膠紅酵母生產生物活性物質研究進展

莊榮玉，王如晨，邱曉挺,，車嘉豪，李勇勇,2，張蔚筱，楊文鴿,2，史詠梅，吳祖芳,2

（1.寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800；2.浙江省動物蛋白食品精深加工重點實驗室，浙江 寧波 315800）

膠紅酵母屬于真菌界、雙核亞界、擔子菌門、柄銹菌亞門、微球黑粉菌綱、鎖擲酵母目、隱球酵母科、紅酵母屬。其細胞呈圓形或卵形，無性繁殖為多邊芽殖，無假菌絲；菌落呈紅色或橘紅色。膠紅酵母是腐生酵母，在生長過程中可以利用的營養素范圍較廣，能以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、廢糖蜜、玉米秸稈水解液、馬鈴薯提取物等多種碳水化合物為碳源，并能以氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉等多種無機氮及酵母膏、蛋白胨、三乙醇胺等有機氮為氮源[1-2]。

膠紅酵母廣泛分布于自然界：在土壤、動物、植物體內[3-7]、在污水處理系統中[8]、在江河、湖泊等淡水水域和含鹽的海洋環境均有膠紅酵母菌的存在[9-10]。有很多研究者從上述環境中分離出了膠紅酵母，并對其營養成分進行了分析，發現其細胞除了富含蛋白質、多糖等常規營養成分[11]，還含有類胡蘿卜素、蝦青素[12]、多不飽和脂肪酸[13]、VE和核苷酸等多種生物活性物質[5]。研究表明膠紅酵母能夠促進動物的消化吸收，提高其對飼料的利用率，是可以替代魚粉的優質飼料蛋白源，其細胞含有較高的類胡蘿卜素，作為水產養殖飼料添加劑時，能有效地促進個體生長、增強機體免疫力、提高動物的受精率和減少胚胎的病死率[14]。因此，膠紅酵母作為水產養殖餌料和飼料[14-16]及其他動物飼料已經有廣泛的應用。例如，毛俊霞[3]將膠紅酵母添加在斷奶仔豬日糧中，顯著提高了仔豬空腸淀粉酶和脂肪酶的活力，改善了仔豬腸道微生物區系；李貌[17]在蛋雞飼養日糧中添加膠紅酵母固態發酵產物，顯著提高蛋雞的采食量、產蛋質量、蛋黃的類胡蘿卜素含量，改善了蛋品質，提高了蛋雞免疫功能。

近年來，隨著對天然類胡蘿卜素、蝦青素抗氧化活性物質重要性的認識加深和應用范圍的擴大，較多研究者將分離到的膠紅酵母作為生產天然類胡蘿卜素的菌株。也有研究者發現一些膠紅酵母菌株的多不飽和脂肪酸含量較高，將其作為產油脂酵母菌株應用于制造生物柴油[18-19]。還有少數研究者將此菌的細胞作為特種酶的提取來源，例如，Lario等[9]從南極海藻中分離出一株海洋南極膠紅酵母L7，用于提取胞外酸性蛋白酶。Zimmer等[8]從污水中篩選出一株膠紅酵母saar1，提取出具有低溫活性的苯甲酰水解酯酶，將此酶用于醫藥、化妝品或精細化工行業苯甲?；衔锏暮铣?。總之，膠紅酵母在食品、醫藥、酶工業、農業用生防酵母[20-21]、飼料、環境保護[22-25]等領域已有廣泛應用，但是缺乏對其生產生物活性物質研究現狀的綜述。因此，本文重點介紹膠紅酵母在生產生物活性物質方面的研究進展，旨在為促進膠紅酵母的工業化應用的研究者提供參考。

1 膠紅酵母在生產抗氧化活性物質方面的應用研究

1.1 膠紅酵母合成類胡蘿卜素的途徑

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于自然界的重要色素，是C40的碳氫化合物（胡蘿卜素）和它們的氧化衍生物（葉黃素）兩大類色素的總稱，呈黃色、橙紅色或紅色。迄今為止已有700多種類胡蘿卜素被分離鑒定出來[26]， 常見的為番茄紅素、β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃素和蝦青素等。類胡蘿卜素具有很強的抗氧化活性，在人體內可以淬滅單線態氧、消除自由基、防止低密度脂蛋白氧化，避免細胞受到氧化損傷，具有很強的抗癌和抗腫瘤生理活性[27-28]，能夠顯著降低動脈硬化[29]等心腦血管疾病的發病率。類胡蘿卜素是脂溶性色素，除由植物合成以外，一些細菌、酵母和霉菌也具有合成類胡蘿卜素的能力。紅酵母屬的酵母菌（Rhodotorulaspp.） 都會產生類胡蘿卜素[30]。人類和動物不能合成類胡蘿卜素，必須通過攝取富含類胡蘿卜素的水果和蔬菜，經過消化吸收后才能利用。

