NLRP3炎癥小體在糖尿病心肌病（DCM）中作用機制的研究進展

趙奕凱（綜述） 吳幫衛 李 劍（審校）

（復旦大學附屬華山醫院心內科 上海 200040）

自1972年Rubler等首次報道糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）以來，眾多研究表明DCM是一種獨立于高血壓、冠心病的特異性心肌病，其發病率高、危害性大［1］。DCM的病理生理機制尚不清楚，代謝紊亂、氧化應激、微循環障礙、心肌纖維化等先后被證實參與了其病理生理過程，其中炎癥反應起到關鍵作用［2］。研究發現，在臨床上糖尿病合并心衰患者以及DCM動物模型中，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素-6（interleukin 6，IL-6）、IL-1β、IL-37、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、血管內皮黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、細胞內黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等多種炎性介質表達升高［3］。早期的炎癥反應是應對高糖損害的保護性反應，若高糖損害持續存在，慢性化的炎癥反應最終將導致心肌細胞肥厚、凋亡以及心肌組織纖維化［3］。

炎癥小體是一組參與多種疾病炎癥、免疫和代謝異常進程的蛋白復合體，可識別多種微生物、應激和損傷信號，激活caspase-1，誘發一系列前炎癥因子的活化和一種特殊的細胞程序性死亡——細胞焦亡［4］。常見的炎癥小體包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRC4（NOD-like receptor family CARD domain containing 4）和AIM2（absent in melanoma 2），其中最為重要的是NLRP3炎癥小體［5］。既往許多研究已發現NLRP3炎癥小體及其組分、IL-1β 和IL-18等炎癥因子在DCM動物心肌組織中明顯升高［6］。NLRP3基因沉默后相關炎癥因子表達明顯降低，心臟炎癥、細胞凋亡、心肌纖維化和超聲結構的異常明顯改善［6］。這些研究表明NLRP3炎癥小體在DCM的發生中發揮關鍵作用。本文主要就近年來對NLRP3炎癥小體在DCM中的作用機制研究進行綜述。

NLRP3炎癥小體的分子結構NLRP3是模式識別受體中NLRs（nucleotide-binding and oligomerization domain-/NOD-like receptors）家族的一員，由1 016個氨基酸組成，包括NACHT結構域［NAIP（NLR family，apoptosis inhibitory protein）、CIITA（class II，major histocompatibility complex，transactivator）、HET-E（plant het gene product involved in vegetative incompatibility）、TP-1（telomerase-associated protein 1）］、亮氨酸重復序列（C-terminal leucine-rich repeats，LRRs）及PYD結構域（pyrin domain）3個部分［6］。NLRP3的產生依賴于NF-κB通路，這一通路同時也是DCM其他多條炎癥信號通路必需的關鍵環節［3］。當細胞接受相關刺激信號后，抑制NF-κB的蛋白激酶被降解，NF-κB轉移至細胞核，上調NLRP3、pro-IL1β、pro-IL-18等基因表達。表達的NLRP3出細胞核，受到細胞內特定的信號刺激后發生寡聚化，其PYD結構域與含CARD（C-terminal caspase recruitment domain）結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）的PYD結構域結合，ASC的CARD結構域再和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1，pro-caspase-1）的CARD結構域結合，從而使NLRP3、ASC和pro-caspase-1三者構成了完整的NLRP3炎癥小體而激活［7］。

NLRP3炎癥小體在DCM中介導的炎癥信號通路IL-1β、IL-18炎癥因子的表達以及活化需要兩大步驟：調控NLRP3和pro-IL-1β、pro-IL-18表達的起始步驟，以及裝配NLRP3炎癥小體，激活caspase-1后剪切pro-IL-1β、pro-IL-18至活性形式的激活步驟（圖1）。

起始步驟 NLRP3表達依賴于NF-κB通路，這也是多條炎癥信號介導心肌組織炎癥反應的共同通路。但NLRP3產生的起始步驟尚未研究清楚，已知高糖和高脂介導的活性氧（reactive oxygen species，ROS）在這一過程中占主要作用，ROS可以由PKC-和Rac1依賴的NADPH氧化酶產生，此外線粒體的功能異常、RAAS系統激活等多種途徑也能產生ROS，激活NF-κB信號通路［8］。PAMPs、DAMPs識別PRRs后也可激活NF-κB，導致NLRP3表達的升高［9］。

