連續自然發酵泡菜中菌群顯微表征與抗氧化活性的研究

劉秉坤，呂嘉櫪，晁倩文，羅瀟

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

泡菜是以蔬菜等為主要原料，添加或不添加輔料，經食用鹽或食用鹽水泡漬發酵等工藝加工而成的蔬菜制品。不同地區、不同配方、不同發酵條件等對菌群群落的構成、理化指標以及其他特性等均有重要影響。汪榮斌等[1]對近十年泡菜的研究進展進行了總結，主要包括原料、輔料、香辛料、自然發酵、純種發酵等單批次發酵過程中理化指標、助消化功能、膽固醇降解、降低血脂功能、抗氧化作用、抗菌作用等的變化。葉陵等[2]對我國傳統發酵蔬菜中乳酸菌群落結構多樣性研究進展進行了綜述，論述了泡菜發酵中乳酸菌群的研究現狀。近期，毛丙永等[3]以8份四川老鹵泡菜樣品為研究對象，對其理化指標和特征菌群進行了研究，從8份樣品中分離出了植物乳桿菌、布氏乳桿菌和耐乙醇片球菌3種菌，表明這3種菌是老鹵泡菜的特征菌群，對泡菜發酵具有重要作用；張安等[4]采用構建16S rRNA基因文庫技術對四川泡菜中細菌群落結構多樣性進行了研究，結果表明，發酵后期乳桿菌屬為優勢菌，OTU豐度為50.3%。這些研究大多集中在單批次發酵，對于多批次連續發酵的研究報道不多，2018年李恒等[5]對不同發酵階段(20代發酵)泡菜母水微生物群落組成和多樣性進行了分析，發現泡菜母水中含量在0.1%以上的細菌屬有7個，主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、拉烏爾菌屬(Raoultella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、乳球菌屬(Lactococcus)等，泡菜母水中的真菌屬主要是Kazachstania，含量超過99%。傳統泡菜發酵常由多菌群參與，一般多采用連續發酵。因此，本研究通過對連續7代自然發酵泡菜過程中微生物顯微特性、SOD酶活性、DPPH自由基清除率、還原力、pH、總酸含量、亞硝酸鹽含量等的分析檢測，揭示了菌群變化對泡菜質量的影響。研究結果對泡菜安全性和品質的提高具有一定的理論與實際意義。

1 材料與方法

1.1 供試原材料

蓮花白、黃瓜、紅蘿卜、花椒、辣椒、姜、食鹽：購于陜西西安華潤萬家超市。

1.2 儀器與設備

Phenom ProX-飛納臺式掃描電鏡 復納科學儀器(上海)有限公司；DM750-LEICA數碼顯微鏡 北京瑞科中儀科技有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；HHW21-600 電熱恒溫水箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DSX-280A 高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠。

1.3 主要試劑及配制

1.3.1 主要試劑

EDTA-2Na、DPPH(1，1-二苯基-2-苦肼基自由基)：分析純，西安東升化工有限公司；戊二醛溶液、無水乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、三氯化鐵、鄰苯三酚：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸：分析純，天津市天力化學試劑有限公司。

1.3.2 試劑配制

pH 8.20、0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸緩沖溶液(內含1 mmol/L EDTA-2Na)：稱取1.2114 g Tris和37.2 mg EDTA-2Na溶于62.4 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液中，用蒸餾水定容至100 mL。

4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液：56.7 mg鄰苯三酚溶于少量10 mmol/L鹽酸溶液并定容至100 mL。

2.5%戊二醛溶液：用pH 7.2、0.1 mol/L磷酸緩沖液將25%戊二醛溶液稀釋10倍。

磷酸緩沖溶液(pH 7.2、0.1 mol/L)：360 mL A+140 mL B定容至1000 mL。其中，母液A：0.2 mol/L的Na2HPO4溶液(NaH2PO4·12H2O 71.6 g用蒸餾水溶解并定容至1000 mL)；母液B：0.2 mol/L的NaH2PO4溶液(NaH2PO4·2H2O 31.21 g用蒸餾水溶解并定容至1000 mL)。