膠紅酵母菌體內的類胡蘿卜素合成途徑如圖1所示，它是由萜類物質或異戊二烯經過一系列合成代謝反應而生成的。首先，通過縮合反應，3 個乙酰CoA分子生成了甲羥戊酸（mevalonate，MVA），MVA隨后經過磷酸酶和脫羧酶的催化，生成異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），即類胡蘿卜素的前體物質。經過一系列合成酶的催化作用，IPP形成了八氫番茄紅素，后者通過兩種去飽和酶以及胡蘿卜素異構酶形成番茄紅素[31]。 番茄紅素又經過一系列環化酶的催化作用，形成了α-胡蘿卜素、葉黃素和β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素通過β-胡蘿卜素酮醇酶（β-carotene ketolase，BKT）的催化作用生成海膽酮和角黃素，最后形成蝦青素。

圖 1 膠紅酵母合成類胡蘿卜素的代謝途徑Fig. 1 Metabolic pathway for carotenoid synthesis by Rhodotorula mucilaginosa

與膠紅酵母產類胡蘿卜素發酵工藝的較多研究報道相比[32-33]，目前Rhodotorula屬物種的類胡蘿卜素合成相關基因的報道極少，基因組學及基因組功能注釋方面知識的缺乏會阻礙應用這些菌株提高產量的代謝工程效果。最近幾年，已經有少數學者開始在此方面進行研究。Landolfo等[34]對膠紅酵母C2.5t1的胡蘿卜素形成作用基因簇（carotenogenesis gene，CAR gene）和產胡蘿卜素基因的轉錄水平進行了研究；Gan等[35]對從制造牙簽的抗菌植物Distemonanthus benthamianus中分離出的膠紅酵母RIT389菌株進行了全基因組測序，以闡明Rhodotorula的系統發育史和類胡蘿卜素的生物合成機制。

目前，隨著現代生活水平和人們對健康的追求不斷提高，天然類胡蘿卜素作為重要的抗氧化劑已廣泛用于食品添加劑、醫藥、化妝品及飼料行業[36]，近年來，類胡蘿卜素在國內外市場需求不斷增長，預計在2018年全球市場對其需求量為14億 美元，且價格昂貴[30]。果蔬植物生長周期長，從中提取天然的類胡蘿卜素存在著工藝復雜、提取得率低、成本高等制約因素。微生物具有繁殖快、營養需求低以及生長條件不受氣候限制等優點，利用微生物生產類胡蘿卜素，比用植物原料相比，能節約生產成本、提高生產效率，具有非常好的商業價值，這方面的研究已成為近年來國內外的研究熱點。以下重點綜述膠紅酵母在合成番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素 3 個方面的研究進展。

1.2 膠紅酵母生產番茄紅素方面的研究進展

番茄紅素是由11 個共軛及2 個非共軛的碳-碳雙鍵組成的直鏈碳氫化合物，它是人體血漿和組織中的天然組分之一，但人體無法自行合成，必須通過進食攝入。在所有類胡蘿卜素中，番茄紅素具有最強的單線態氧消除功能[37]，其消除單線態氧的能力是β-胡蘿卜素的兩倍，是常用抗氧劑VE的100 倍。因此，番茄紅素能有效保護生物膜，抑制低密度脂蛋白的氧化，具有非常好的防治心腦血管疾病，抑制子宮癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌細胞生長，降低癌癥發病率的功效，還有防止皮膚受紫外線傷害，延緩衰老的保健功能[38-41]。美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）在2005年批準番茄紅素為公認安全物質，我國于2009年將其列入GB 2760ü 2009《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》，開始產業化。目前，高純度天然番茄紅素國際市場價格為5 000～6 000 美元/kg[38]。

有關膠紅酵母與番茄紅素的研究，目前在國內外鮮見報道。但國內對紅酵母屬同屬的其他酵母在這方面的基礎研究從2005年起開始有報道，有些研究涉及未鑒定到種名的Rhodotorulasp.[42-43]。

由圖1可知，番茄紅素作為后續類胡蘿卜素產物的前體物質，是類胡蘿卜素多種產物合成途徑的關鍵分支點。提高其產量對后續多種產物如β-胡蘿卜素、蝦青素等的產量的提高有一定的促進作用，對其產量的代謝調控主要有以下3 種有效途徑：

1）增加合成過程中關鍵酶的表達量。牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合成酶、八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、胡蘿卜素異構酶等是番茄紅素合成過程中的關鍵酶。其中八氫番茄紅素脫氫酶是將類胡蘿卜素從無色八氫番茄紅素生成紅色的類胡蘿卜素關鍵酶[44]，大部分微生物通過I型Crt酶來完成脫氫反應，并根據不同的脫氫步驟，催化八氫番茄紅素生成不同的產物——ζ-胡 蘿卜素、鏈孢紅素、番茄紅素等[45-46]。八氫番茄紅素脫氫酶基因的表達會受到其他類胡蘿卜素合成相關基因過表達的影響，從而促進類胡蘿卜素的積累[47]，同時高產類胡蘿卜素相關基因的表達在機體遭遇氧化脅迫時，通常會發生變化。李春季[48]研究了一株擲孢酵母（Sporidiololus pararoseusCGMCC 2.5 280），證實在低濃度氯化鈉（1.0 mol/L）和高溫（35 ℃)脅迫下，八氫番茄紅素脫氫酶基因發生了顯著上調?；蚬こ?、高通量測序等技術的不斷發展，對番茄紅素合成過程中關鍵酶的深入研究，從分子生物學角度全面系統地提高番茄紅素產量的工作，及后續生產多樣化的類胡蘿卜素產物大有裨益[44]。Chen Yan等[49]在釀酒酵母生產番茄紅素的研究中，將宿主工程（遠緣遺傳位點和細胞交配類型）與途徑工程（酶篩選和基因微調）相結合，使得番茄紅素的產量與原始菌株相比逐步提高了22 倍，最終在5 L發酵罐中獲得番茄紅素產量為55.56 mg/g細胞干質量（dry cell weight，DCW）。

