食鹽添加量對哈爾濱風干腸脂質和蛋白氧化及揮發性化合物形成的影響

溫榮欣，扈瑩瑩，殷小鈺，王 妍，孔保華，陳 倩,

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.島津企業管理（中國）有限公司，遼寧 沈陽 110000）

哈爾濱風干腸是我國北方傳統自然發酵肉制品，因其獨特的口感與風味深受消費者喜愛。其加工過程需要歷經較長時間的風干和發酵，為了抑制其中致病菌和腐敗菌的生長和繁殖，保證產品安全性和貨架期，需要較高的食鹽（主要成分為NaCl）添加量。然而，哈爾濱風干腸發酵周期較長（12～15 d），隨著風干和發酵的進行，風干腸中的水分含量不斷減少，導致終產品中NaCl含量較高（3.3%～4.0%）[1]。因此，降低干香腸中的NaCl含量受到了越來越多的關注。如若長期攝入高食鹽含量的肉制品，會增加患高血壓、中風和心血管等疾病的風險[2]。因此，世界衛生組織建議成人每日食鹽攝入量低于5 g（＜2 g Na/d）[3]，《中國居民膳食指南》也推薦成人每日食鹽攝入量不超過6 g[4]。然而，現在中國居民平均食鹽攝入量達到10.5 g/d。為減少國民食鹽攝入量，在2018年4月18日，中國疾病預防控制中心營養與健康所和中國營養學會在北京聯合召開了中國食品工業減鹽指南研討會，提出到2030年全國人均每日食鹽攝入量降低20%的目標[5]。

食鹽是肉制品加工中不可或缺的腌制材料，不僅可賦予產品咸度，增加鮮度，而且對加工特性以及品質特性的形成具有重要的貢獻作用[6]。因此，降低食鹽添加量的同時保證肉制品的品質及安全性是肉品行業亟待解決的熱點問題。關于減鹽處理通常采用NaCl替代物和直接減鹽的方式[7]。目前，研究多集中在食鹽替代物或減鹽處理對發酵香腸理化及品質特性的影響[8-9]，但其對脂質和蛋白質氧化的影響卻鮮有研究，特別是對香腸中揮發性化合物的產生水平和最終產品中香氣構成的影響。基于此，本研究采用直接減少哈爾濱風干腸中食鹽添加量的方法，考察其對風干腸發酵過程中脂質氧化、蛋白氧化及揮發性化合物生成的影響，為開發低鹽哈爾濱風干腸提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后臀肉及豬背脂、食鹽、亞硝酸鈉、綿白糖、味素、玉泉大曲、香辛料（世一堂干腸料，包含橘皮、砂仁、丁香、肉豆蔻、白芷、桂皮、小茴香）均為食品級 市購；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrofenylhydrazin，DNPH）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、1-苯氨基-8-萘磺酸鹽（1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid，ANS）等均為 分析純。

1.2 儀器與設備

HWS-70BX恒溫恒濕箱 天津市泰斯特儀器有限公司；GC-3L小型灌腸機 瑞安市鴻飛機械有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；GCMS-QP2020單四極桿型氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 哈爾濱風干腸的制備

參照Chen Qian等[10]的方法并作適當修改。本實驗共制備4 組風干腸，食鹽添加量分別為2.5%（對照）、2.0%、1.5%和1.0%。原料肉為豬后臀肉和豬背脂，將原料肉修整后分別用絞肉機在1.5 cm的孔板上絞碎，兩者以9∶1的比例混合均勻。按照配方加入1%綿白糖、0.3%味素、0.01%亞硝酸鈉、5%水、1%玉泉大曲、0.8%香辛料，并按照實驗設計加入相應的食鹽。充分攪拌后灌入豬小腸衣中，每根風干腸長度約20 cm，直徑約1.5 cm。然后將風干腸懸掛在溫度為（25f 2）℃，相對濕度為30%～50%的環境中風干1 d，然后轉移到溫度為（25f 2）℃，相對濕度為75%～80%的環境中發酵11 d。分別在第0、3、6、9、12天進行取樣，測定其脂質和蛋白氧化的程度，并測定第0、6、12天的揮發性化合物的含量。

1.3.2 脂質過氧化值（peroxide value，POV）測定

參照Vareltzis等[11]的方法并略作修改。取切碎的風干腸（2.0 g）與15 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液混合，高速均質30 s，加入3.0 mL 0.5% NaCl溶液，4 ℃、3 000h g離心10 min。收集下層液相（5.0 mL）與5.0 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液混合，并加入25.0 μL 30%硫氰酸銨溶液和25.0 μL氯化亞鐵溶液（0.4 g氯化鋇和0.5 g硫酸亞鐵各自溶于50.0 mL水中，混合并2 000h g離心5 min）。室溫反應5 min，于500 nm波長處測定吸光度。以還原鐵粉作標準曲線，最終POV表示為mmol/kg。

