髓源抑制性細胞在苯并芘誘導的肺慢性炎癥至肺癌發生發展中的變化

劉婉玉，寧春紅，高基民

(溫州醫科大學檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

肺癌是全世界范圍內發病率和死亡率最高的癌癥之一[1]，85%的肺癌是由吸煙導致的[2]。苯并芘(benzoapyrene，B[a]P)是煙草煙霧的主要成分之一，是重要的完全致肺癌多環芳烴類化合物[3-4]，存在于煤焦油、石油、木材等燃燒產生的煙氣，香煙煙霧、汽車尾氣和焦化、煉油、塑料等工業污水中，在肺癌的發生中扮演著重要的角色[4]。已有研究證實，通過皮下注射或氣管灌注苯并芘可誘導小鼠肺部發生腫瘤，吸入多環芳烴污染物可導致肺癌發生率升高。炎癥是重要的腫瘤特性之一[5-6]，慢性炎癥與腫瘤的發生發展密切相關，主要包括促進腫瘤惡變、腫瘤細胞的增殖與侵襲、腫瘤組織血管的生成[7]。慢性炎癥可以破壞免疫系統識別惡變前細胞的能力，通過多種機制促進多種類型腫瘤的起始和進展[8]。其中，炎癥細胞通過釋放多種細胞因子、趨化因子來調節肺慢性炎癥微環境，促進支氣管上皮細胞轉化并逐步發展到癌前病變及癌轉移，在肺癌的發生、發展中起著重要作用。因此，探究肺癌發生發展過程中免疫微環境相關免疫細胞及細胞因子的動態變化及作用，有望通過改善炎癥組織微環境，為肺癌的早期預防和免疫治療提供新策略。在該過程中，免疫微環境可誘導髓源抑制性細胞(特異性免疫抑制細胞)的產生，抑制宿主的抗腫瘤免疫反應，在腫瘤相關的免疫抑制方面起著重要的作用[9]。髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一種異質性的細胞群體，由未成熟的巨噬細胞、粒細胞、樹突狀細胞和其他早期分化的髓系細胞組成，在小鼠中的特異性表面標志為CD11b+Gr-1+[10]，是一種重要的機體免疫調節細胞，其免疫抑制功能主要是通過各種效應分子來調節。MDSCs在癌癥、慢性感染及由細菌引起的感染性疾病和自身免疫性疾病的發生發展過程中都起著重要的作用[11]。盡管在大多數癌癥小鼠模型中都發現有MDSCs的積累，但在慢性炎癥至肺癌發生發展動態過程中對MDSCs的研究較少。因此，本研究利用苯并芘誘導KM小鼠，構建肺慢性炎癥和肺癌模型[12]，通過免疫組織化學、流式細胞術對小鼠肺組織和脾臟中MDSCs數量變化進行檢測，同時結合臨床肺組織標本進一步驗證MDSCs在肺癌病人肺組織中的表達情況，旨在探討MDSCs在苯并芘誘導的小鼠肺慢性炎癥至肺癌發生發展過程中的變化及作用，不僅有助于肺慢性炎癥和肺癌的有效防治，而且為臨床采用其相關拮抗劑對肺慢性炎癥的治療和肺癌的預防提供了適宜的動物模型和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

SPF級雄性昆明小鼠，購自上海斯萊克動物實驗中心，引進飼養在溫州醫科大學動物實驗中心，6～8周齡，體重(60±5)g。臨床肺組織標本：癌、癌旁、正常組織石蠟塊取自溫州醫科大學第一附屬醫院病理科。

1.1.2 試劑

苯并芘購自中國阿達瑪斯試劑有限公司；玉米油購自美國Sigma公司；CD11b、Gr-1流式抗體購自美國BioLegend公司；免疫組化Gr-1抗體購自美國eBioscience公司；免疫組化CD33抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

將60只SPF級昆明種小鼠，置于室溫25 ℃，相對濕度55%，12 h明暗交替的環境中飼養，自由飲水。適應7 d后，將小鼠隨機分成2組，經右側胸壁穿刺肺內注射，對照組給予50 μL玉米油，處理組給予50 μL苯并芘-玉米油溶液(苯并芘濃度為20 mg·mL-1)，每周處理1次，共4次。每日觀察小鼠飲食、排便、毛色、精神和活動狀況。分別在處理后30、90、180 d處死小鼠，采取小鼠肺、脾臟組織以供檢測。

1.3 樣品測定

1.3.1 小鼠肺組織形態觀察

將小鼠肺組織取出，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片，HE染色，光鏡下觀察組織細胞形態改變，比較炎癥細胞浸潤程度及腫瘤細胞浸潤情況。

1.3.2 小鼠肺組織Gr-1、臨床肺組織標本CD33的表達情況

將小鼠肺組織取出，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片，經免疫組織化學兩步法(脫蠟復水、抗原修復、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、脫水、透明、封片)染色，光鏡下觀察不同視野細胞染色數目及程度。臨床肺組織標本：癌、癌旁、正常組織石蠟塊連續切片，染色、觀察方法同上。