2）控制番茄紅素轉化途徑。β-胡蘿卜素是由番茄紅素經番茄紅素環化酶催化環化形成。阻斷劑可與該環化酶結合，使其喪失活性，從而阻斷生成β-胡蘿卜素的途徑，使最終產物停留在番茄紅素的階段，造成番茄紅素的大量積累[31]。自2009年起，華南理工大學吳曉英團隊對黏紅酵母R. glutinis中番茄紅素的合成途徑進行了深入 研究[40-41,50-51]。王海兵等[50-51]針對黏紅酵母R. glutinis的代謝調控條件，分別在發酵至24 h添加環化抑制劑煙堿 2.5 m L/L 和青霉素4 m g/L，3 6 h 時添加雙氧水 1.2 mL/L，60 h時添加酮康唑400 mg/L，使番茄紅素產量達到176.97 mg/L，比對照組提高了43.2 倍。Hernández-Almanza 等[52]同樣考慮了抑制劑的影響，發現使用2-異丙基咪唑環化抑制劑可提高番茄紅素產量至18.61 mg/L。

3）優化發酵培養基成分和發酵工藝參數及產物提取條件。李娜娜等[41]用液態烷烴作為氫載體，在初始發酵時添加體積分數4%的正十二烷，番茄紅素合成量達到42.32 mg/L，增加了50.17%。廉博等[53]在2 L罐中用甘蔗糖蜜來替代總量75%的葡萄糖，在溫度28 ℃、初始pH值為5.0、溶氧15%～25%的條件下發酵R. glutinis，所獲得的番茄紅素產量可達87.71 mg/L。

番茄紅素存在于細胞內部，其提取需要先破細胞壁，再用有機溶液浸提。常用的破壁方法包括研磨法、超聲波破碎法、酸熱法、酶消化法等。王海兵[51]通過正交試驗發現酸熱法的破壁效果最佳，但耗時過長，工業上宜使用研磨結合酶法來提高效率。同時以乙酸乙酯-丙酮（1∶1，V/V）混合液作為溶劑，在30 ℃、液料比60∶1的條件下浸提3 h，番茄紅素提取量可達4.55 mg/g，是未優化的141.3%[40]。

以上研究者的工作為探究膠紅酵母生產番茄紅素及其分析測定與發酵工藝提供了非常有價值的參考。

1.3 膠紅酵母在生產β-胡蘿卜素方面的研究進展

1.3.1β-胡蘿卜素的生物合成途徑

β-胡蘿卜素是良好的自由基淬滅劑，具有增強免疫力的功能，也是動物體內主要的合成VA的前體[54]，是人體健康不可缺少的營養素，在預防眼疾、白內障上有顯著的功能[55]。劉曉庚等[56]研究了β-胡蘿卜素清除 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的動力學，結果表明，類胡蘿卜素對DPPH自由基有較強的清除作用，且在一定條件下其清除能力與質量濃度成正比，當質量濃度高于80 μg/mL時，其清除DPPH能力與VE相當。

由圖1胡蘿卜素合成的代謝途徑可知，番茄紅素在環化酶的作用下可將其末端環化形成γ、β或ε環，由細胞中的CrtYB基因編碼的環化酶催化，經過環化反應生成β-胡蘿卜素[57]。

1.3.2 膠紅酵母高產β-胡蘿卜素菌株篩選

誘變育種是一種普遍采取的提高產量的方法。楊清香等[58]發現一株膠紅酵母，可利用螺旋霉素重液發酵廢水中的營養物質，在不添加其他營養源的情況下發酵生產類胡蘿卜素，產量為0.80 μg/mL。對菌株進行常壓室溫等離子體誘變，誘變菌株AR62類胡蘿卜素的產量可達到2.14 μg/mL，比誘變前的產量提高了167%，同時為類胡蘿卜素使用廉價培養基的生產和制藥廢水的治理提供了一種新方法。劉冬[59]以誘變菌株膠紅酵母K4為基礎通過導入并過表達類胡蘿卜素合成過程中的關鍵酶基因（HMG CoA還原酶）獲得了基因工程菌株G1，使類胡蘿卜素產量提高到17.02 mg/L。

1.3.3 膠紅酵母產β-胡蘿卜素發酵工藝優化

優化培養基的組成和發酵參數是一種簡單有效地提高β-胡蘿卜素產量的可行方案。Jukyoung等[4]對膠紅酵母HP生產β-胡蘿卜素的培養基進行了優化：當培養基中酵母提取物、麥芽浸出物、蛋白胨和葡萄糖質量分數分別為2.17%、2.11%、5.79%和12.46%時，β-胡蘿卜素產量為2.87 mg/L。丁重陽等[60]改善了培養條件，發現將獲得的2%膠紅酵母接種到發酵培養基成分為葡萄糖 10～12 g/L、酵母提取物5～7 g/L、蛋白胨10～12 g/L、氯化鈉5～7 g/L，在pH 5～7、28 ℃的條件下發酵48 h后類胡蘿卜素的含量達7.12 mg/L。

