機械拉伸對人角膜基質細胞水通道蛋白AQP1表達的影響

雷旭琴，孫宇寧，宋 婕，李曉娜，陳維毅，楊繼忠

(1.太原理工大學 生物醫學工程學院，太原 030024；2.山西省眼科醫院 準分子激光室，太原 030024)

準分子激光原位角膜磨鑲術(LASIK)等角膜屈光手術是矯正近視的主要方法，術后角膜的生物力學性能下降，在眼內壓的作用下，角膜厚度變化越大，其所受的張力變化就越大，當張力改變超過了角膜床的承受能力，角膜發生變形，可引發繼發性圓錐角膜等術后并發癥。力學因素在圓錐角膜發生過程中發揮重要的作用[1]。把角膜組織的纖維看成各向異性材料，通過有限元分析發現屈光手術后角膜的最大應力可增加20%[2].基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類能夠降解細胞外基質組分的蛋白酶家族，在細胞增殖、遷移和粘合等過程中發揮重要作用。MMPs活性升高導致膠原降解異常是圓錐角膜等角膜擴張疾病發生的可能機制之一[3]。研究表明，機械拉伸能后誘導角膜基質細胞中MMPs的表達，促進細胞外基質降解，進而參與圓錐角膜等術后并發癥的發生發展[4]。

水通道蛋白(AQPs)是一類介導水分子轉運的跨膜蛋白。在眼組織中，AQPs的分布與眼內房水的分泌和循環密切相關，在角膜和晶狀體透明度的維持、淚液的分泌等生理過程發揮重要的功能，與角膜變性水腫、白內障、青光眼、干燥綜合征等許多眼部疾病的發生密切相關。多數AQPs在角膜中均有表達，其中AQP1的表達量最高。對AQP1基因敲除小鼠的研究發現AQP1與角膜基質厚度密切相關[5]。研究表明，AQP1可參與MMPs的表達調控。抑制AQP1后膠質母細胞瘤細胞中MMP2和MMP9的表達降低，遷移能力降低[6]。在肺癌細胞系LTEP-A2和LLC中, 使用siRNA降低AQP1的表達能夠下調細胞中MMP2和MMP9的表達水平[7]。沉默AQP1能夠降低視網膜色素上皮細胞中MMP2、MMP9的蛋白水平，抑制PDGF誘導的細胞增殖和遷移[8]。在對骨髓間充質干細胞的研究發現，AQP1分別與β-catenin、FAK共沉淀，過表達AQP可以通過激活Wnt信號通路和FAK信號通路誘導MMP2的表達。

力刺激介導的MMP2的表達是圓錐角膜等屈光手術后并發癥發生的關鍵因素之一，但其分子機制還不清楚。本研究對體外培養的人角膜基質細胞進行機械拉伸處理，模擬屈光術后角膜的受力變化，分析拉伸處理后細胞中AQP1及其下游信號通路相關基因的表達變化，探討AQP1在機械拉伸誘導角膜細胞中MMP2表達過程中的作用，為揭示角膜細胞響應力刺激的分子機制及研究屈光手術后圓錐角膜等并發癥的發生機理提供參考。

1 實驗材料和方法

1.1 細胞培養及處理

原代人角膜基質細胞購買自ScienCell公司(USA)，采用成纖維細胞培養基(fibroblast medium,FM)(包含體積分數2%胎牛血清，體積分數1%成纖維細胞生長因子，體積分數1%青霉素/鏈霉素)(ScienCell，USA)在37 ℃、體積分數5% CO2的細胞培養箱內進行培養，細胞長至90%融合后進行后續處理。

周期性力學加載：將角膜細胞以個細胞/孔的密度接種到裱襯有Ⅰ型膠原蛋白的BioFlex硅膠底六孔培養板上，長到90%融合后，更換為無血清和生長因子的FM基礎培養液，饑餓處理6 h后采用Flexcell-4000拉伸加載系統(Flexcell International，Mckeesport，PA，USA)進行力學加載，加載條件為：正弦波，0.5 Hz頻率，15%拉伸幅度。分別于加載0，1，4，6，8 h后收取細胞進行RNA提取，以相應培養條件下未拉伸處理的細胞作為對照組。

