融合魏斯氏菌胞外多糖的分離純化及其生化特性

姜 靜，杜仁鵬，郭尚旭，趙 丹,

（1.黑龍江大學生命科學學院，微生物省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的一種天然高分子聚合物，具有分子質量大、黏度大、結構復雜多樣等特點[1]。乳酸菌具有公認安全無毒的特性，廣泛用于食品、醫藥、化工等領域[2]。 乳酸菌EPS具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節和降血糖等功能，具有開發成益生元的潛力，還可以作為增稠劑、穩定劑等改善或增強乳制品的口感和流變學特性[3]。

根據合成位置不同，乳酸菌EPS可以分為莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）和黏多糖（slime polysaccharides，SPS），但這兩種多糖因為結合在一起很難區分而統稱為EPS。從化學組成上，乳酸菌EPS可分為同型多糖（homopolysaccharides，HoPS）和異型多糖（heteropolysaccharides，HePS）[4]。能夠產EPS的乳酸菌主要包括：鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等[5]。研究表明，由于菌種來源、培養條件和分離純化方法等不同，使得EPS的分子質量、單糖組成、結構產生較大差異，進而影響EPS的功能特性。此外，由于乳酸菌EPS的產量較低，提取成本相對較高，無法滿足大規模工業生產的需求。目前高產乳酸菌EPS菌種資源相對匱乏，從而限制其廣泛的開發和應用。傳統發酵食品被認為是分離具有特殊功能特性物質最好的來源[6]。因此，分離篩選能夠穩定產生EPS的乳酸菌，并通過優化提高EPS的產量，進而分離純化EPS，明確其理化性質和分子結構，為解析EPS結構與功能的關系及進一步開發EPS產品提供參考，具有重要的意義。本實驗利用微生物學方法從自制發酵水果中分離篩選高產EPS的乳酸菌，并對EPS進行分離純化，研究其部分理化性質，其結果不僅豐富了EPS菌株來源，還可以為EPS的功能特性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北甜瓜購自哈爾濱南崗哈達批發市場。

質粒小量提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 TIANGAN股份有限公司；API 50 CHL鑒定試劑條 法國生物梅里埃公司。

MRS培養基（100 mL）：葡萄糖2 g、酵母提取物0.5 g、牛肉膏1 g、胰蛋白胨1 g、K2HPO40.2 g、檸檬酸銨0.2 g、無水乙酸鈉0.5 g、MnSO4g H2O 0.025 g、MgSO4g 7H2O 0.058 g、吐溫-80 0.1 mL，用于乳酸菌的的活化及培養；產糖培養基（MRS-S）：用蔗糖取代MRS培養基中的葡萄糖。

1.2 儀器與設備

Alpha-1900Plus紫外-可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司；BX43生物顯微鏡 奧林巴斯（深圳）工業有限公司；SM20＋3140B體視鏡 北京泰克儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將200 g東北甜瓜切成小塊裝入無菌500 mL三角瓶中，向其加入300 mL無菌水，密封，于30 ℃條件下靜置5 d。

1.3.2 產EPS乳酸菌的分離

取2 mL水果發酵液，采用稀釋倒平板法[7]利用涂布棒將稀釋液均勻涂布于含CaCO3的MRS平板上，于30 ℃培養箱中倒置培養48 h后。挑取具有溶鈣圈的單菌落接種于30 mL MRS-S液體培養基中，30 ℃靜置培養36 h后，利用苯酚-硫酸法測定EPS質量濃度，篩選得到高產EPS乳酸菌。

1.3.3 高產EPS乳酸菌的鑒定

利用體視鏡和顯微鏡觀察高產EPS乳酸菌的菌落和菌體形態特征。利用API 50 CHL鑒定試劑條鑒定菌株的糖發酵特性。以模式菌株Weissella hellenicaNCFB 2973（CGMCC 1.2513）為陽性對照，鑒定高產EPS乳酸菌的生理生化特性[8]，如葡萄糖產酸產氣實驗、氧化酶實驗、過氧化氫酶實驗、酯酶和脲酶實驗、明膠液化實驗、淀粉水解實驗、精氨酸水解實驗。