Cheng Yuting等[61]分離到一株膠紅酵母，在培養基中分別添加了0.1 g/L的FeSO4g 7H2O、MgSO4g 7H2O或CaCl2，上述正二價金屬離子能夠增加膠紅酵母的生物量和類胡蘿卜素的產量，產量分別比對照組提高了37.6%、21.4%和9.2%，達到3 493.8、3 082.4、2 773.7 μg/L。

近年，有研究者發現，紅酵母中脂肪酸與β-胡蘿卜素代謝間存在一定的關聯。Tká?ová等[62]研究R. glutinisCCY 20-2-26發現，在C/N比為70∶1條件下，細胞內總脂肪酸積累量最高達48%，產率達8.9 g/L。相反，當C/N比為20∶1時，酵母中色素積累量最高（1 268 μg/g細胞）；C/N比為50∶1時類胡蘿卜素產量（主要為β-胡蘿卜素）最高，為12.7 mg/L。這表明，葡萄糖耗竭導致細胞生長減慢，脂質積累減少。而儲存脂肪酸，特別是棕櫚酸和油酸，被氧化降解形成乙酰輔酶A，用于生物合成β-胡蘿卜素。該研究在一定程度上，對獲取高產量的β-胡蘿卜素提出一種可試方案，即通過對脂肪酸的調控來提高生物合成β-胡蘿卜素的效果。

由于目前微生物培養β-胡蘿卜素的成本較高，研究者會考慮使用食品工業的下腳料為底物來降低生產成本。Cheng Yuting等[61]使用廢棄的健康飲料、番茄醬和甘蔗糖蜜等食品廢料為底物來發酵生產類胡蘿卜素，結果顯示，使用廢糖蜜作為原料最好，類胡蘿卜素的產量為 2 611 μg/L，β-胡蘿卜素占組分的23.8%。也有研究者采用番茄渣和豆粕的酶解產物來作為發酵培養基。

1.3.4 膠紅酵母產β-胡蘿卜素基因工程菌株構建

目前，工業化生產β-胡蘿卜素和番茄紅素的唯一微生物菌株為三孢布拉氏霉菌[63]。但三孢布拉氏霉菌是異宗的接合菌，需要將正、負菌株按照1∶1～1∶10的比例混合培養發酵生產，工藝復雜、發酵周期長，需120 h以上，耗氧量高，培養基價格昂貴，發酵成本高[64]。紅酵母對類胡蘿卜素發酵水平雖然不如霉菌高，但紅酵母具有營養要求簡單粗放、生長周期短、可以高密度培養，且菌體無毒、營養豐富、可以作為副產物綜合利用等優點。近年來，國內外學者對三孢布拉氏霉菌的主要合成途徑的研究取得巨大進展，已有150多個參與類胡蘿卜素合成的關鍵酶基因先后得到分離。這些研究成果都可以為膠紅酵母在類胡蘿卜素生物合成途徑、催化各步反應所需酶的基因表達調控、遺傳工程研究、基因工程菌株構建等方面的研究提供非常有價值的參考。

1.4 膠紅酵母在生產蝦青素方面的研究進展

蝦青素分子式為C40H52O4，結構中有2 個β-紫羅蘭酮環、11 個共軛雙鍵。天然蝦青素對單線態氧的淬滅速率能達到VE的80 倍，抑制脂質過氧化的能力是β-胡蘿卜素的10 倍、VE的100 倍[65]，具有抗氧化、防曬護膚、抗衰老、抗腫瘤、預防心腦血管疾病等功能[66-68]。蝦青素也能增強水產動物、禽類免疫力和繁殖能力，作為食品著色劑，使人工養殖的鮭魚、鱒魚具有與野生魚一樣鮮艷的紅色且能提高其肉的品質和口感，還能使雞蛋黃變成橙紅色，增強其營養及保健作用[69-71]。因此，蝦青素被廣泛添加在功能食品、水產動物飼料中，市場供不應求。天然蝦青素在國際市場價格為2 500～3 000 美元/kg。

天然蝦青素為反式結構，合成蝦青素多為順式結構，因此，美國FDA、加拿大僅批準合成的反式蝦青素用于水產養殖用添加劑，不允許進入保健食品市場[28]。而從甲殼動物如蝦、蟹中獲取的天然蝦青素，提取成本高、污染嚴重，不適合作為工業生產來源。因此，從微生物中獲取蝦青素成為研究重點。

1.4.1 其他屬紅酵母中獲取蝦青素的研究進展

蝦青素生物合成途徑如圖2所示。β-胡蘿卜素轉化到蝦青素需要在β-紫羅蘭酮環的3和3’碳位各加一個羥基，在4和4’碳位各加一個羰基，該過程需要兩個關鍵酶進行催化，這兩種酶分別是β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）和β-胡蘿卜素酮化酶（CrtW或者BKT）[72]。

