酵母破壁程度測定方法的研究

周小輝， 陳毛清， 曹詩國， 梁大煒，戴晉軍，， 徐智鵬，， 胡駿鵬，

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；2.安琪酵母（崇左）有限公司，廣西崇左545200）

酵母作為單細胞蛋白原料，應用于飼料和動物養殖行業已有近半個世紀的歷史。 研究表明，將酵母直接干燥成酵母粉使用， 由于未經破壁處理，養殖動物對酵母的營養成分利用率較低 （徐那等，2015；楊翠竹等，2006；關苑等，1992）。 將酵母的細胞壁進行破碎處理， 使其釋放出胞內的營養物質，可以提高利用率（尹敬博等，2018；郭小云等，2015；賀淼等，2014）。 酵母破壁常用的方法有兩種：自溶法是利用酵母在自身水解酶類（蛋白酶、核酸酶、糖水解酶等）的作用下發生細胞壁裂解而釋放出內容物（徐那等，2015）；外源酶法是通過控制一定的溫度和pH， 在酶的作用下將酵母細胞壁破碎并使之釋放出內容物（崔春等，2017；梁天姣等，2015）。

隨著酵母產業和加工技術的發展， 飼料工業中應用的酵母蛋白原料越來越多， 然而目前研究中多為對酵母蛋白原料的應用評估， 而對酵母蛋白原料如何鑒別鮮有報道。 本實驗通過革蘭氏染色、酸溶蛋白質檢測、氨基酸態氮檢測3 種方法判定酵母破壁程度， 旨在為用戶區分不同酵母蛋白原料的生理特性提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 酵母粉（編號分別為Y1、Y2、Y3）、自溶酵母（編號分別為A1、A2、A3）、外源酶解酵母（編號分別為E1、E2、E3）均由湖北省酵母功能重點實驗室提供， 制備方法如下：（1）釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiaeHansen Z2.2，CCTCC NO： M205128）經液態純培養發酵獲得酵母乳；（2）酵母乳經離心、洗滌、噴霧干燥，制備獲得酵母粉；（3） 將酵母乳在溫度80 ℃進行熱擊50 s， 向上述酵母乳中加入5‰檸檬酸調節pH 至4.5；降溫至50 ℃，保溫12 h 后，經離心、洗滌、噴霧干燥，制備獲得自溶酵母；（4）將酵母乳在溫度80 ℃進行熱擊50 s，調節pH 為5.0，溫度58 ℃，加入1‰木瓜蛋白酶進行酶解反應8 h， 升溫到85 ℃保溫5 h 滅酶，經離心、洗滌、噴霧干燥，制備獲得外源酶解酵母。

實驗試劑：革蘭氏染色液試劑盒；三氯乙酸溶液，150 g/L； 凱氏定氮法實驗試劑 （消化片；硫酸，密度為1.8419 g/L；硼酸溶液，20 g/L；氫氧化鈉溶液，400 g/L； 滴定液，0.05 mol/L 硫酸溶液；混合指示液，1 份1 g/L 甲基紅乙醇溶液與5 份1 g/L 溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合）；氨基酸態氮測定試劑（NaOH 標準滴定溶液，0.05 mol/L；甲醛溶液，36%）。

