膜、細胞質、細胞核以及細胞間以及細胞電極間電學特性對于系統阻抗的影響。結果表明，系統阻抗幅值隨著頻率的增加而降低，其原因是由于高頻率下電流穿過細胞膜的比例增加進而使得其總體阻抗減小。細胞膜電容電阻、細胞間電阻以及細胞電極間電阻增加會使得細胞阻抗幅值低頻增益以及帶寬增加，但是會使得系統出現向電容特性發展的趨勢，并且出現于頻率相關的波谷。該研究為基于細胞阻抗傳感器測試的細胞功能實時無損表征提供了深入的理論基礎以及為阻抗測試選擇合適的頻率提供了有效指導。

圖15 細胞電極間電阻對于系統阻抗幅值低頻增益、帶寬以及下降斜率變化的影響