根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書的方法，提取高產EPS乳酸菌基因組DNA。以DNA為模板，按照Du Renpeng等[7]的方法，利用引物5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’和5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’[9]，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR產物經質量分數1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，利用DNA純化回收試劑盒回收目的片段并測序。測序所得的16S rDNA序列校對后，與美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank數據庫進行BLAST分析，根據序列同源性，選取不同的菌株，采用MEGA 5.0軟件的UPGMA法構建系統發育樹，確定菌株的種屬關系。

1.3.4 EPS的分離及純化

將種子液以體積分數2%的接種量接種于300 mL產糖培養基中，30 ℃靜止培養48 h后，將發酵液于4 ℃、4 000hg條件下離心60 min，取上清液。根據Du Renpeng等[10]的方法，向上清液中加入3 倍體積預冷的體積分數95%乙醇溶液，4 ℃過夜沉淀后，12 000hg離心收集沉淀，之后溶于50 mL去離子中，并加入10 g/100 mL三氯乙酸（50 mL），4 ℃充分攪拌4 h后，4 ℃、12 000hg離心40 min，去除蛋白沉淀。取上清液，向其中再次加入3 倍體積預冷的體積分數95%乙醇溶液，過夜沉淀后，4 ℃、12 000hg離心40 min收集EPS沉淀，并溶于50 mL去離子中，將多糖溶液裝入截留分子質量為14 000 Da的透析袋中，4 ℃透析2 d，每8 h換一次水。利用Sephadex G-100凝膠過濾層析柱對透析后的樣品進一步純化，上樣后，用流速為1 mL/min的去離子水在室溫下洗脫EPS，每5 mL收集一管，利用苯酚-硫酸法[11]測定EPS質量濃度，合并含EPS的試管，冷凍干燥處理24 h，得到EPS純品。

1.3.5 總糖、蛋白質、糖醛酸質量分數的測定

總糖質量分數的測定根據苯酚-硫酸法；蛋白質量分數測定根據Bradford蛋白質染料結合法[12]；糖醛酸質量分數測定根據硫酸-咔唑法[13]。

1.3.6 EPS溶解性和持水力的測定

EPS溶解度的測定參照Wang Zhaomei等[14]的方法并作適當的改動。稱取45 mg EPS置于2 mL離心管中，加入0.5 mL超純水，在漩渦振蕩器上振蕩2 h使EPS充分溶解。12 000hg離心40 min沉降未溶解部分，收集沉淀冷凍干燥，稱質量。

多糖持水率（water holding capacity，WHC）參照Wang Ji等[15]的方法，并稍作改動。將EPS研磨成粉末置于95 ℃烘箱中烘干4 h。準確稱取45 mg EPS置于2 mL離心管中，加入0.5 mL去離子水，充分溶解EPS。12 000hg離心40 min沉降未溶解部分，收集未溶解部分用濾紙小心擦掉表面水分稱質量，記為m1。將沉淀冷凍干燥后稱質量，記為m2。WHC根據式（1）計算。

1.3.7 EPS乳化能力測定

根據Kanamarlapudi等[16]的方法，分別取2.5 mL汽油、柴油、煤油、椰子油、橄欖油、葵花油、大豆油、苯和己烷與2.5 mL 50 mg/mL的EPS溶液振蕩混勻，于4 ℃條件下靜置12 h后，利用游標卡尺測定乳化層的高度，根據式（2）計算乳化率。

1.3.8 EPS抑菌能力測定

根據牛津杯實驗[17]，以大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella castellani）和銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）為指示菌，取100 μL質量濃度為50 mg/mL和100 mg/mL的EPS溶液分別加入到抑菌孔中，在最適溫度下培養12 h后，利用游標卡尺量取抑菌圈直徑。

