半乳糖基月桂酸單甘酯對短小芽孢桿菌的 抑制機理

許苗苗，訾玉祥，陸兆新，呂鳳霞，張 充，別小妹，趙海珍

（南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）是導致食物腐敗和食源性疾病爆發的原因之一[1-3]。Song Jianghua等[4]首次報道甜瓜的細菌性腐爛與短小芽孢桿菌密切相關。到目前為止，已從眾多產品中分離得到短小芽孢桿菌，如：堿性發酵的Ntoba Mbodi[5]、乳膠乳[6]、奶粉和可可粉[7]、商業駱駝奶[8]、馬鈴薯[9]等。除此之外，短小芽孢桿菌還可引起蔬菜的軟腐病[10]；有的菌株甚至還可產生具有致病性的pumilacidin，有患者因食用未加熱的大米而產生急性中毒癥狀，經檢測該大米中含有大量的短小芽孢桿菌（105CFU/g）[11]。因而，尋找一種新型的抗菌劑來控制短小芽孢桿菌的污染和感染是至關重要的。

近年來，具有廣譜抗菌性、高效性、安全性和穩定性的天然食品添加劑受到越來越多的關注。且研究發現生物表面活性劑有較好的抑菌活性，特別是糖脂類生物表面活性劑，如鼠李糖脂[12]、脂肪酸糖脂[13-14]和槐糖脂[15]都表現出抗菌活性。

甘油糖脂是糖脂的一種，由一個或多個糖殘基通過糖基鍵連接到含有甘油殘基的脂質部分[16]，是藍細菌和植物葉綠體的類囊體膜的常見成分[17]。糖脂的主要類型是單半乳糖二?；视停╩onogalactosyl diacylglycerol，MGDG）、二半乳糖基二酰基甘油（digalactosyl diacylglycerol，DGDG）和磺酸基二?；视停╯ulfonic acid diacylglycerol，SQDG）[18]。 這些糖脂中的每一種都具有不同的生物活性，例如抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎和抗菌特性[19-20]。Cateni等[21]合成了具有中長脂肪酸?；湹膯伟肴樘腔视投ィz測了它們對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌和真菌的抑菌活性，結果發現含有1,2-二取代和辛酰鏈結構的糖酯生物活性是最好的。Martins等[22]從Carpobrotus edulis中分離出一種單半乳糖二酰基甘油，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌COLOXA和金黃色葡萄球菌HPV107具有良好的抗菌活性。El Baroty等[23]研究了5 種海藻中糖脂的抗菌活性，發現所有藻類的糖脂均具有中等的抗菌活性。其中，由于Taonia atomaria中含有大量的生育三烯酸，故其糖脂對所有測試微生物均表現出較高的抑制活性。Pongmuangmul等[24]發現來自Clinacanthus nutans的MGDG和DGDG顯示出抗單純皰疹病毒活性，半抑制濃度為36～43 μg/mL。Ahamed等[25]發現來自Oscillatoria acuminataNTAPC05的棕櫚酰（MGDG-棕櫚酰）單半乳糖二?；视惋@示出對3 種超廣譜β-內酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases，ESBL）產生細菌（大腸桿菌U655、嗜麥芽寡養單胞菌B929和腸桿菌B938）的殺菌活性，最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為100 μg/mL。

據了解，目前缺乏有關糖基甘油酯介導的抑制短小芽孢桿菌生物活性及作用機制的報道。在之前的研究中，合成了一系列3-O-β-D-吡喃半乳糖基-sn-甘油，并對其抗菌活性進行了初步探索。研究發現，3-O-β-D-吡 喃半乳糖基-sn-甘油的單月桂酸酯（1-O-月桂基-3-Oβ-D-吡喃半乳糖基-sn-甘油和6’-O-月桂基-3-O-β-D-吡喃半乳糖-sn-甘油的混合物）顯示出良好的抗菌活性[26]。本實驗旨在評價半乳糖基月桂酸單甘酯（monogalactosyl monolaurate，MGML）對短小芽孢桿菌的抗菌活性，并研究其作用機制。通過生長抑制曲線、細胞膜的通透性及完整性、DNA和蛋白的變化等指標來評價MGML對短小芽孢桿菌的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

短小芽孢桿菌（B. pumilus）ATCC7061，保存于南京農業大學酶工程實驗室。將斜面培養的菌株挑取1～2 環接種至NB培養基中，37 ℃、180 r/min下培養12 h，以2%的接種量接種至新鮮的營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基中，37 ℃、180 r/min培養至12 h，以獲取細菌懸液。NB培養基：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏3 g/L、氯化鈉5 g/L，pH（7.2f 0.2），121 ℃滅菌20 min。