0.2 mmol/L DPPH溶液：稱取7.88 mg DPPH，用無水乙醇溶解并定容至100 mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 原料預處理

將新鮮蔬菜經稱量、清洗、切分等預處理后，用沸水漂燙10 min后冷卻，晾干備用。

1.4.2 連續自然發酵方法

稱取蓮花白300 g、黃瓜400 g、紅蘿卜300 g，按1.4.1方法處理后入壇，加入其他輔料，加水3500 mL、加鹽量為3%自然條件下發酵7 d為1代，共發酵7代。每代發酵結束時取出蔬菜并投入等量新鮮蔬菜，進行第2代發酵。每代平行試驗3批次，每個批次進行3次重復。每代發酵結束后進行菌群顯微表征，并檢測發酵液中SOD活性、DPPH自由基清除率、還原力以及理化特性。

1.5 分析檢測方法

1.5.1 SOD酶活性

根據國標GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定》[6]對泡菜發酵液中SOD酶活性進行測定。

1.5.2 還原力[7]

將Vc配制成濃度分別為10，20，30，40，50 μg/mL。分別取0.2 mL上述溶液，加入0.8 mL蒸餾水、2.5 mL pH 6.6、0.2 mol/L磷酸緩沖液及2.5 mL質量分數為1%的鐵氰化鉀，50 ℃ 水浴20 min，然后加入2.5 mL質量分數為10%的三氯乙酸，4000 r/min離心10 min。取離心后的上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水及2.5 mL質量分數為0.1%的FeCl3。混勻后靜置10 min，測定700 nm波長條件下的吸光值并繪制標準曲線，見圖1。樣品中還原力大小與上述方法相同，結果換算為Vc當量表示。

圖1 還原力標準曲線Fig.1 Standard curve of reducing capability

1.5.3 DPPH自由基清除率

DPPH測定加樣程序見表1。

表1 DPPH測定加樣表Table 1 DPPH adding samples mL

按照表1中步驟加入試液，混勻后避光反應30 min，分別在517 nm波長條件下測定吸光值。

式中：A樣為樣品與DPPH反應后的吸光值；A空為樣品空白在517 nm波長條件下的吸光值；A對為對照在517 nm波長條件下的吸光值。

1.5.4 pH值

根據國標GB 10468-89《水果和蔬菜產品pH值的測定方法》測定泡菜發酵液的pH值[8]。

1.5.5 總酸

根據國標GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》測定泡菜發酵液的總酸含量[9]，結果以乳酸計。

1.5.6 亞硝酸鹽含量

根據國標GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》對泡菜發酵液的亞硝酸鹽含量進行測定[10]。繪制亞硝酸鹽標準曲線，見圖2。

圖2 亞硝酸鹽標準曲線Fig.2 Standard curve of nitrite

1.5.7 菌群的顯微表征

顯微表征采用掃描電子顯微鏡觀察，方法如下[11]：

待觀測樣品的預處理：取待測樣品發酵液以6000 r/min離心10 min，倒掉上清液，再加入發酵液進行離心(離心條件同上)，多次離心直至有較多菌體沉淀在離心管底部。

固定：將上述步驟中的菌體沉淀物用2.5%戊二醛溶液(稀釋溶液為pH 7.2、0.1 mol/L磷酸緩沖液)固定2 h以上，固定結束時以6000 r/min離心10 min去除上清液。

清洗：用磷酸緩沖液(pH 7.2、0.1 mol/L)清洗3次，20 min/次。每次清洗結束后以6000 r/min離心10 min去除上清液。

脫水：采用乙醇梯度脫水的方式，濃度依次為30%、70%、100%，每個濃度脫水3次，20 min/次，每次脫水結束時以6000 r/min離心10 min去除上清液。