目前，天然蝦青素的酵母菌生產菌種主要是紅發夫酵母。其野生株系的蝦青素積累量可達0.05% DCW左右，某些突變株系中可達0.3% DCW。國外自1980年以來開始對紅發夫酵母生產蝦青素開展研究[73-74]，近年的研發重點是推進其產業化。目前，少數發達國家發酵法生產的蝦青素開始上市；1997年起，浙江工業大學 裘娟萍[69,75]、鄭裕國[76-77]，華南理工大學朱明軍[78-80]等以及農業部飼料中心等科研單位對紅發夫酵母高產蝦青素突變株篩選和發酵代謝調控、蝦青素的提取方法等方面進行了深入研究。其他真菌如深紅酵母、隔抱伏革屬、擲抱酵母屬、隱球酵母屬等也能產生蝦青素，但含量較低，相關研究較少[78]。

沈寧燕等[81]發現，乳酸在乳酸脫氫酶的作用下，繞開了磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑，使乙酰輔酶A等前體物質和能量供給的通量增加，促進了蝦青素的合成。此外，還可通過對從β-胡蘿卜素向β-隱黃素旁支代謝途徑的抑制來增加蝦青素的積累。張楓等[82]發現，煙堿與乙醇組合后能促進細胞內β-隱黃質向蝦青素轉化，而β-紫羅蘭酮及N-甲基嗎啉則可促進法夫酵母JMU-MVP14細胞內β-胡蘿卜素向β-隱黃質的轉化。抑制向β-隱黃素的轉化，促進向蝦青素轉化的抑制劑對蝦青素積累有較好效果。

圖 2 蝦青素生物合成途徑[72]Fig. 2 Biosynthesis pathway of astaxanthin[72]

近年來，在紅發夫酵母生產蝦青素的代謝調控研究方面，有研究者采取了對合成途徑中主要限速酶的過表達[46-47]、表達工具的開發[83]、啟動子的篩選[84]等手段來提高蝦青素產量。蝦青素的含量與整合的關鍵蝦青素生物合成基因的拷貝數高度相關。有證據顯示，提高CrtZ和CrtW的活性將有利于蝦青素產量的提高。Chi Shuang等[47]研究了一株紅法夫酵母突變株MK19，發現其細胞高表達蝦青素合成酶基因CrtS時，會誘導GGPP/FPP合成酶基因和I型八氫番茄紅素脫氫酶（CrtI）等類胡蘿卜素合成相關基因的上調，從而使重組菌株CSR19的蝦青素產量提高了33.5%。

Lin等[85]在馬克斯克魯維酵母中整合了蝦青素代謝途徑中的基因，比較了3 種藻類來源的CrtZ，發現雨生紅球藻來源的CrtZ催化效率最好，經過重復整合CrtZ和CrtW，在5 L發酵罐上分批進行發酵，最終蝦青素的產量達到了9.97 mg/g DCW。

近年來，利用酵母異源合成蝦青素研究較多[49,85-86]。在2018年最新的一個研究報道中，Jin Jin等[87]采用外源模塊工程與ARTP誘變相結合的綜合方法，將蝦青素產量提高到10.1 mg/g DCW，這是迄今為止釀酒酵母搖瓶水平報道的最高產量，同時新發現CSS1（一種糖原α-1,4-葡糖苷酶基因）這個分子靶點的單獨缺失可以使ARTP誘變得到的菌株蝦青素產量提高75.6%，說明CSS1是一個非常有前途的分子靶點。

1.4.2 產蝦青素的膠紅酵母新菌株的研究

由于紅發夫酵母細胞內蝦青素的生物合成受發酵條件的影響較大，發酵成本較高，提取產量較低，因此，篩選新的產蝦青素紅酵母菌株很有必要[12]。Yang Keng等[5]對從野生海魚的腸道里分離出的膠紅酵母營養成分分析中，發現其蝦青素含量為1.00 mg/kg。孫建男[88]在中國南海雷州半島近岸海水和海泥中采集了317 份樣品，確定膠紅酵母是分離到的71 株海洋紅酵母樣品中的優勢種群，對分離到的71 株海洋紅酵母用酸熱法破壁提取，分析類胡蘿卜素含量和蝦青素含量，發現膠紅酵母ZZC1菌株類胡蘿卜素產量最高，為608.428 μg/g DCW；膠紅酵母ZTHY2菌株蝦青素產量最高，為11.641 μg/mL丙酮提取液。ZTHY2具有生長周期短、菌體細胞數量多、營養要求簡單及蝦青素含量高的優點。上述野生ZTHY2菌株能否通過誘變或基因工程等技術，提高該菌發酵蝦青素的產量，非常值得進一步的研究。因此，對于膠紅酵母發酵生產蝦青素的代謝調控研究，提高其產蝦青素的產量，可以通過上述改造紅發夫酵母代謝研究的文獻報道，給出一些方法指導與合理的預期判斷。

2 膠紅酵母在功能性食用油脂方面的研究

國內外有關膠紅酵母可以作為產油微生物候選菌種已有少量文獻報道，但目前對膠紅酵母含有的多不飽和脂肪酸進行利用、開發為功能性食用油脂方面的研究報道極少，多數是研究和分析了膠紅酵母生產單細胞油脂（single cell oil，SCO）及其胞內脂肪酸的組成和含量，證明其可用于制造生物柴油[18,89-91]。目前，產油研究多處在搖瓶發酵的實驗室規模，發酵生產多不飽和脂肪酸還沒有形成商業化。