MGML是1-O-月桂基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-sn-甘油和6’-O-月桂基-3-O-β-D-吡喃半乳糖-sn-甘油的混合物（物質的量比為1∶1），在實驗室中合成及純化（純 度≥98%）；MGML工作溶液在甲醇中制備。

細菌基因組DNA提取試劑盒、K＋和Ca2＋濃度測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；化學試劑均為分析純，購自國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 MIC的測定

通過肉湯微量稀釋法[27]測定MGML對短小芽孢桿菌的MIC。將100 μL新鮮NB培養基與系列稀釋的不同質量濃度的MGML在96 孔板中混合均勻，然后加入100 μL細菌懸浮液（OD600nm＝0.5），使MGML的終質量濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、 0.039 mg/mL。以相同體積甲醇（體積分數小于1%）作為對照。將96 孔板放置于37 ℃培養箱培養24 h，用酶標儀測定600 nm波長處的吸光度。MIC定義為在培養后未觀察到可見生長的MGML的最低質量濃度。

1.3.2 MGML對短小芽孢桿菌生長曲線的影響

根據Wu Yanping等[28]的方法略作修改測定MGML對短小芽孢桿菌生長曲線的影響。取培養至對數期的短小芽孢桿菌（2 mL）和不同質量濃度的MGML溶液，加入到100 mL新鮮的NB培養基中，使MGML的終質量濃度為156.5 μg/mL和0.313 μg/mL（即0.5 MIC和1 MIC）。以相同體積的甲醇（體積分數小于1%）作為對照。置于37 ℃、180 r/min恒溫搖床中培養，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h取樣，測定OD600nm。通過時間與OD600nm的關系來繪制生長曲線。

1.3.3 MGML對細胞膜滲透性的影響

為了確定MGML對短小芽孢桿菌細胞膜滲透性的影響，測定了細胞外K＋和Ca2＋的濃度。向培養至對數期的短小芽孢桿菌（1h 107CFU/mL）加入MGML（0、156.5 μg/mL和313.0 μg/mL即0、0.5 MIC和1.0 MIC），37 ℃、180 r/min培養，分別于0、30、60、120、180 min取樣。以相同體積的甲醇作對照。將取出的樣品于4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集上清液，用相應的試劑盒測定K＋和Ca2＋的濃度。

1.3.4 MGML對細胞膜完整性的影響

根據Zhao Lei等[29]方法進行一些修改，通過測定細胞上清液中細胞成分含量的變化來評估細胞膜的完整性。將培養至對數期的短小芽孢桿菌在4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌3 次，離心后重懸于無菌生理鹽水中。將細菌懸浮液與不同質量濃度的MGML溶液（156.5 μg/mL和313.0 μg/mL，即0.5 MIC和1.0 MIC）混合，并在37 ℃下孵育。以相同體積的甲醇作對照。分別于0、1、2、4、6、8、10、12、14 h后取樣，取樣后于4 ℃、5 000 r/min離心5 min，得到上清液，經0.22 μm的濾膜過濾。過膜后通過測定OD260nm和OD280nm的變化來確定細胞內核苷酸和蛋白質的泄漏。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

向培養至對數期（1h 107CFU/mL）的短小芽孢桿菌（B. pumilus）菌懸液中加入不同濃度的半乳糖基月桂酸單甘酯，使其終濃度為0.5、1.0 MIC，37 ℃、180 r/min分別培養2 h取樣，4 ℃、2 500 r/min離心10 min，用磷酸鹽緩沖液洗3 次，棄上清液，用體積分數2.5%的戊二醛溶液4 ℃過夜固定。以相同體積的甲醇作對照。用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，依次用50%、70%、90%和100%乙醇進行梯度脫水，每次脫水時間為5～10 min。脫水結束后，用乙醇-叔丁醇溶液（1∶1，V/V）置換20 min，最后用體積分數100%叔丁醇置換2 次，每次20 min。置換后將樣品進行冷凍干燥處理，干燥后的樣品進行離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