干燥：將樣品放入烘箱中，50 ℃ 烘干。

噴金：利用真空鍍膜設備對樣品鍍金以增加導電性。

觀察：將處理好的樣品在掃描電子顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 連續自然發酵過程中菌群的顯微表征

將原料經過處理后進行連續自然發酵，每7 d為1代，共發酵7代，做3個批次，在發酵過程中，分別對每一代、每一批次的泡菜進行菌群顯微表征，結果見圖3～圖5。

圖3 第1批次連續自然發酵7代菌群的顯微表征Fig.3 Microscopic characterization of seven generations of continuous natural fermentation in the first batch

由圖3可知，第1批次第1代發酵液中有少量桿菌并且形態各異，菌群組成較為豐富，其中細長形態的桿菌占優勢；首次發酵結束后，菌群變得單一，以形態粗短的桿菌占優勢；第2代發酵液菌群形態以粗短的桿菌和酵母菌為主；第3代發酵液以桿菌為主，其次是酵母菌，并且有少量的球菌；第4代發酵液酵母菌較多，桿菌形態各異，還能觀察到少量的球菌；第5代發酵液酵母菌所占比例有所減少，球菌比例增加，主要以桿菌為主且形態較為豐富；第6代發酵液短桿菌和球菌較多，有少量的酵母菌；第7代發酵液中桿菌總體上占優勢，球菌較多，還有少量的酵母菌。整體來看，每代發酵結束都存在桿菌，而酵母菌和球菌分別開始出現在第2代和第3代發酵液中，并且出現之后就或多或少地存在于之后的每代，在發酵第2，3，4代結束時酵母菌占有較大比例，從第3代發酵結束開始，酸味較刺鼻。

圖4 第2批次連續自然發酵7代菌群的顯微表征Fig.4 Microscopic characterization of seven generations of continuous natural fermentation in the second batch

由圖4可知，第2批次第1代發酵液中菌群較少，以短桿菌占優勢，菌群較為復雜，桿菌形態各異；第2代發酵液菌群以酵母菌和桿菌為主，許多酵母菌上面還留有芽痕，桿菌的形態非典型且多樣，未觀測到球菌；第3代發酵液中酵母菌占優勢，桿菌較少；第4代發酵液菌群組成仍然以酵母菌為主，但形態非典型的桿菌數量有所增加；第5代發酵結束后桿菌數量明顯增多，桿菌形態多樣，觀察到大量短桿菌且具有較為典型的形態，酵母菌所占比例大大減少，未觀察到球菌；第6代發酵液菌群結構與第5代發酵液菌群結構較為相似，仍以桿菌為主并且形態典型清晰，酵母菌較少；第7代發酵結束后桿菌占優勢，尤其是短桿菌較多，酵母菌較少，未觀察到球菌。與第1批次相比，第2批次發酵液中幾乎沒有球菌，與第1批次發酵過程類似的是，酵母菌出現后就一直貫穿整個連續發酵過程，并且所占比例先增加后減少。第2批次泡菜在第3代發酵結束后，相比前2代質地較軟。此后幾代泡菜質地較好，酸味濃郁。

圖5 第3批次連續自然發酵7代菌群的顯微表征Fig.5 Microscopic characterization of seven generations of continuous natural fermentation in the third batch

由圖5可知，第3批次泡菜第1代發酵液中菌群較少，以短桿菌占優勢且菌群較為單一；首次發酵結束后以桿菌為主并且觀察到球菌；第2代發酵液中仍是桿菌占優勢，但菌體形態有所改變，并無典型的桿菌形態；第3代及第4代發酵液中桿菌形態與第2代發酵液中的菌群結構類似，還觀察到了大量的酵母菌；第5，6代發酵液菌群組成與第3，4代相比酵母菌的比例大大減少，桿菌形態較之前相似；從第3代發酵開始，泡菜的風味不夠濃郁。