激活步驟 NLRP3產生后在細胞質內保持未活化狀態，需經相關刺激后發生寡聚化［8］，其PYD結構域與ASC的PYD結構域結合，ASC的CARD結構域再和pro-caspase-1的CARD結構域結合，才能構成完整NLRP3炎癥小體。許多病原體或宿主來源的配體都能激活NLRP3炎癥小體，包括病原相關分子模式、細菌成孔毒素、瘧原蟲色素、二氧化硅、石棉、紫外線和ATP等［7］。DCM相關的激活途徑主要有ROS相關途徑，P2X7受體相關途徑，溶酶體相關途徑以及線粒體功能異常等途徑。

ROS相關激活途徑 長期高糖和高脂刺激心肌細胞內ROS過度產生，ROS促使細胞內DNA、蛋白等多種成分發生氧化修飾，同時還介導NLRP3炎癥小體的聚集和活化［6］。有研究發現ROS能從硫氧還蛋白相互作用蛋白-硫氧還蛋白（thioredoxin interacting/inhibiting protein-thioredoxin，TXNIPTXN）復合物中解離出TXNIP，游離的TXNIP能調節NLRP3炎癥小體的形成和激活［10-11］；瑞舒伐他汀可以通過TXNIP途徑抑制NLRP3炎癥小體的激活［12］。此外，ROS還可以打開細胞膜的鈣離子通道TRPM2導致鈣離子內流，激活NLRP3炎癥小體［8］。

P2X7受體相關途徑 P2X7受體是心肌成纖維細胞膜上的以ATP為配體的離子門控通道，細胞外的ATP刺激該離子通道開放，引發K+外流和泛連接蛋白（pannexin-1）膜通道的形成，胞外各種NLRP3激動劑便能進入胞內，促進NLRP3炎癥小體的聚集和活化［11］。外源性的H3松弛素能夠明顯減弱P2X7受體介導的NLRP3炎癥小體激活，抑制高糖環境下心臟成纖維細胞膠原合成［13］。使用ROS激動劑H2O2和ROS抑制劑NAC都不會影響P2X7受體的表達，提示P2X7受體相關途徑可能是獨立于ROS途徑之外的一條激活通路［13］。

溶酶體相關途徑 NLRP3炎癥小體的激活存在于痛風、硅肺、動脈粥樣硬化、阿爾茲海默癥和DCM等多種疾病中，溶酶體的損傷是他們共有的激活通路［14］。細胞外尿酸、結晶體或特殊顆粒被內吞入細胞，導致溶酶體膜透化，溶酶體釋放的內容物可促進NLRP3炎癥小體的聚集和活化［15］。

線粒體功能異常途徑 高糖處理H9C2細胞，可誘導線粒體氧化應激并釋放細胞色素C，后者直接作用于NLRP3，促進炎癥小體的形成；用傳統中藥七葉膽甙可以抑制ROS的產生，以及NLPR3的激活；進一步用細胞色素A（細胞色素C的抑制物）也能明顯抑制NLRP3炎癥小體活化［9］。線粒體膜穩定性被破壞以后還能釋放ROS、線粒體DNA、心磷脂進一步激活NLRP3炎癥小體［16］。

其他激活方式 在巨噬細胞中，膽固醇結晶可通過誘導溶酶體損傷的途徑激活NLRP3炎癥小體［17］。氧化的低密度脂蛋白膽固醇與細胞膜上的CD36相互作用，能促進細胞內可溶物向結晶體的轉化，導致溶酶體損傷和破裂［18］。ATP、尼日利亞菌素、刺尾魚毒素等則可以通過P2X7受體途徑，促進ROS生產、鉀離子外流激活NLRP3炎癥小體［19］。低鉀也是參與NLRP3炎癥小體激活的可能因素，當細胞內鉀離子濃度低于90 mmol/L時，NLRP3炎癥小體會自動生成，而高鉀時這一過程被抑制。二氧化硅、鋁鹽等同樣也可激活NLRP3炎癥小體［7］。然而，這些途徑大部分存在于巨噬細胞、血管內皮細胞中，而心肌細胞、心肌成纖維細胞內是否存在這些激活途徑還有待進一步驗證。