Ca2+螯合劑處理：細胞長到90%融合后，更換為FM基礎培養液，加入10 μmol/L Ca2+螯合劑BAPTA(Sigma，USA)，培養6 h或按照上述加載條件拉伸處理6 h后進行RNA提取或環磷酸腺苷(cAMP)含量測定。

1.2 基因表達分析

收集的細胞用PBS洗滌后加入RNA裂解液，采用EastepSuper總RNA提取試劑盒(Promega，上海)提取總RNA，具體步驟按照說明書進行。以提取的總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒(Takara，大連)說明書將RNA反轉錄成cDNA.根據GenBank中的序列，使用Primer 5.0軟件設計引物并由上海生工生物工程公司合成，引物名稱及序列如表1所示。以管家基因GAPDH作為內參基因，以合成的cDNA為模板，采用實時熒光定量 PCR(SYBR染料法)檢測AQP1、ARHGEF2、Wnt11、MMP2基因的表達。20 μL PCR體系包含10 μL SYBR Green(Takara，大連)，0.4 μL ROX，上下游引物各0.2 μL，2 μL cDNA，6.8 μL H2O.熒光定量PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s；(95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸并收集熒光信號30 s)，40個循環。采用相對定量法對目的基因的表達進行分析。以對照組中的表達量為1，獲得處理組中各基因的相對表達倍數。

1.3 cAMP含量測定

用細胞刮收取細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入150 μL的PBS溶液，多次反復凍融使細胞破碎，1 500 g離心10 min，吸取上清，采用酶聯免疫法(ELISA)進行cAMP含量分析。檢測過程按照cAMP ELISA試劑盒(Elabscience，武漢)說明書進行，使用酶標儀(Thermomax，CA)測定反應液在450 nm波長處的吸光值。將cAMP標準品梯度稀釋，以標準品濃度及其在450 nm波長處的吸光值(OD450)擬合標準曲線，cAMP濃度與OD450成反比，根據繪制的標準曲線計算樣品中cAMP的濃度。以未處理的細胞作為對照組，分析處理組細胞中cAMP的相對含量。

1.4 熒光顯微鏡檢測Ca2+濃度變化

采用Fluo-3熒光探針(KeyGEN，南京)檢測細胞內Ca2+的濃度變化。在拉伸處理6 h后的角膜基質細胞與未處理的對照組角膜基質細胞培養液中分別加入0.1 μmol/L的Fluo-3-DMSO溶液于37 ℃避光孵育1 h，孵育結束后用PBS清洗兩次后熒光倒置顯微鏡鏡檢拍照，激發波長為488 nm.

1.5 數據分析

每組實驗獨立重復3次，數據以平均值±SD表示，通過SPSS 17.0軟件采用單因素方差分析(ANOVA)進行統計學分析，p<0.05表明有顯著性差異。

2 結果

2.1 機械拉伸處理后AQP1及其下游信號通路相關基因表達的變化

采用實時熒光定量PCR檢測機械拉伸處理不同時間對人角膜基質細胞中AQP1及其下游信號通路相關基因ARHGEF2、Wnt11的表達，結果如圖1所示，機械拉伸1，4，6，8 h后AQP1的表達均有所上升，分別是未處理對照組的2.0，1.5，12.0，1.5倍(p<0.05)，機械拉伸處理6 h能夠顯著誘導人角膜基質細胞中AQP1的表達。此外，機械拉伸處理后細胞中AQP下游FAK信號途徑相關基因ARHGEF以及Wnt信號途徑基因Wnt11的表達較未拉伸處理的對照組均有顯著的升高(p<0.05)，其中機械拉伸處理6 h時表達量最高，分別為對照組的2倍和8倍(p<0.05).