1.2 儀器與設備 光學顯微鏡， 江南XS212 型；凱氏定氮裝置；酸度計，直接讀數，測量范圍（0 ～14），pH 精度±0.02；電磁攪拌器；堿式滴定管。

1.3 實驗方法

1.3.1 光鏡顯微觀察 采用革蘭氏染色法（適當改進）對酵母是否破壁進行鑒別，其作用原理為：樣品通過結晶紫初染和碘液媒染后，在酵母細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，乙醇脫色會使酵母細胞壁收縮，沒有破壁的酵母細胞因為細胞壁收縮而將結晶紫與碘的復合物留在酵母細胞內，而破壁的酵母細胞則無法阻止結晶紫與碘的復合物被乙醇溶解后從破壁孔中洗脫下來。導致未破壁的酵母細胞呈復合物的紫色，而破壁酵母細胞則為無色。 具體操作如下：（1）配置0.5%樣品溶液：分別取上述酵母粉 （Y1、Y2、Y3）， 自溶酵母（A1、A2、A3），外源酶解酵母（E1、E2、E3）樣品各0.5 g（精確至0.01 g），加入到不同的潔凈三角燒瓶中，每個燒瓶內加入100 mL 的純凈水， 使樣品充分溶解。（2）涂片：取滅過菌的載玻片于實驗臺上，用移液槍吸取10 μL 待檢樣品滴在載玻片的中央，用取液后的槍頭將液滴涂布成一均勻的薄層（直徑約1 cm的圓），涂布面不宜過大。 （3）干燥：將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。 （4）固定：固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰處盡快的來回通過2 ～3 次，共2 ～3 s，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60 ℃），放置待冷后，進行染色。（5）初染：在涂片薄膜上滴加草酸銨結晶紫1 ～2 滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1 min。 （6）水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。 （7） 媒染： 用100 ～1000 μL 移液槍吸取約300 μL 碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆蓋涂片，染色約1 min。（8）水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗， 直至洗下的水呈無色為止。（9）脫色：斜置載玻片，滴加95%乙醇脫色，至流出的乙醇不現紫色為止，大約需時20 ～30 s，隨即水洗。 （10）干燥、觀察：用吸水紙吸掉水滴，待各樣品標本片干后置顯微鏡下（×40）觀察。

1.3.2 粗蛋白質含量測定 采用凱氏定氮法對各樣品的粗蛋白質含量進行檢測，每個樣品重復3 次。

1.3.3 酸溶性蛋白質含量測定 酵母通過自溶或外源酶水解破壁后，細胞中的大分子蛋白質會變成小分子蛋白質、多肽、小肽和游離氨基酸。上述小分子的含氮物質會通過破壁孔釋放到酵母細胞外，溶解在各類介質中，因此通過測定溶解在各類介質中的蛋白質含量可以評估酵母水解物破壁程度。可溶性蛋白質指標包括：水溶性蛋白質、酸溶性蛋白質和堿溶性蛋白質。 本實驗采用酸溶性蛋白質檢測法。 具體操作如下：分別稱取酵母粉、自溶酵母、外源酶解酵母樣品1.00 g（精確至0.001 g），加入到不同的50 mL 潔凈容量瓶中，然后向每個容量瓶中加入15%三氯乙酸溶液，振蕩使樣品溶解，定容。參照“GB/T 22492 附錄B”中“酸溶蛋白質含量的測定”方法完成后續操作及檢測。

1.3.4 氨基酸態氮含量測定 飼料行業檢測可溶性氮含量的方法主要有：氨基酸態氮檢測法和游離氨基酸檢測法。前者采用化學滴定的方法檢測樣品中以游離的氨基形式存在的氮含量，后者采用高效液相色譜法（HPLC）檢測樣品中的游離氨基酸含量。 本實驗采用氨基酸態氮檢測法，按現行國家標準GB 5009.235 第一法執行。具體操作如下：分別稱取酵母粉（Y1、Y2、Y3）、自溶酵母（A1、A2、A3）、外源酶解酵母（E1、E2、E3）樣品各5.0 g（精確至0.01 g），加入到不同的50 mL 潔凈燒杯中，用純水分數次洗滌至100 mL 容量瓶中，振蕩使樣品充分溶解，定容。 參照“GB 5009.235第一法酸度計法” 完成后續操作及檢測，每個樣品重復3 次。

1.4 數據處理與統計分析 試驗數據采用Excel進行預處理，以“平均數±標準差”表示，采用SPSS 18.0 統計軟件中one-way ANOVA 進行單因素方差分析，差異顯著性用Duncan 氏多重比較法，以P ＜0.05 作為差異顯著性的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 光鏡顯微觀察 酵母粉、自溶酵母、外源酶解酵母樣品的革蘭氏染色法檢測結果顯示 （圖1～圖3）：未破壁的酵母粉、通過自溶破壁的自溶酵母、 通過外源酶催化水解破壁的外源酶解酵母的顏色存在明顯差異，酵母粉（Y1-Y3）樣品均顯示為結晶紫與碘復合物的紫色； 自溶酵母 （A1-A3）均顯示部分酵母為紫色、部分酵母為無色；外源酶解酵母（E1-E3）都是無色，只有極個別酵母為紫色。光鏡顯微觀察結果表明，革蘭氏染色法檢測可以區分酵母是否破壁， 但該方法無法對酵母的破壁程度做定量分析， 需要結合理化指標檢測結果進一步判定。