NLRP3炎癥小體在DCM發生發展中介導的效應

炎癥反應 NLRP3炎癥小體形成后，募集并誘導pro-caspase-1自我剪切為活化的caspase-1。活化的caspase-1將pro-IL-1β、pro-IL-18剪切為具有活性的IL-1β、IL-18。IL-1β 是一種重要的促炎因子，通過激活IL-1R下游信號通路，誘發一系列炎癥反應。用NLRP3-miRNA干預后，心肌組織中IL-1β、IL-18的水平明顯降低［6］。

細胞焦亡 caspase-1在剪切pro-IL-1β、pro-IL-18的同時，還能聯合其他相關的caspase（如caspase-11），觸發gasdermin D（GSDMD）的N端寡聚化，使細胞質膜孔道形成，誘發特殊細胞程序性死亡——細胞焦亡［4］。細胞焦亡是依賴于caspase-1的死亡方式，細胞膜孔道形成和細胞核DNA斷裂是細胞焦亡啟動后兩個明顯的特征，細胞膜孔道形成有利于細胞外基質的內滲和細胞內炎癥因子的外溢，最終導致細胞腫脹破裂和局部的炎癥反應。高糖刺激的大鼠心肌細胞中可見caspase-1高表達，心肌細胞出現細胞器腫脹，細胞核DNA斷裂等的細胞焦亡特征性改變，用NLRP3基因沉默技術可以有效抑制caspase-1在體內和體外水平的活化，減輕細胞器腫脹和DNA損傷，抑制細胞焦亡［6］。

心肌纖維化 NLRP3炎癥小體激活也參與心肌纖維化病理生理過程。在DCM的病理情況下，這條信號通路被激活，心肌成纖維細胞會在IL-18、IL-1β 等炎癥產物的長期刺激下合成大量的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，導致過度的膠原堆積、心肌組織纖維化和心臟重構［20］，而黃芪夾苷便可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活途徑，減少膠原的合成達到抗心肌纖維化的目的［21］。研究發現心肌成纖維細胞接受TGF-β 刺激后，NLRP3表達也會升高，提示NLRP3參與了心肌纖維化過程［22］。NLRP3炎癥小體在DCM纖維化過程中的具體分子機制還有待進一步探究。

對NLRP3炎癥小體通路的負調控研究

抑制NLRP3炎癥小體信號通路的起始步驟瑞舒伐他汀可以通過抑制TXNIP來降低NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA表達，改善肌纖維紊亂和線粒體腫脹［12］。外源性的硫化氫可以通過抑制TLR4/NF-KB通路，從而抑制心肌細胞NLRP3炎癥小體激活［23］。鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑達格列凈也可以明顯降低NLPR3炎癥小體相關成份基因表達，提高糖尿病小鼠心功能［24］。

抑制NLRP3炎癥小體信號通路的激活步驟H3松弛素是胰島素樣生長因子超家族的一員，能通過減弱ROS和P2X7受體介導的NLRP3炎癥小體激活，抑制高糖環境下心肌成纖維細胞膠原合成［13］。傳統的中藥七葉膽甙干預高糖環境下的H9C2細胞后，細胞質ROS和細胞色素C釋放水平下調，NLRP3炎癥小體激活被抑制，CRP、IL-1β、IL-18炎癥因子水平明顯降低［9］。Nrf2激活劑是一種主要的內源性抗氧化酶調節物質，有研究發現外源性的Nrf2激活劑叔丁基對苯二酚能通過上調NADPH醌脫氫酶，使ROS產生減少，進而抑制NLRP3的激活［25］。傳統中藥苦參堿具有抗氧化和抗炎作用，能減緩晚期糖基化終末產物誘導的內皮細胞損傷；研究發現，使用苦參堿干預內皮細胞后，NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的水平均有所下降，而其能否抑制心肌細胞或心肌纖維細胞的NLRP3炎癥小體通路還待進一步研究［26］。

結語NLRP3炎癥小體是近幾年被發現參與炎癥反應、細胞焦亡過程的一種蛋白復合體，可能在DCM病理生理過程中發揮重要作用。深入研究NLRP3炎癥小體在DCM過程中的激活分子機制，有助于完善DCM病理生理機制，為DCM的防治提供新的干預靶點。