綜上所述，連續自然發酵時，菌群變化對泡菜品質有較大的影響。發酵到第3代時，不典型桿菌和酵母菌(雜菌)的出現使得泡菜菜體變軟并出現刺鼻的酸味或發酵風味不夠濃郁等問題。隨后繼續發酵過程中，典型桿菌增多，酵母菌減少，但始終貫穿整個發酵過程。到發酵結束時，雜菌大量減少，菌群逐漸變純，且主要以桿菌為主，形態典型。球菌除第2批未出現外，其余都有出現，且出現較早，出現后呈逐漸增多趨勢，貫穿整個發酵過程。

2.2 連續自然發酵過程中抗氧化活性的變化

3批次連續自然發酵過程中SOD活性、還原力、DPPH自由基清除率的變化見圖6～圖8。

圖6 連續自然發酵SOD活性變化Fig.6 Changes in SOD activity of continuous natural fermented pickles

由圖6可知，泡菜能夠產生SOD活性。前3代逐漸升高，此后呈現出波動性變化，但始終高于未發酵時的SOD活性。第1代結束時SOD活性分別為(28.19±1.63)，(28.92±2.50)，(21.30±3.22) U/mL。第1，2批次在第3代結束時SOD活性達到最大值，分別為(82.22±6.71)，(68.89±5.55) U/mL。第3批次連續發酵在第7代發酵結束時SOD活性達到最大值，發酵7代后3個批次的SOD活性分別為(59.30±3.05)，(63.70±7.63)，(38.73±6.99) U/mL。此外，在發酵各代結束時，第1，2批次連續發酵過程中SOD活性變化趨勢相似且始終高于第3批次。本次試驗中SOD活性的高低順序早在第1代結束后就基本成型。這是因為在發酵過程中，各反應的進行離不開菌群的生長代謝，而菌群的替演是一個漫長的過程，因此SOD活性較低的樣品無法迅速超過酶活高于它的樣品，這也說明了泡菜品質控制要盡早。

由圖7可知，連續自然發酵過程中還原力波動變化，整體呈現先上升后下降再上升的趨勢。還原力相比SOD活性變化較小，并且發酵各代之間始終沒有較大差距。發酵前各樣品還原力相當于Vc含量分別為(20.12±1.58)，(21.2±4.05)，(16.12±0.77) μg/mL。發酵結束時分別為(52.58±1.42)，(54.35±2.84)，(50.74±2.73)μg/mL，還原力提高了2～3倍。

圖7 連續自然發酵還原力變化Fig.7 Change in reducing capacity of continuous natural fermented pickles

圖8 連續自然發酵DPPH自由基清除率變化Fig.8 Changes in DPPH free radical scavenging rate of continuous natural fermented pickles

由圖8可知，連續發酵泡菜能夠產生較強的DPPH自由基清除率。發酵前發酵液幾乎沒有DPPH自由基清除率。第1代結束后，DPPH自由基清除率迅速增加到90.00%以上，分別為(92.28±0.70)%、(93.86±0.33)%、(92.90±0.41)%。后期各樣品檢測值雖上下浮動但變化較小。第1批次發酵第7代達到最大值(99.09±0.50)%，其余兩批次在發酵第5代結束后達到最大值，分別為(98.90±1.22)%、(99.09±2.75)%。發酵7代結束時第2，3批次DPPH自由基清除率分別為(97.66±1.91)%、(88.60±1.56)%。

綜上所述，在連續自然發酵過程中DPPH自由基清除率在第1代時快速增長，后續發酵過程中基本沒有較大的變化，直到發酵結束時，其最大DPPH自由基清除率達到(99.09±2.75)%。而SOD酶活性與還原力則整體呈先上升后下降再上升的趨勢，結合之前顯微特性的觀察可知，在前3代發酵過程中，由于雜菌出現較少，所以SOD酶活性與還原力整體呈現上升趨勢，在第3代后雜菌逐漸增多，影響整體抗氧化活性，使得SOD酶活性與還原力降低，之后到第5代時，菌群開始逐漸變純，雜菌減少，整體抗氧化活性又開始呈現上升趨勢。整個發酵過程中SOD酶活性最大達到(82.22±6.71)U/mL，而還原力最大達到(54.35±2.84) μg/mL。