1.3.9 抗氧化活性的測定

1.3.9.1 總還原力的測定

將不同質量濃度的EPS溶液1 mL與磷酸鹽緩沖液2.5 mL和鐵氰化鉀溶液2.5 mL充分混合，50 ℃反應20 min后，隨即加入三氯乙酸2.5 mL，4 000hg離心30 min。取上清液2.5 mL與FeCl3溶液0.5 mL和去離子水2.5 mL充分混勻，反應10 min后，以VC為陽性對照，測定反應混合物的OD700nm，以OD700nm表示總還原力[18]。

1.3.9.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定

將不同質量濃度EPS溶液1 mL與Tris-HCl緩沖液3 mL充分混勻，25 ℃靜置20 min后，加入鄰苯三酚溶液0.3 mL，充分混勻，25 ℃反應5 min后，隨即加入濃鹽酸1 mL，混勻后，以VC為陽性對照，測定反應混合物的O。根據公式（3）計算超氧陰離子自由基（）的清除能力。

式中：A0為加入鄰苯三酚后的吸光度；A1為終反應吸光度；A2為只加入Tris-HCl緩沖液的吸光度。

1.3.9.3 羥自由基清除能力的測定

將不同質量濃度EPS溶液1 mL和水楊酸-乙醇溶液1 mL以及FeSO4溶液1 mL充分混勻，之后再加入H2O2溶液1 mL，37 ℃靜置反應40 min后，以VC為陽性對照，測定混合物的。根據公式（4）計算羥自由基（?OH）的清除能力。

式中：A0為以水為對照的吸光度；A1為與?OH反應后的吸光度；A2為以水代替H2O2溶液的吸光度。

1.3.9.4 DPPH自由基清除能力的測定

將不同質量濃度的EPS溶液2 mL和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）-乙醇溶液2 mL充分混勻，于暗處反應30 min后，以VC為陽性對照，測定反應物的。根據公式（5）計算DPPH自由基的清除率。

式中：A0為以水為對照的吸光度；A1為與DPPH自由基反應后的吸光度；A2為樣品溶液的吸光度，即以水代替DPPH溶液，排除樣品本身吸光度對結果的影響。

1.4 數據統計與分析

每個實驗處理均設置3 個重復，數據以平均值±標準差形式表示。利用JMP（Version 9.0.2）軟件進行方差分析及多重比較，統計檢驗的顯著水平設定為0.05。

2 結果與分析

2.1 高產EPS乳酸菌的分離與鑒定

本研究從水果發酵液中共分離得到6 株利用蔗糖產生EPS的乳酸菌，其中菌株H2產EPS的質量濃度高于其他5 株菌，在發酵液中的質量濃度為（40.21f 3.63）g/L，并顯著高于W. confuseKR780676 EPS（17.2 g/L）[22]。在MRS培養基上，菌株H2的菌落為乳白色、不透明、凸起、近圓形、邊緣整齊、表面光滑。在MRS-S培養基上，菌落較大，表面附著大量黏性液體。顯微鏡下，該菌體呈串珠狀、無鞭毛、不運動、不產芽孢、革蘭氏染色陽性。同模式菌株W. hellenicaNCFB 2973（CGMCC 1.2513）一樣，菌株H2能夠利用葡萄糖產酸產氣，氧化酶實驗、過氧化氫酶實驗、酯酶和脲酶實驗、精氨酸水解實驗、明膠液化、淀粉水解實驗均呈陰性。API 50 CHL實驗結果如表1所示，通過對49 種碳水化合物的代謝情況分析，可以對細菌在種水平進行鑒定，結果表明該菌株的發酵特征與Weissella保持一致。16S rDNA序列分析表明，菌株H2部分序列長為1 436 bp，與該序列相似性較高的相關菌株均為Weissella細菌。將菌株序列與NCBI數據庫進行比對，結果表明該菌株與多株W. confuse基因序列的親緣關系最近，相似性達到99%（圖1）。結合H2生物學特性和生理生化結果分析，將H2鑒定為W. confusa，并命名為W. confusaH2。將序列提交NCBI，獲得登錄號為MG560152.1。