1.3.3 肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的提取

分別按照Liu Gang[12]和Chen Qian[13]等的方法在4 ℃條件下提取肌原纖維蛋白和肌漿蛋白。將提取出的2 種蛋白置于4 ℃環境中，在24 h內完成羰基含量、總巰基含量和表面疏水性的測定。以BSA為標準測定2 種蛋白的濃度。

1.3.4 羰基含量的測定

按照Chen Qian等[13]的方法測定蛋白質的羰基含量。取1 mL質量濃度為2 mg/mL的蛋白（肌原纖維蛋白或肌漿蛋白）溶液與1 mL濃度為10 mmol/L的DNPH在室溫下反應1 h（每15 min旋渦振蕩1 次），對照組以1 mL 2 mol/L HCl溶液取代DNPH。此后，加入1 mL 20%三氯乙酸溶液，8 500h g離心5 min，棄清液，取沉淀。將沉淀物用1 mL乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗滌3 次，在37 ℃溶于3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中保溫15 min溶解沉淀，然后 8 500h g離心3 min除去不溶物質，在波長370 nm處測定上清液吸光度。使用分子吸光系數22 000 L/（mol?cm），以蛋白質量計算羰基含量，以nmol/mg表示。

1.3.5 總巰基含量的測定

按照Ellman[14]的方法，用DTNB進行測定。取1 mL質量濃度為2 mg/mL的蛋白（肌原纖維蛋白或肌漿蛋白）溶液與8 mL Tris-甘氨酸溶液（pH 8.0，10.4 g/L Tris，6.9 g/L甘氨酸，1.2 g/L EDTA，480.48 g/L尿素）混合并均質。取4.5 mL混合液與0.5 mL Ellman試劑（10 mmol/L DTNB）反應30 min，然后10 000h g離心15 min，取上清液于波長412 nm處測定吸光度。使用分子吸光系數13 600 L/（mol?cm），以蛋白質量計算總巰基含量，并表示為nmol/mg。

1.3.6 蛋白質表面疏水性的測定

按照Chelh等[15]的方法測定肌原纖維蛋白的表面疏水性。取1 mL質量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液加入200 μL溴酚藍（1 mg/mL）溶液混勻，對照組為1 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L）加入200 μL溴酚藍。室溫下攪拌10 min，然后3 500h g離心15 min，上清液（稀釋10 倍后）在波長595 nm處測定吸光度。表面疏水性以溴酚藍質量表示，按式（1）計算：

式中：A0為對照組的吸光度；Ax為樣品的吸光度。

參照ANS熒光探針法[16]并略作調整，測定肌漿蛋白表面疏水性。取4 mL質量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的肌漿蛋白溶液，分別加入20 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液，充分振蕩后在室溫下反應20 min，測定熒光強度。熒光測定條件為：激發波長365 nm，發射波長484 nm，狹縫寬5 nm。以熒光強度對蛋白質量濃度作圖，斜率即為肌漿蛋白的表面疏水性指數。

1.3.7 揮發性化合物的測定

1.3.7.1 揮發性化合物定性及定量

參照Benito等[17]的方法并略作修改。分別在發酵第0、6、12天取樣，采用固相微萃取方法提取揮發性化合物。將切碎的風干腸（3.0 g）放入20 mL頂空樣品瓶中，加入4 μL鄰二氯苯作為內標物。在45 ℃條件下用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附30 min，然后立即將萃取頭插入氣相色譜-質譜進樣口，解吸3 min。

氣相色譜條件：InertCapWax毛細管柱（60 mh 0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度230 ℃；不分流模式進樣；以氦氣為載體，流速1 mL/min；程序升溫：柱初溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至200 ℃，再以 10 ℃/min升至230 ℃，保持2 min。

質譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z 45～500。

揮發性化合物的鑒定通過比較NIST 14質譜庫中的實驗質譜，取相似度大于90%作為鑒定結果，并且通過計算標準烷烴（C6～C20）的保留指數，與文獻報道結果相比較進行輔助鑒定。揮發性化合物的定量采用內標法，以溶于正己烷的鄰二氯苯溶液作為內標物質，定量結果以μg/kg表示。

1.3.7.2 香氣活性值（odor activity value，OAV）

參考馮云子[18]的方法，按式（2）計算OAV：

式中：C為揮發性化合物含量/（μg/kg）；T為揮發性化合物的氣味閾值/（μg/kg）。

1.4 數據統計

實驗重復3 次，每組3 個平行，結果表示為f s。數據統計分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 12.5軟件和Heml 1.0.3.7軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 食鹽添加量對風干腸POV的影響

圖 1 食鹽添加量對風干腸發酵過程中POV的影響Fig. 1 Effect of salt addition on the POV of dry sausages during fermentation