2.3 連續自然發酵過程中理化指標的變化

3批次連續自然發酵過程中pH、總酸、亞硝酸鹽含量的變化見圖9～圖11。

圖9 連續自然發酵pH值變化Fig.9 Changes in pH of continuous natural fermented pickles

由圖9可知，發酵開始前，pH值分別為8.16±0.01，8.10±0.01，8.06±0.01。每代發酵結束時，各發酵批次之間pH值差別不大。pH值的變化主要由發酵液中乳酸菌生長繁殖產生乳酸，乳酸不斷積累造成的。由于pH降低到一定程度時，乳酸菌本身的生長受到抑制，乳酸不會繼續積累，因此連續發酵pH值相比其他指標穩定，發酵7代時pH值總體上介于3.04±0.01～4.33±0.01之間。

圖10 連續自然發酵總酸變化 Fig.10 Change of total acid in continuous natural fermented pickles

由圖10可知，各批次之間、不同代之間總酸差別較大，但整體趨勢為先升高后降低。發酵開始前，各樣品總酸含量幾乎沒有檢出。發酵第1代結束時，各樣品總酸含量相差不大，分別為(9.19±0.89)，(12.01±0.07)，(9.05±0.87) g/kg。發酵第2代時，第3批次總酸含量最高，為(24.47±0.70) g/kg。第3代時，第1，2批次總酸含量達到最高值，分別為(25.34±1.99)，(27.84±0.43) g/kg。第3代之后，總酸均呈現出波動變化的趨勢。發酵第7代后，總酸含量分別為(17.43±1.21)，(15.58±0.20)，(19.64±0.01) g/kg。

圖11 連續自然發酵亞硝酸鹽含量變化Fig.11 Changes of nitrite content in continuous natural fermented pickles

由圖11可知，在泡菜發酵過程中，亞硝酸鹽含量在不同代之間呈現出波動性變化。發酵前亞硝酸鹽含量分別為(0.47±0.06)，(0.00±0.08)，(0.00±0.26) mg/kg。第1批次泡菜在第6代結束后亞硝酸鹽含量達到最大值，第2，3批次的泡菜在第2代結束后達到最大值，分別為(4.24±0.21)，(3.76±0.11)，(4.10±0.00) mg/kg。泡菜在發酵前期都會出現亞硝酸鹽的峰值，這是由于前期氧氣含量充足，含有硝酸鹽還原能力的雜菌生長旺盛，后期氧氣被消耗，乳酸菌占優勢，發酵液pH降低，亞硝酸鹽進入酸解階段。因此各代發酵結束時，亞硝酸鹽含量較低，本試驗所測結果均小于10.00 mg/kg。

綜上所述，連續自然發酵過程中pH變化趨勢不大，整體呈先下降后穩定的趨勢，總酸先上升后下降，且都大于15.00 g/kg，而亞硝酸鹽含量整體呈上升趨勢，但是也沒有超過10.00 mg/kg，整體理化指標正常，未出現異常指標，說明連續自然發酵過程中，泡菜整體質量符合日常人們的食用標準。

3 結論

通過對連續自然發酵泡菜過程中的菌群顯微表征、SOD活性、還原力、DPPH自由基清除率、pH、總酸含量、亞硝酸鹽含量進行試驗研究，結果表明，3批次發酵過程中菌群趨勢大體相似，前2代桿菌是優勢菌群，發酵過程中抗氧化活性呈上升趨勢，隨后從第3代、第4代開始有球菌與酵母菌出現，抗氧化活性出現降低趨勢，第5代～第7代桿菌又逐漸增多，成為優勢菌群直到發酵結束，此時抗氧化活性又出現升高趨勢；發酵過程中pH維持在3.04～4.33，從第2代開始總酸含量均大于15.00 g/kg；亞硝酸鹽含量始終未超過10.00 mg/kg，均符合國家標準。