2.2 機械拉伸對角膜基質細胞內Ca2+濃度的影響

采用Fluo-3熒光探針檢測機械拉伸處理后角膜基質細胞內Ca2+濃度的變化，結果如圖2所示，機械拉伸后的細胞內Ca2+的熒光信號強于未拉伸對照組細胞，表明機械拉伸能夠誘導角膜基質細胞內Ca2+濃度升高。

2.3 Ca2+在機械拉伸介導的AQP1及其下游信號通路相關基因表達中的作用

通過加入10 μmol/L Ca2+螯合劑BAPTA降低角膜基質細胞內游離Ca2+濃度，結合機械拉伸處理(6 h)，檢測Ca2+對機械拉伸介導的AQP1，ARHGEF2，Wnt11，MMP2基因表達的作用。如圖3所示，機械拉伸能夠顯著誘導角膜細胞中AQP1，ARHGEF2，Wnt11，MMP2基因的表達(p<0.05).與單獨機械拉伸處理組相比，BAPTA結合拉伸處理組角膜基質細胞中AQP1，ARHGEF2，Wnt11，MMP2基因的表達具有顯著的降低，分別為單獨拉伸組的0.32，0.63，0.16，0.80倍(p<0.05)，表明Ca2+螯合劑BAPTA能夠顯著降低機械拉伸誘導的AQP1，ARHGEF2，Wnt11，MMP2基因的表達(p<0.05).

*代表與0 h靜態對照組有顯著性差異，p<0.05

圖2 角膜基質細胞中Ca2+的含量

2.4 機械拉伸對角膜基質細胞中cAMP含量的影響

采用競爭ELISA法檢測角膜基質細胞內cAMP的含量，結果如圖4所示，機械拉伸處理6 h后的角膜基質細胞中cAMP的含量是未拉伸對照組的1.6倍(p<0.05).與單獨拉伸處理組相比，BAPTA結合拉伸處理后角膜基質細胞中cAMP的含量顯著下降，為拉伸組的0.75倍(p<0.05)，表明機械拉伸能夠提高角膜基質細胞中cAMP的含量，加入Ca2+螯合劑后cAMP的含量降低。

3 討論

力學因素在LASIK術后圓錐角膜等并發癥的發生過程中發揮重要的作用。LASIK手術使角膜周邊基質板層的張力降低，角膜拮抗膨脹壓的能力隨之降低，角膜周邊基質體積急性擴張，使受損部位的組織受到更大的牽拉，嚴重時引發角膜變形[1-2,9-11]。角膜是典型的承載組織，角膜的基質層約占角膜總厚度的90%，富含膠原纖維，承擔角膜的主要抗張強度。術后圓錐角膜的發生可能與膠原數量減少導致角膜抗張強度降低有關。正常狀態下，膠原的合成和降解處于代謝平衡狀態。LASIK手術后角膜受力發生變化，MMP2等膠原酶表達升高使得膠原的降解增加，角膜的抗張強度降低，在眼內壓作用下角膜發生嚴重變形進而誘發圓錐角膜等術后并發癥。前期研究發現，機械拉伸能夠通過ERK1/2信號途徑誘導體外培養的角膜細胞中MMP2基因及蛋白的表達，促進基質降解[4]。AQP1與許多眼部疾病的發生密切相關，研究發現，AQP1與角膜基質層厚度密切相關，AQP1參與角膜基質細胞的遷移，促進角膜的損傷修復，但其在術后圓錐角膜發生中的作用還有待進一步研究。過表達AQP1可通過激活下游的FAK通路和Wnt通路來促進間充質干細胞的遷移。對癌細胞的研究發現，AQP1的表達與MMP2的表達呈正相關[7]。通過已有研究推測，機械拉伸可能通過誘導AQP1及下游FAK、Wnt信號途徑參與MMP2的表達調控，調節膠原的代謝，進而在術后圓錐角膜病變過程中發揮作用。