2.2 粗蛋白質、酸溶性蛋白質、氨基酸態氮含量由表1 可知， 相同菌種和發酵工藝制備的酵母粉、自溶酵母、外源酶解酵母的粗蛋白質含量無顯著差異（P ＞0.05）；外源酶解酵母的酸溶蛋白質、氨基酸態氮含量均顯著高于自溶酵母和酵母粉（P ＜0.05）；自溶酵母的酸溶蛋白質、氨基酸態氮含量顯著高于酵母粉（P ＜0.05）。 本實驗結果表明， 自溶法和外源酶解法有助于酵母破壁，酸溶蛋白質和氨基酸態氮可以評估酵母破壁后理化指標的變化。

表1 不同樣品的粗蛋白質、可溶性蛋白質、可溶性氮含量%

3 討論

酵母細胞中富含蛋白質、 核酸、B 族維生素、酵母細胞壁多糖及其他生理活性物質， 這些有效成分主要存在于酵母細胞內或者是酵母細胞結構中。 許樂樂等（2015）通過光學顯微鏡對活性干酵母和啤酒酵母粉的細胞形態進行了觀察， 指出活酵母和死的啤酒酵母粉在細胞飽滿度和光澤度上有明顯區別； 其借鑒改良后的革蘭氏染色法觀察酵母水解物、啤酒酵母粉和活性干酵母，發現酵母的不同組織呈現出不同的顏色， 可用于區別酵母水解物與酵母細胞壁， 但不能將酵母是否破壁進行明顯的區分。 本實驗通過將革蘭氏染色法進行適當改進后， 可以明顯區別未破壁的酵母粉和已破壁的外源酶解酵母， 但不能判斷自溶酵母的破壁程度。

姚曉紅等（2007） 對酵母自溶條件的研究表明， 自溶破壁可以使酵母釋放出游離氨基酸和可溶性蛋白； 而采用添加不同的外源酶對酵母破壁的研究表明， 相比于自溶破壁可以獲得更高的游離氨基酸、氨基酸態氮和可溶性蛋白質含量（崔春等，2017；羅龍娟等，2014；許維娜等，2013）。 徐耀文等（2013）通過外源酶將酵母破壁得到呈味核苷酸，郭莎莎（2012）通過酶解酵母細胞得到生物活性肽， 酶解破壁使酵母可以得到更多的營養物質和活性物質。本研究結果也表明，通過添加外源酶進行酵母細胞破壁的方式優于自溶破壁。

酵母自溶或外源酶解破壁會使樣品中游離氨基酸、氨基酸態氮、可溶性蛋白、酸溶性蛋白含量等升高（蘇星等，2019；徐那等，2015）。從本實驗結果“酸溶蛋白質/粗蛋白質”指標可以發現，外源酶解酵母的酸溶蛋白質含量接近粗蛋白質的含量，說明添加外源酶催化水解的方式能夠使酵母細胞破壁酶解更充分，獲得更多的肽和游離氨基酸（按照“GB/T 22492”附錄B 定義，酸溶蛋白含量為樣品中小分子的肽和游離氨基酸的總和）。近來的動物應用研究也表明， 酵母自溶或酶解后得到的肽是對動物非常重要的營養成分（蔡大亮等，2017；袁明鳳等，2016；楊凡等，2016；賀淼等，2013）。

4 結論

采用革蘭氏染色法可以明顯區分酵母是否破壁， 通過檢測酸溶蛋白質含量和氨基酸態氮含量可以評估酵母產品的破壁程度，可作為飼料行業對破壁酵母類產品進行品控的評判依據。