表 1 菌株H2 API 50 CHL發酵實驗結果Table 1 API 50 CHL fermentation profiles of strain H2

圖 1 利用16S rDNA序列對菌株H2進行構建系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree for H2 based on 16S rDNA sequences

2.2 EPS的分離純化及化學組成分析結果

表 2 H2 EPS純化結果Table 2 Purification of EPS from strain H2

H2發酵液經離心除菌體、三氯乙酸去蛋白、乙醇沉淀EPS等步驟后，葡聚糖凝膠Sephadex G-100層析柱對粗EPS進行純化，得到純EPS樣品，樣品洗脫圖展現出單一對稱峰，表明H2 EPS是一種分子質量相對均一的組分，純度較高。如表2所示，經純化后，H2 EPS的質量濃度為（26.92f 2.15）g/L，得率為（66.95f 0.67）%。該EPS樣品在水中呈半透明黏稠狀，經冷凍干燥后，呈現白色棉花狀固體。

總糖、蛋白質、糖醛酸質量分數分別為（93.67f 2.08）%、 （0.32f 0.01）%和（6.01f 0.34）%。其中糖醛酸質量分數高于Leu. mesenteroidesDRP105EPS[17]，蛋白質量分數低于Leu. pseudomesenteroidesGX-3 EPS[23]。

2.3 EPS溶解性、持水率及乳化性

表 3 H2 EPS對油類和烴類化合物的乳化能力Table 3 Emulsifying activity of H2 EPS with different vegetable oils and hydrocarbons

H2 EPS的溶解率和持水率分別為（98.78f 1.37）%和（426.03f 7.26）%，顯著高于Leu. pseudomesenteroidesYF32 EPS[24]和Leu. citreumB2 EPS[25]。持水率高通常溶解度也高，較高的吸水率和持水率是由于多糖復雜的結構，以及EPS中含有大量羥基的葡萄糖單元。

乳化劑能夠將兩種不相溶解的液相體系在一定程度上進行分散，更好地保持兩種溶劑間的穩定性，在化學、食品、醫藥及石油等領域有十分廣泛的應用[26]。如表3所示，隨著時間延長，H2 EPS對有機溶劑的乳化作用增強，在24 h時，乳化率從大到小分別為己烷＞大豆油＞煤油＞葵花油＞苯＞汽油＞椰子油＞柴油＞橄欖油，其中對己烷和大豆油的乳化率分別為（78.28f 1.73）%和（73.23f 2.40）%。此結果與Streptococcus thermophilusCC30 EPS[16]和Lactobacillus rhamnosusEPS[27]一樣，均展現出良好的乳化能力。

2.4 EPS抑菌能力分析

表 4 H2 EPS的抑菌能力Table 4 Antibacterial activity of H2 EPS

以E. coli、Salmonella、St. aureus、S. castellani和P. aeruginosa為指示菌，考察H2 EPS的抑菌活性。如表4所示，H2 EPS具有良好的抑菌活性，對指示菌的抑制能力從大到小依次為P. aeruginosa＞E. coli＞S. castellani＞St. aureus，不能抑制Salmonella，且抑制能力隨著H2 EPS質量濃度的升高而逐漸增強。Yu Youjin等[28]研究W. cibaria27 EPS的抑菌能力發現，該EPS同樣可以有效抑制P. aeruginosa、E. coli和St. aureus。研究表明，由于來源、分子質量及結構不同，使得EPS具有不同的抑菌特性，尤其是EPS中含有的硫酸鹽離子可以通過螯合作用吸附培養基中的金屬離子、微量元素及營養物質，使得指示菌因營養條件匱乏而死亡[29]。因此可以看出，HD2 EPS具有良好的抑菌活性，具有開發成生物防腐劑的潛力。在接下來的研究中，應重點考察HD2 EPS的結構，探究其抑菌機理。