國內外均有研究表明，膠紅酵母細胞中含有多種脂肪酸，包括飽和脂肪酸的棕櫚油酸、油酸、硬脂酸、不飽和脂肪酸的亞油酸（linoleic acid，LA）與亞 麻酸等[5,13,59,92]，其成分與植物油相似。

目前，國內外消費市場的α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）主要來自于高寒地帶的植物，以甘油酯的形式存在于亞麻籽油、紅花籽油和核桃仁等中。與植物油生產多不飽和脂肪酸相比，利用酵母發酵獲得功能性油脂將會有很多優點，如生長繁殖迅速、易培養、生產周期短、不受季節的影響、與農業生產油脂相比所需勞動力少等。用微生物發酵產生的含ALA的油脂，沒有魚油腥味，不會像植物資源受農藥污染的威脅，不含重金屬污染，對人體低過敏性，生物安全性好，而且對嚴格素食者而言不存在深海魚油等動物源膳食禁區[93]。

膠紅酵母具有向脂肪酸第9位碳原子的甲基端位置引入不飽和雙鍵的去飽和酶，從而在細胞內可將油酸向LA和ALA轉變，而哺乳動物缺乏此去飽和酶，自身不能合成LA和ALA，因此，LA和ALA是人體真正必需脂肪酸。LA是人體細胞膜的重要構成成分，參與線粒體的合成，同時膽固醇必須與LA結合后，才能在體內進行正常的運轉和代謝。如果缺乏LA，膽固醇就會與一些飽和脂肪酸結合，發生代謝障礙，在血管壁上沉積下來，逐步形成動脈粥樣硬化，引發心腦血管疾病。ALA在體內代謝可生成同屬ω-3系列的二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）[94-95]，具有較好的醫療保健前景。Gupta等[13]對其分離出的一株菌株進行分析，證實以7%的葡萄糖為碳源培養72 h，可得到最高ALA含量，達總不飽和脂肪酸的（6.21f 0.02）%。此時LA含量也接近最高，為（22.78f 0.01）%。此研究證實，膠紅酵母在功能性食用油脂的制備上是一種具有發展潛力的微生物。

油脂是細胞次級代謝產物之一，在細胞中有兩種存在形式：一種是構成細胞結構的體質脂；另一種是由多種脂肪酸形成的80%以上的甘油三酯和10%以上的磷脂即貯藏脂。油脂在酵母體內積累代謝途徑如圖3所示。

圖 3 產油酵母油脂積累代謝調控途徑簡圖[59]Fig. 3 Oil accumulation and metabolic regulation pathway in oleaginous yeast[59]

2.1 膠紅酵母高產油脂菌株的育種方法

野生型酵母產油量一般不高，一般會采取誘變處理來提高油脂產量。誘變育種方法主要有化學 誘變[96]、紫外線誘變、γ射線誘變、常壓室溫等離子誘變（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）和原生質體融合。

常壓室溫等離子誘變[97]，是近年來發展的一種新的輻射誘變技術，有別于其他常規輻射，能在常壓室溫下進行誘變，擁有離子注入、電荷交換、能量沉積和動量傳遞的多種誘變機制，可以更強烈地改變親本的DNA中的堿基排序，提高變異率，同時對環境無污染，保證實驗者身體無損傷，其正突變的效率較高。楊清香[97]、劉冬[59]等對一株膠紅酵母菌進行多次ARTP誘變，提高油脂產量達（2.38f 0.02）mg/L。目前國內其他研究者對膠紅酵母高產油脂育種研究得極少。

2.2 膠紅酵母高產油脂基因工程菌株的構建

在產油酵母的研究中[98]，通過脂質積累或脂質降解相關基因的過表達、缺失或失活可以構建高產的微生物菌株。具體來說，一個或多個編碼脂源酶的基因，如乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、乙酰輔酶A合成酶（acetyl CoA synthetase，ACS）、ACL、ME、FAS和二?；视王；D移酶（diacylgycerol acyltransferase，DGAT）基因，會導致高脂質積累。當這些修飾與抑制參與脂質代謝的基因相結合時，脂質積累就會最大化。

目前，因缺乏可以用于膠紅酵母的分子生物學操作的載體質粒，所以在基因工程菌的構建上有一定難度。李紅紅[99]研究了同屬的紅酵母，采取與黏紅酵母R. glutinis具有較高親緣關系菌株的基因序列設計引物以及兼并引物來擴增細胞內油脂代謝的關鍵酶基因，最終發現蘋果酸酶的擴增比較成功，并以易錯基因組為誘變方法，結合尼羅紅熒光法篩選最終獲得油脂含量比親本高21%的突變菌株。

王致鵬[100]使用基因敲除技術，刪除了ACA-DC50109菌株中與碳源阻遏相關的MIG1基因，得到敲除菌株M25，使Yarrowia lipolytica油脂含量從原始菌株產量36.0%提高到48.7%，并發現敲除菌株中21 個與脂肪酸和三酰甘油合成有關的大部分基因的轉錄水平大大提高。這些其他屬產油酵母菌的產油機理研究，為膠紅酵母高產油脂基因工程菌株的構建提供了很有價值的參考。