*代表與對照組有顯著差異，p<0.05；#代表BAPTA結合拉伸處理組與單獨拉伸組有顯著差異，p<0.05

*代表與對照組有顯著差異，p<0.05；#代表BAPTA結合拉伸處理組與單獨拉伸組有顯著差異，p<0.05

本研究利用機械拉伸處理體外培養的人角膜基質細胞，模擬角膜屈光手術后的受力環境，檢測角膜基質細胞中AQP1的表達變化。結果表明，周期性機械拉伸能夠顯著誘導角膜基質細胞中AQP1的表達。機械通氣能夠增加大鼠肺中AQP1基因的表達[12]。采用Flexcell系統對體外培養的小梁網細胞進行拉伸，結果顯示，10%和20%拉伸幅度均可誘導細胞中AQP1的表達[13]，與本研究結果一致。此外，本研究進一步分析了機械拉伸對角膜基質細胞中AQP1下游FAK、Wnt信號途徑相關的基因的表達，探討機械拉伸誘導的AQP1的表達對角膜基質細胞中MMP2調控的作用機制。ARHGEF2，又稱GEF-H1，是鳥嘌呤核苷酸交換因子家族的重要成員，也是FAK信號途徑的關鍵因子，能激活FAK通路下游Rho家族分子RhoA，參與調節細胞的粘附與運動。張應力可通過FAK/ERK途徑刺激Src家族激酶激活人臍靜脈內皮細胞ARHGEF2的表達[14]。FAK途徑能誘導小鼠成纖維細胞中MMP2的分泌。Wnt11是一種富含半胱氨酸的分泌性蛋白，是Wnt信號通路上重要的信號分子，與細胞粘附、遷移、增殖和分化密切相關。在效應T細胞中，Wnt通路能誘導MMP2和MMP9的表達[7]。本研究結果顯示機械拉伸在誘導AQP1表達的同時能夠上調人角膜基質細胞中ARHGEF2、Wnt11、MMP2基因的表達，表明作為屈光手術后繼發性圓錐角膜發生的影響因素之一，力刺激可以誘導角膜基質細胞中AQP1的表達，并激活下游FAK和Wnt信號通路，參與MMP2的表達調控，但力刺激誘導AQP1表達的作用機制還不清楚。

作為細胞內的第二信使，Ca2+與cAMP在細胞正常生命活動及生理功能的維持中發揮重要的作用。Ca2+參與了胞外力學信號到胞內生物化學信號的轉換過程。機械拉伸能夠激活AT1R-Gq-PLC-DAG信號通路，進而通過肌纖維膜TRPC3/6通道使細胞內Ca2+濃度的增加[15]。單軸拉伸可以誘導人內皮細胞中Ca2+與cAMP濃度的升高。研究表明，AQP1的表達受胞內Ca2+及cAMP的調節。FOTIADIS et al研究發現AQP1的C端有與Ca2+結合的結構域[16]。Ca2+濃度變化能夠影響細胞中AQPs的透水性[17]。cAMP可通過PKA信號通路調節AQP1的表達，也可以通過激活蛋白激酶，促進AQP1的磷酸化，提高AQP1的活性。本研究分析了機械拉伸對角膜基質細胞中Ca2+和cAMP濃度的影響，并進一步探討了Ca2+在機械拉伸介導的AQP1及其下游信號通路相關基因表達中的作用。結果顯示，機械拉伸能夠上調人角膜基質細胞內Ca2+和cAMP的濃度。通過Ca2+螯合劑BAPTA降低胞內游離Ca2+的濃度能夠抑制機械拉伸誘導的cAMP、AQP1及其下游FAK、Wnt信號途徑相關的基因以及MMP2的表達。

研究結果顯示機械拉伸能夠通過調節胞內Ca2+濃度和cAMP濃度促進AQP1的表達，并通過下游的FAK、Wnt信號通路在角膜細胞外基質代謝過程中發揮作用。本研究可為進一步揭示屈光手術后并發癥的發生機理奠定基礎，為圓錐角膜的臨床診斷和治療提供參考。