1.3.6 MGML對細菌基因組的影響

收集對數期的短小芽孢桿菌并用新鮮的NB培養基調節細菌細胞懸液（OD600nm＝0.5）。向菌懸液中加入不同質量濃度的MGML（156.5、313.0、939.0 μg/mL，即0.5、1.0 MIC和3.0 MIC），置于37 ℃、180 r/min恒溫搖床中培養，以相同體積的甲醇作對照。分別于0、30、60、180 min取樣，按細菌基因組提取試劑盒的說明提取細菌DNA。在室溫下進行質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳（125 V、30 min），電泳結束溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色20 min，用凝膠成像儀觀察。

1.3.7 DNA結合實驗

在Gao Yan等[30]的紫外光譜法和熒光光譜法的基礎上進行調整，研究MGML與DNA的相互作用。

1.3.8 紫外光譜檢測

收集對數期的短小芽孢桿菌用于DNA提取。檢測提取的DNA，得到A260nm/A280nm＞1.8，符合實驗要求。調整DNA質量濃度（30 ng/mL）后，將不同質量濃度的MGML（0、93.9、156.5、313.0、626.0、939.0 μg/mL，即0、0.3、0.5、1.0、2.0 MIC和3.0 MIC）加入到DNA溶液中，于37 ℃反應30 min，檢測混合物在200～400 nm間的紫外吸收光譜。

1.3.9 熒光光譜檢測

通過熒光光譜法測定EB和DNA反應的最佳比例。固定EB的質量濃度為50 ng/μL，將不同質量濃度的DNA（44、84、94、104、114 ng/μL）與EB溶液混合，置于37 ℃反應30 min，使用熒光酶標儀檢測熒光信號。設置激發波長為535 nm，掃描范圍為550～800 nm。

向EB-DNA復合體系中加入不同質量濃度的MGML（0、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 MIC），置于37 ℃反應30 min，反應結束后在激發波長535 nm、掃描范圍550～800 nm條件下測定熒光光譜。

1.3.10 蛋白電泳檢測

將Zhang Yu等[31]方法加以修改，測定短小芽孢桿菌可溶性菌體蛋白條帶和分子質量的變化。即在不同質量濃度的MGML（156.5、313.0、939.0 μg/mL，即0.5、1.0、3.0 MIC）處理下，將對數期的短小芽孢桿菌在37 ℃、180 r/min分別培養30、60、120 min。以相同體積的甲醇作為對照。取樣后，于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液清洗3 次。將菌體沉淀重懸于無菌蒸餾水中，加入20 μL蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min。冷卻至室溫后，8 000 r/min離心10 min，取15 μL上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。濃縮膠質量分數5%，分離膠質量分數12%，電泳結束后用考馬斯亮藍染色，脫色完成后進行拍照。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均做3 次生物學重復，數據表示為平均 值±標準差，SAS 8.0程序用于統計分析。

2 結果與分析

2.1 MGML對短小芽孢桿菌的MIC

甘油糖脂，一種兩親性非離子糖脂，具有抗菌和表面活性劑的特性。對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌和黑曲霉均表現出抗菌活性，MIC范圍為 60～80 μg/mL[23]；而且對產生ESBL的大腸桿菌U655、嗜麥芽寡養單胞菌B929和腸炎菌腸桿菌也有很好的抑制作用，MIC為100 μg/mL[25]。由實驗結果可知，MGML對短小芽孢桿菌的MIC為313 μg/mL（0.718 mmol/L），高于早期報道的抑制其他微生物的MIC[23]，但低于鼠李糖脂對短小芽孢桿菌的MIC（大于1.6 mmol/L）[32]。

2.2 生長抑制曲線

圖 1 MGML對短小芽孢桿菌生長曲線的影響Fig. 1 Effect of MGML on cell growth of B. pumilus

由圖1可知，短小芽孢桿菌在2 h后開始進入對數生長期，并在16 h到達穩定期；當培養基中加入0.5 MIC MGML時，細菌生長緩慢，延滯期延長，8 h后才開始進入對數期，說明低質量濃度的MGML可能干擾短小芽孢桿菌細胞的合成代謝；而當MGML的質量濃度達到1.0 MIC時，培養基中未出現渾濁現象，無菌體生長，表明短小芽孢桿菌細胞的生長被完全抑制。該結果與鼠李糖脂對單核細胞增生李斯特菌的抑制[33]相似。此外，還可觀察到MGML對短小芽孢桿菌的生長抑制作用呈現出質量濃度-時間依賴性。

2.3 細胞膜的通透性

圖 2 短小芽孢桿菌細胞外K＋（A）和Ca2＋（B）濃度Fig. 2 Effect of MGML on extracellular K+ (A) and Ca2+ (B) concentrations from B. pumilus cells