1.3.3 MDSCs浸潤情況

將小鼠肺組織和脾臟取出，研磨消化制成單細胞懸液，200目尼龍膜過濾，Anti-CD11b-APC、Anti-CD11b-FITC、Anti-Gr-1-PerCP-Cy5.5、Anti-Gr-1-PE-Cy7流式抗體染色，4 ℃避光孵育30 min，IMDM培養基清洗3遍，上機分析。

1.4 數據分析

Gr-1表達的半定量分析用IPP6.0軟件，數據用GraphPad Prism5.0軟件進行t檢驗分析，ns表示差異不顯著(P>0.05)，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 小鼠肺組織細胞形態

小鼠右側肺組織切片如圖1。如圖所示，相較于對照組小鼠，處理組小鼠肺組織出現了明顯的炎癥反應和病理改變，且隨著暴露時間延長炎癥反應和病理改變逐漸明顯。苯并芘暴露180 d后，小鼠肺組織出現大量異型細胞，且伴有大量炎癥細胞浸潤，肺組織的正常生理結構消失改變，出現肺癌組織病理特征。對照組小鼠肺泡腔、毛細血管及終末細支氣管均無明顯的結構異常。

圖1 小鼠肺組織的切片(400×)

2.2 小鼠肺組織Gr-1的表達情況

Gr-1是髓系分化狀態細胞表達的蛋白，MDSCs是髓源抑制性細胞，在小鼠中其表面標志為CD11b+Gr-1+。本研究以Gr-1為MDSC的標志蛋白進行免疫組織化學染色，不同處理組小鼠肺組織Gr-1的表達及定位情況代表圖見圖2，不同處理對小鼠肺組織Gr-1表達水平的影響差異見圖3。如圖所示，苯并芘暴露后，Gr-1主要位于支氣管黏膜上皮、肺泡上皮細胞核中，陽性染色為棕黃色；苯并芘暴露30、90、180 d后，小鼠肺組織中Gr-1的染色強度均明顯高于對照組，并隨暴露時間的延長逐漸增強，且具有統計學意義。研究結果表明，MDSCs很有可能參與了苯并芘誘導小鼠肺慢性炎癥至肺癌的發生發展。

圖2 不同處理小鼠肺組織Gr-1的表達及定位

圖3 不同處理小鼠肺組織Gr-1表達水平

2.3 小鼠肺組織中MDSCs浸潤情況

不同處理組小鼠肺組織中MDSCs表達流式細胞圖見圖4，不同處理對小鼠肺組織MDSCs表達水平的影響差異見圖5。如圖所示，苯并芘暴露后30、90、180 d小鼠肺組織中MDSCs百分比相比玉米油對照組顯著增加，且與玉米油對照組相比差異均具有統計學意義。研究結果表明，MDSCs在苯并芘誘導的肺慢性炎癥至肺癌的發生發展中可能發揮重要作用。

a—玉米油暴露30 d；b—玉米油暴露90 d；c—玉米油暴露180 d；d—苯并芘暴露30 d；e—苯并芘暴露90 d；f—苯并芘暴露180 d。圖4 不同處理小鼠肺組織MDSCs流式細胞

2.4 小鼠脾臟中MDSCs浸潤情況

脾臟是機體最大的免疫器官，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞。不同處理組小鼠脾臟中MDSCs表達流式細胞圖見圖6，不同處理對小鼠脾臟中MDSCs表達水平的影響差異見圖7。如圖所示，苯并芘暴露180 d時，MDSCs百分比顯著增加；苯并芘暴露30、90、180 d時，小鼠脾臟中MDSCs百分比相比玉米油對照組顯著增多。

a—玉米油暴露30 d；b—玉米油暴露90 d；c—玉米油暴露180 d；d—苯并芘暴露30 d；e—苯并芘暴露90 d；f—苯并芘暴露180 d。圖6 不同處理小鼠脾臟MDSCs流式細胞

圖7 不同處理小鼠脾臟MDSC細胞水平

2.5 肺癌組織中CD33的表達情況

目前人體內的MDSCs表型尚未明確統一，不同腫瘤類型中的MDSCs具有異質性。最常見的癌癥患者體內分離出來的MDSCs表型為CD11b+CD14-，此外還有CD33+、CD34+、CD15+和MHC-Ⅱ類分子HLA-DR-等標志。有報道稱,肺癌患者體內MDSCs(CD33+HLA-DR-CD11b+Lin-)的含量與其分期有關，Ⅳ期腫瘤患者伴有遠處轉移時體內MDSC的含量明顯增高。因此，本研究以CD33作為MDSCs的標志物，來進一步驗證MDSCs在肺癌病人肺組織中的表達情況。本研究選取了25例肺腺癌臨床標本，與其對應的癌旁標本13例、正常標本11例，免疫組織化學染色檢測CD33表達的情況。如圖8所示，CD33定位于細胞膜，細胞質中也有少量表達，大部分表達于癌巢間正常細胞。MDSCs細胞核較大，為腎形和馬蹄形，胞漿豐富，細胞形態不規則，呈現出髓系前體細胞形態，于包膜部位呈現不同程度的棕黃色。正常組織(陽性比率0/11)和癌旁組織(陽性比率1/13)基本無陽性染色，而肺癌組織(陽性比率14/25)中CD33陽性染色程度升高。臨床標本研究表明，相比正常和癌旁組織(基本陰性表達)，肺癌組織中MDSCs出現了不同程度的表達，可能在肺癌的發生發展中起著作用。