2.3 膠紅酵母發酵油脂工藝的優化

影響膠紅酵母的產油因素較多。研究表明，當培養過程中缺少氮源時，由于腺苷酸脫氨酶活性的提高，腺苷酸轉化為大量的氨和肌苷酸，抑制線粒體中的腺苷酸依賴性脫氫酶，大量檸檬酸被堆積并被轉運至胞漿最終形成脂肪酸甘油脂[101]。因此可以通過控制C/N比調節油脂產量。Yousuf[102]和Angerbauer[103]等推薦接近100的C/N比作為脂質積累的理想值，然而作為一般趨勢，觀察到低C/N比會導致飽和脂肪酸含量低、不飽和脂肪酸含量增加。Mondala等[104]報道了類似的發現：隨著初始C/N比的增加，發現C16∶0和C18∶0的水平增加。因此需要針對目標是獲取較高的飽和脂肪酸用作生物柴油原料，還是注重獲取不飽和脂肪酸來權衡發酵原料的C/N比。

Saenge等[105]發現，提高通氣量有利于提高好氧微生物的R. glutinis的脂質產量。研究發現，產油酵母在供氧不足的條件下，甘油三酯的合成過程會受到強烈阻礙，同時造成磷脂和游離脂肪酸的大量積累；而在適宜的通氣條件下，部分游離脂肪酸會轉化成含2 個及以上雙鍵的脂肪酸，從而提高不飽和脂肪酸含量。

培養時間的長短對微生物油脂含量也是一個重要的影響因素，培養時間過短未達到菌體最適培養時間會導致菌體密度過低，減少油脂產量；培養時間過長則會發生菌體自溶等現象，同樣會降低油脂產量。有關研究證明，產油酵母油脂在生長指數期積累較少，在指數期末期積累量會急速增加，并在穩定期后達到峰點[106]。多個研究均可證明，膠紅酵母產油脂的最佳培養時間為3～5 d[18,107]。

無機鹽與微量元素對酵母產油也有影響。馬麗娟等[108]發現，在培養基中增加Fe3＋的濃度，會提高產油酵母的油脂積累速率；在培養基中增加Zn2＋的濃度，會提高油脂的產量；限磷和限硫可抑制細胞中核酸、蛋白等的合成，影響細胞增殖，使油脂累積期提前[100]。該調控對運用含氮粗原料生產油脂，改良培養基條件具有重要意義。需要提醒的是，制備無機鹽的鹽濃度和微量元素的量稍高于最適濃度即可，過高則會產生抑制效果[109]。

微生物油脂的高生產成本是影響其商業化生產的主要障礙，尋找低廉的原材料替代葡萄糖至關重要，是微生物油脂生產能夠工業化發展的必要因素之一[110-111]。稻草、甘薯淀粉廢水、玉米秸稈水解液、廢糖蜜、甘蔗渣、木薯淀粉、菊粉等廉價原材料，都可以作為酵母菌發酵合成油脂的碳源，并且，這些廢棄物的再利用，有利于環境保護，緩解動植物油脂資源緊缺的局面。馬素梅等[107]研究能利用木糖產油脂的膠紅酵母菌株，證實其能夠利用啤酒糟酶解液的單糖并將其轉化為油脂，不飽和脂肪酸含量可達76.9%。李梅[18]利用木薯淀粉水解液作為碳源，油脂產量達到52.9%。

3 膠紅酵母在生物制酶、催化方面的應用

3.1 膠紅酵母生產酶制劑

漆酶是一種含銅多酚氧化酶，在食品、造紙、生物漂白、新興的生物修復領域有廣泛應用。漆酶的合成產量一般較低，尚不能滿足工業需求，且目前已發現的有效誘導劑一般價格昂貴或具有毒性。近年來的研究發現，微生物共培養可以提高漆酶產量[112]。Wang Han等[113]將阿魏蘑與膠紅酵母共培養，漆酶活力達到8 000 U/L，是單培養的1.2 倍左右，此研究對漆酶在共培養中表達量的提高有重要意義[114]。有研究發現，從酵母菌中提取出的β-胡蘿卜素可促進漆酶產生，因此，可以選擇高產β-胡蘿卜素的膠紅酵母菌株來提高真菌漆酶的產量或利用β-胡蘿卜素的粗提物來大規模地誘導漆酶的產生[115]。

角質酶是多功能裂解酶，被廣泛應用于食品、制藥、化工及印染工業等許多領域[116]，角質酶可以水解植物的葉片組織角質保護層，以便能溫和有效地從藥科植物葉片中提取天然活性成分化合物。在自然界中，只能從微生物和花粉兩個來源獲得角質酶，來源非常有限。冉琴琴[117]、張效寧[118-119]等從感染的杜仲葉中篩選得到產角質酶的野生膠紅酵母菌株，其酶活力較高，產酶量可達10 U/mL左右。張效寧等[119]探究了膠紅酵母角質酶的酶學性質，發現當pH值為9時穩定性最好，其最佳反應溫度為45 ℃。另外，金屬離子Fe2＋和Mg2＋在終濃度為10 mmol/L時會對酶產生激活作用。這一發現具有重大意義，因為通常高產角質酶的微生物很少，主要是植物的病原真菌，在培養病原真菌產角質酶時必須嚴格控制生產條件，避免對環境植物的破壞。而膠紅酵母是安全的，因此大規模進行微生物培養來批量生產角質酶不會對環境帶來危害。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），是一類廣泛存在于生物體中的金屬酶，也是一種重要的氧自由基清除劑，金連豆等[120]對海洋膠紅酵母菌CD-008產SOD發酵條件進行了優化，結果表明，在pH 5.34、轉速150 r/min、溫度21.4 ℃的條件下，發酵液SOD活力達到6 430.52 U/g濕菌體。ünlü等[121]通過對同屬R. glutinis采用不同的操作策略研究了溶解氧（dissolved oxygen，DO）對SOD活性的影響，發現SOD活性只有在培養開始時提供高濃度的DO時才會被誘導。該研究在一定程度上為膠紅酵母高產SOD的培養條件提供了參考。