通過測定細胞外K＋和Ca2＋的含量來判斷MGML對短小芽孢桿菌細胞膜的通透性是否有影響。由圖2可知，與對照組相比，經MGML處理后，上清液中K＋和Ca2＋的濃度顯著增加（P＜0.05）。由圖2A可知，處理組中 K＋的釋放量隨MGML質量濃度增加和作用時間的延長呈上升的趨勢；圖2B表示Ca2＋的釋放量隨作用時間變化的曲線，前30 min內Ca2＋的釋放量顯著增加（P＜0.05），30～180 min變化相對平緩。由此可知，K＋和Ca2＋的釋放量均與MGML的質量濃度和處理時間呈正相關，證明MGML增加了短小芽孢桿菌細胞膜的滲透性，從而導致細胞內的K＋和Ca2＋外泄。

2.4 MGML對細胞膜完整性的影響

細胞膜是細菌的天然保護屏障。正常條件下，細胞內的大分子物質如蛋白質和核苷酸（包括DNA和RNA）不能穿透膜。但當細菌暴露于某些抗菌劑時，細胞膜的完整性將受到損害，從而導致細胞內物質釋放到外部環境中，使其在260 nm和280 nm波長處的紫外吸收增加[29]。 因此，260 nm和280 nm波長處的紫外吸收可作為評估細胞膜完整性的指標。圖3顯示了MGML存在和不存在情況下短小芽孢桿菌細菌上清液的紫外吸收，對照組的吸光強度基本無變化；用MGML處理后，260 nm和280 nm波長處的吸光強度明顯均明顯增加，且隨著MGML作用時間延長和質量濃度的增加，吸光值增加越明顯，表明細胞內的大分子物質（核酸和蛋白質）釋放量增加，細胞膜破裂程度增加。結果與來自銅綠假單胞菌OBP1的鼠李糖脂對金黃色葡萄球菌（MTCC 3160）和肺炎克雷伯菌（MTCC 618）細胞膜損傷[34]的報道一致。表明MGML可能破壞短小芽孢桿菌細胞膜的完整性。

圖 3 MGML作用后短小芽孢桿菌260 nm（A）和280 nm（B）波長處 紫外吸收物質的變化Fig. 3 Effect of MGML on leakage of UV-absorbing substances at 260 nm (A) and 280 nm (B) of B. pumilus

2.5 掃描電子顯微鏡觀察結果

圖 4 MGML處理2 h后短小芽孢桿菌的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of B. pumilus treated by MGML

由圖4可知，對照組短小芽孢桿菌菌體呈完整狀態，細胞邊緣整齊、輪廓清晰，呈均勻的短桿狀，菌體表面可觀察到細小的顆粒狀物質；經MGML作用后，菌體形態發生變化，出現褶皺，向內凹陷、輪廓變得模糊，菌體表面的顆粒狀物質消失，這些顆粒狀物質可能是菌體分泌的胞外多糖[35]，由于MGML的加入影響了細菌胞外多糖的合成或分泌；且隨質量濃度的增加，菌體出現穿孔和斷裂現象，可使細胞內物質外泄，最終可導致菌體死亡。此電子顯微鏡結果與前面離子和大分子物質泄漏結果相一致，表明MGML作用于短小芽孢桿菌后可使其細胞膜的通透性改變。

2.6 MGML對短小芽孢桿菌基因組DNA合成的影響

圖 5 MGML處理后短小芽孢桿菌基因組DNA的葡聚糖凝膠電泳圖Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of DNA from B. pumilus treated with different concentrations of MGML

通過葡聚糖凝膠電泳觀察MGML對短小芽孢桿菌基因組DNA合成的影響。如圖5所示，用MGML處理不同時間后短小芽孢桿菌的基因組未出現彌散狀態，表明MGML沒有讓基因組DNA產生斷裂現象[35]。作用時間為30 min時，基因組無明顯變化；但隨作用時間的延長，處理組的細菌DNA條帶強度變淡變窄，且隨著質量濃度增加和時間的延長，效果越明顯。DNA條帶減弱的原因可能是MGML可以改變細胞膜的通透性使細胞內的DNA釋放到細胞外，導致DNA含量降低，這與細胞成分釋放的結果一致（圖3）；還可能是MGML進入到細胞內影響DNA的合成[36]，從而導致DNA含量降低。