圖8 人正常肺組織、癌旁組織和肺腺癌CD33的表達

3 討論

多環芳香碳氫化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)及其衍生物與肺癌的發生密切相關。已有研究證實，香煙中有60多種致癌化合物，其中B[a]P及其代謝產物B[a]PDE(B[a]P在細胞內通過細胞色素P450代謝生成)是香煙中最為明確的重要致肺癌化合物，主要存在于煤焦油、香煙煙霧、汽車尾氣和工業廢氣污水中，可應用于多種動物模型中，用于多種腫瘤的研究。近年來，許多相關文獻報道B[a]P與許多癌癥密切相關，已經證明B[a]P能誘發皮膚癌、肺癌和胃癌等多種癌癥。B[a]P能通過多種途徑誘導肺癌，并且常用小鼠來建立肺癌動物模型，便于直接觀察肺慢性炎癥至肺癌的動態演變過程和肺癌發生發展過程的形態變化。已有文獻報道B[a]P與肺癌之間存在著密切聯系，并通過霧化吸入、腹腔注射、灌胃等多種方法成功構建動物的肺癌模型[13]。本研究將B[a]P溶入玉米油中，采用經胸壁穿刺肺內直接注射的方法構建小鼠肺癌模型，該方法創傷小，不易造成氣胸，小鼠恢復快，且定位準確。

肺癌組織學表現復雜多樣，總體可以分為小細胞肺癌(small cel lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中非小細胞肺癌占80%。臨床上將肺癌組織分為鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌3類。80%～90%的非小細胞肺癌與煙草煙霧直接相關，而小細胞肺癌幾乎都與吸煙有關[14-15]。肺上皮細胞經B[a]P誘導后，既可以發展為鱗癌、腺癌，也可以發展為未分化細胞癌。一般動物模型可以同時出現肺鱗癌、腺癌和未分化癌，這種現象類似于臨床肺癌。因此，本研究構建的小鼠肺癌模型不僅適用于研究肺癌的發病機制，也能用于評價肺癌的化療、放療方案及預后判斷。本研究應用的小鼠肺組織經病理學診斷，根據B[a]P誘導的小鼠肺慢性炎癥至肺癌模型中30、90、180 d的肺組織病理變化，可以明確判定小鼠可由肺慢性炎癥發展為肺腺癌，為后續研究奠定了基礎。

慢性炎癥以持續的免疫細胞招募和炎性介質產生為主要特征，與癌癥之間存在密切關系。越來越多的研究表明，肺慢性炎癥與肺癌的發病機制相關。人類肺癌的發生主要是由慢性炎癥淋巴細胞和髓源性細胞的浸潤，以及免疫反應的改變導致。在荷瘤宿主中，有多種不同的免疫抑制細胞，構成了一個免疫抑制網絡[16-17]。在不同功能的免疫抑制細胞中，CD11b+Gr-1+髓系起源細胞被認為是一種重要的免疫抑制細胞[18]。髓源抑制性細胞(MDSCs)是一種重要的調節免疫反應的異質性的細胞群體，由未成熟的巨噬細胞、粒細胞、樹突狀細胞和其它早期分化的髓系細胞組成，對腫瘤逃脫免疫反應做出了重要的貢獻[19]。MDSCs是髓源抑制性細胞，其在小鼠中的特異性表面標志為CD11b+Gr-1+[20]，主要包括單核系monocytic MDSCs(M-MDSCs，表型為CD11b+Ly6G-Ly6Chigh)和粒系granulocytic MDSCs(G-MDSCs，表型為CD11b+Ly6G+Ly6Clow)[21]。MDSCs通過抑制機體固有免疫系統和適應性免疫系統的能力抑制了宿主的抗腫瘤免疫反應，由于其具有免疫抑制功能近年來受到廣泛關注。Gr-1是髓系分化狀態細胞表達的蛋白。本研究通過構建小鼠肺癌模型、HE染色、免疫組化、流式細胞術等方法，研究了MDSCs在B[a]P誘導小鼠肺慢性炎癥至肺癌發生發展過程中的關鍵作用。結合臨床肺癌標本進一步驗證MDSCs在肺癌病人肺組織中的表達情況，提示MDSCs可能在肺癌的發生發展中起著關鍵作用。在此研究基礎之上，未來可對MDSCs在肺慢性炎癥至肺癌發生發展過程中的具體分子機制做進一步研究，這對臨床上將其作為治療靶點，有針對性地對肺慢性炎癥進行治療及預防，從而對肺癌的早期預防起著重要的作用。