2.5 H2 EPS的抗氧化活性

2.5.1 總還原力

圖 2 H2 EPS總還原力Fig. 2 Reducing power of H2 EPS

如圖2所示，隨著質量濃度的升高，H2 EPS和VC的總還原力呈現先急速上升后穩定的趨勢，但H2 EPS的總還原力始終低于VC。在質量濃度為5 mg/mL時，H2 EPS的總還原力為1.32f 0.13，顯著高于Leu. mesenteroidesGX-3 EPS[23]和Pediococcus pentosaceusSR2-2 EPS[30]。研究表明，具有還原力的化學物質可以提供氫原子來阻斷過氧化物的形成，進而破壞自由基反應鏈，展現抗氧化能力[31]。

圖 3 H2 EPS對的清除作用Fig. 3 Superoxide anion radical scavenging capacity of H2 EPS

由圖3可知，清除率隨著H2 EPS和VC質量濃度的增大，呈現先急速升高后保持平穩的變化趨勢，在質量濃度為5 mg/mL時，H2 EPS和VC對的清除率達到最大，分別為（97.34f 2.31）%和（58.46f 1.72）%。葉廣彬等[23]研究EPS對清除能力發現，在質量濃度為5 mg/mL 時，清除率大于70%，高于本研究中的EPS清除效率。能夠與大量生物活性分子發生化學反應，使得DNA、蛋白質、脂質等發生氧化損傷。因此可以看出，H2 EPS對具有顯著的清除活性，可以作為添加劑減小對機體的損傷程度。

2.5.3 對?OH的清除作用

圖 4 H2 EPS對?OH的清除作用Fig. 4 Hydroxyl radical scavenging capacity of H2 EPS

如圖4所示，清除率隨質量濃度的增加呈現先升高后趨于穩定的趨勢，當質量濃度為5.0 mg/mL時， H2 EPS和VC對?OH的清除率分別為（42.56f 2.16）%和（94.34f 5.67）%。Ye Guangbin等[31]研究W. cibariaYB-1 EPS的抗氧化能力發現，EPS的抗氧化能力隨著質量濃度的增加而不斷升高，在質量濃度4 mg/mL時，?OH清除率為80%。此外，本研究結果與崔靜等[32]結果相一致，EPS6對?OH具有良好的清除作用。

2.5.4 對DPPH自由基的清除作用

圖 5 H2 EPS對DPPH自由基的清除作用Fig. 5 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging capacity of H2 EPS

如圖5所示，隨著H2 EPS質量濃度的增加，DPPH自由基清除率逐漸增大，但始終低于VC的清除率。當質量濃度為5 mg/mL時，H2 EPS對DPPH自由基的清除率為（48.45f 2.47）%。DPPH自由基是一類較為穩定的合成自由基，可以將其清除的化學物質具有較強的自由基清除能力。Ye Guangbin等[31]研究W. cibariaYB-1 EPS的抗氧化能力，結果表明，該EPS隨著質量濃度的增加，DPPH自由基清除能力逐漸升高，在5 mg/mL的時候，DPPH自由基清除率達到50%，與本研究中EPS對DPPH自由基清除率相似。

3 結 論

本實驗從自制水果發酵液中分離得到一株高產EPS的乳酸菌，經形態學鑒定、生理生化實驗和分子生物學實驗鑒定該菌株為W. confusa，并命名為W. confusaH2。以該菌株為出發菌株，進行發酵產EPS，并分離純化，得到高純度EPS，其產量為（40.21f 3.63）g/L。H2 EPS的溶解率和持水率分別為（98.78f 1.37）%和（426.03f 7.26）%。此外，H2 EPS具有良好的乳化性、抑菌性能和較高的抗氧化活性，且隨著質量濃度的增加而增強。因此，W. confusaH2發酵得到的EPS作為天然食品添加劑或抗氧化劑具有廣闊的應用和開發前景。