2.7 DNA結合實驗結果

由于MGML具有透過細胞膜進入細胞內部結構的潛力，可能與DNA發生作用，因此通過紫外光譜和熒光光譜研究MGML與DNA之間的相互作用。

通常，小分子物質與DNA的非共價相互作用涉及3 種結合模式：嵌入、溝槽結合和核酸分子表面上的長矩組裝[38]。紫外吸收光譜法是研究小分子物質與核酸相互作用最方便有效的方法之一。化合物結合DNA后，DNA雙螺旋結構的變化和空間構型的改變可反映在光譜上。增色效應與減色效應是與DNA雙螺旋結構密切相關的光譜學特性[30,39]。因此，用紫外光譜法研究MGML與DNA的相互作用。圖6A顯示，當DNA質量濃度一定時，隨著MGML質量濃度的增加，其最大吸收峰豐度也隨之增強，出現了明顯的增色效應，這可能與DNA雙螺旋結構的損傷有關[30]。表明MGML可能與DNA的雙螺旋結構作用，影響其行使正常功能。

EB競爭性結合實驗用于進一步證明MGML與短小芽孢桿菌DNA之間的相互作用。由光譜學性質可知，游離的EB和DNA在水性環境下熒光強度非常低，而當EB與DNA結合后可使熒光強度明顯增大。因此，使用EB作為熒光探針研究DNA與MGML之間的相互作用。為確定DNA-EB的最佳比例，固定EB的質量濃度為 50 ng/μL，改變DNA的質量濃度（44、84、94、104、114 ng/μL）。圖6B顯示，隨著DNA質量濃度的增加，體系的熒光強度逐漸增加，當DNA質量濃度不小于 94 ng/μL時，體系的熒光強度不再變化，即當DNA-EB質量濃度比為1.88∶1時，系統達到飽和狀態。

固定DNA-EB的質量濃度比為1.88∶1，向其中加入不同質量濃度的MGML（圖6C）。可觀察到隨著MGML質量濃度的增加發生了明顯的熒光猝滅現象，且質量濃度越大，效果越明顯。據報道，EB與DNA結合是典型的插嵌模型，結合常數為2h 106L/mol[39]。因而用MGML取代EB是不可能的，所以，熒光猝滅可能是由于MGML與DNA-EB復合物的結合，并且溝槽結合可能是重要的結合模式[28]。

圖 6 MGML與DNA的相互作用Fig. 6 Interactions between MGML and DNA

2.8 SDS-PAGE分析結果

圖 7 用MGML處理和未處理的短小芽孢桿菌的細胞可溶性 蛋白質的SDS-PAGE圖譜Fig. 7 SDS-PAGE profiles of cellular soluble proteins from B. pumilus treated and untreated with MGML

由圖7可知，經MGML處理后的蛋白圖譜與對照組的蛋白圖譜明顯不同。對于小分子蛋白（小于14.4 kDa），隨著作用時間的延長和MGML質量濃度的增加，蛋白條帶減弱甚至消失，這可能是由于細胞膜受損將小分子蛋白質泄漏到外部環境中，從而導致蛋白質含量降低，這與細胞成分釋放到無細胞上清液中蛋白質含量變化結果一致（圖3）。相反，隨著作用時間延長和MGML質量濃度的增加，大分子蛋白（25 kDa）的條帶變得更亮，可能與細胞膜受損有助于大分子蛋白的提取有關。比較處理組與對照組，當其他大分子蛋白條帶灰度隨著作用時間延長和MGML質量濃度增加而增強時，一條約25 kDa的蛋白條帶灰度減弱，表明MGML可能還會干擾或阻斷細菌某些蛋白質的合成[29]。

3 結 論

本實驗通過MIC、細菌生長曲線、細胞膜完整性、掃描電子顯微鏡及菌體DNA和蛋白質的變化，研究了MGML對短小芽孢桿菌的抑菌機理。結果表明，MGML的MIC為0.313 mg/mL，可對短小芽孢桿菌產生較明顯的抑制作用；各指標測定結合掃描電子顯微鏡結果表明，MGML可使細胞膜的通透性增大，破壞細胞膜的完整性，使細胞內物質外泄，影響菌體正常生長代謝，最終導致菌體死亡；DNA結合實驗表明，MGML可對菌體DNA產生影響，從而影響菌體分裂繁殖，抑制細菌的生長。

這些結果表明，MIC的MGML作為抗短小芽孢桿菌菌株的抗菌劑是有效的，MGML可以作為食品工業中一種潛在的生物食品防腐劑，為其向天然、安全的方向發展提供理論參考和研究思路。