3.2 膠紅酵母作為生物催化劑的應用

3.2.1 在釀酒工業方面的應用

膠紅酵母可以降解氨基甲酸乙酯，可控制發酵食品中的氨基甲酸乙酯含量[122]。陶永勝等[123]分離提取媚麗葡萄新酒中的香氣糖苷，添加優選野生膠紅酵母的糖苷酶液，進行催化水解實驗，結果表明，膠紅酵母的糖苷酶對媚麗葡萄酒的制造具有良好的增香釀造應用潛力。李愛華等[124]將膠紅酵母和釀酒酵母順序接種發酵‘愛格麗’干白葡萄酒，結果表明，48 h后順序接種釀酒酵母有助于減慢發酵速率，延長膠紅酵母生長時間，提高糖苷酶活性。

3.2.2 在全細胞生物轉化制備新型藥物方面的應用

樺木醇可以降低鉻誘導的細胞毒性，并且極易轉化成具有抗HIV和抗腫瘤細胞毒性的樺木酮醇[125]，樺木酮醇生物活性遠高于樺木醇，抗細胞毒性活性更高，新近發現的樺木醇衍生物顯示出與以往藥物不同的作用機制，使其成為在癌癥和艾滋病治療中有巨大應用潛力的新型藥物。Mao Duobin等[126]以樺木醇為唯一碳源從土壤中篩選到一株膠紅酵母，在5 L發酵罐中，在培養基中添加樺木醇為先導化合物，膠紅酵母可將樺木醇轉化成衍生物樺木酮醇，其對DPPH自由基的清除能力是樺木醇的2 倍。膠紅酵母具有催化先導化合物轉化成更高效藥物的能力，具有反應條件溫和、綠色環保和選擇性高等優點，顯示了膠紅酵母在全細胞催化劑改造藥物結構和微生物藥物轉化方面的重要價值。

4 結 語

綜上所述，膠紅酵母能產生較多類別的生物活性物質，并在很多領域具有廣闊的應用前景。

目前在膠紅酵母中的類胡蘿卜素包括番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素的合成途徑、高產類胡蘿卜素菌株的篩選、發酵條件的優化、合成途徑中相關的酶及其調控機理均有較多研究，然而，采用膠紅酵母發酵產番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素的產率仍然較低，缺乏穩定的膠紅酵母基因工程菌株，尚難以利用膠紅酵母工業化生產類胡蘿卜素。鑒于三孢布拉氏霉菌中多個參與類胡蘿卜素合成的關鍵酶基因先后得到分離，為膠紅酵母的類胡蘿卜素生物合成途徑、催化各步反應所需酶的基因表達調控及其遺傳工程的研究提供了參考，下一步要加強高產類胡蘿卜素膠紅酵母菌株的構建、提高基因工程菌株的穩定性，并進一步優化發酵條件、加強類胡蘿卜素合成促進因子、類胡蘿卜素提取工藝及其活性保護等后續研究，為最終的工業化生產提供依據。

膠紅酵母含有豐富的多不飽和脂肪酸，目前的研究主要集中于膠紅酵母胞內脂肪酸的組成和含量、利用膠紅酵母制造生物柴油，但對膠紅酵母所含的人體必需脂肪酸ALA的研究報道較少。未來研究應重點關注構建高產油脂的膠紅酵母基因工程菌株及代謝調控工程，以提高膠紅酵母油脂的產率，實現商業化發酵生產膠紅酵母多不飽和脂肪酸，開發基于膠紅酵母的功能性食用油脂。

此外，膠紅酵母能產漆酶、角質酶和SOD等多種酶類，膠紅酵母可以降解氨基甲酸乙酯，同時可將樺木醇轉化成清除自由基能力更強的衍生物樺木酮醇，展現了膠紅酵母在釀酒和制備新型藥物方面的應用前景。但目前這方面的研究還比較零碎而不夠深入，后續需要進一步加強對其產酶條件、酶的分離純化及其降解氨基甲酸乙酯、轉化樺木醇能力的研究，尤其需要通過構建新型的膠紅酵母菌株，全方位同時提高多種生物活性物質的產量及其功能。

總之，隨著微生物研究技術的不斷發展，酵母菌獨特的生物合成能力將被更深度地發現利用，尤其是膠紅酵母這一帶有迷人橙紅色彩的微生物資源，更值得食品科學工作者去挖掘，膠紅酵母在食品、醫藥、酶工業、農業用生防酵母、飼料、環境保護等領域將會有更廣闊的開發和應用前景。