如圖1所示，POV在發酵前期（0～6 d）顯著增加（P＜0.05），說明風干腸中的脂質隨發酵時間延長逐漸發生氧化。在發酵后期（6～12 d），POV顯著降低 （P＜0.05），說明脂質初級氧化產物發生分解，生成次級氧化產物丙二醛以及其他醛、酮、酸等物質。在發酵過程中，風干腸的脂質氧化程度隨食鹽添加量的增加逐漸增高，其中添加2.5%食鹽的風干腸POV最大，這主要是由于NaCl促進了脂質氧化。一方面，NaCl破壞細胞膜結構完整性，促進氧化因子與不飽和脂肪酸的相互 作用[19]；另一方面，NaCl促進血紅蛋白和肌紅蛋白釋放鐵離子，通過鐵離子的催化作用進而促進脂質氧化[20]；另外，NaCl可抑制抗氧化酶如過氧化氫酶，谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，從而降低肉制品自身的抗氧化能力[21]。脂質氧化是風干腸在發酵過程中形成特征風味的主要途徑，脂質氫過氧化物進一步氧化或降解產生的揮發性化合物是形成風味的主要物質，適當提高氫過氧化物的降解速率有利于加快產品風味的形成。然而，脂質過度氧化易于產生酸敗味和哈喇味等不愉快的氣味，因此，控制脂質氧化程度對于產品的風味形成至關重要。

2.2 食鹽添加量對肌肉蛋白羰基含量的影響

圖 2 食鹽添加量對風干腸發酵過程中肌原纖維蛋白（A）和 肌漿蛋白（B）羰基含量的影響Fig. 2 Effects of salt addition on the carbonyl contents of myofibrillar proteins (A) and sarcoplasmic proteins (B) in dry sausage during fermentation

如圖2所示，發酵初期（0 d），肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的羰基含量分別為0.6 nmol/mg和0.9 nmol/mg，隨發酵時間的延長，2 種蛋白質的羰基含量顯著增 加（P＜0.05），這與Wu Haizhou等[22]的研究結果一致。從圖2可以看出，肌漿蛋白的氧化程度在發酵第0天大于肌原纖維蛋白，可能因為在肌肉組織中，肌漿蛋白比肌原纖維蛋白更容易與氧氣和脂質接觸。在發酵末期（12 d），隨食鹽添加量的增加，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的羰基含量均顯著增加（P＜0.05），這表明在風干腸發酵過程中NaCl作為促氧化劑，促進了蛋白質中羰基化合物的形成。

在肌肉組織中，蛋白質氧化主要由金屬離子 （Fe3＋、Cu2＋）、肌紅蛋白或脂質氧化系統引發[23]，NaCl不僅可以增強Fe3＋的活性，促進自由基的形成[24]，而且結合POV結果可知，NaCl可以促進脂質氧化，由脂質氧化形成的自由基和氫過氧化物也可以攻擊氨基酸側鏈生成羰基[23]。此外，對于肌原纖維蛋白而言，不同處理組之間的顯著差異也可能歸因于增加NaCl使離子強度增加，改變了肌原纖維蛋白的溶解度，使其結構變的松散，導致自由基和其他促氧化因子的擴散速度加快[25]。羰基的形成通常會影響肉制品的品質，一些必需氨基酸被氧化破壞后導致肉制品營養價值降低，羰基化合物與非氧化賴氨酸的游離氨基反應形成亞胺鍵，導致聚集體的形成，降低蛋白質消化率[26]。此外，蛋白質羰基化合物易形成特定的Strecker醛，作為揮發性化合物的重要組分，構成肉制品的獨特風味[27]。

2.3 食鹽添加量對肌肉蛋白總巰基含量的影響

圖 3 食鹽添加量對風干腸發酵過程中肌原纖維蛋白（A）和 肌漿蛋白（B）總巰基含量的影響Fig. 3 Effect of salt addition on the total sulfhydryl contents of myofibrillar proteins (A) and sarcoplasmic proteins (B) in dry sausages during fermentation

蛋白質巰基損失也是肉及肉制品中蛋白質氧化的標志之一，巰基被氧化后主要生成蛋白質內或蛋白質間的二硫鍵以及混合二硫化物[28]。如圖3所示，隨著發酵的進行，各組風干腸的巰基含量顯著降低（P＜0.05），這主要是因為含硫氨基酸的巰基容易受到自由基的攻擊，易發生交聯[24]。肌原纖維蛋白中巰基含量的變化比肌漿蛋白更明顯，這與Li Binbin等[29]的研究結果一致，主要是因為構成肌原纖維蛋白的肌球蛋白和肌動蛋白中巰基含量較多，易于優先成為被氧化的目標。各組風干腸的總巰基含量在發酵末期差異顯著（P＜0.05），這可歸因于NaCl對自由基形成和促氧化因子擴散的促進作用，該結果與羰基含量的測定結果一致，進一步證明了NaCl對蛋白質氧化的誘導作用。

2.4 食鹽添加量對肌肉蛋白表面疏水性的影響

圖 4 食鹽添加量對風干腸發酵過程中肌原纖維蛋白（A）和 肌漿蛋白（B）表面疏水性的影響Fig. 4 Effect of salt addition on the surface hydrophobicity of myofibrillar proteins (A) and sarcoplasmic proteins (B) in dry sausages during fermentation

在蛋白質的天然結構中，親水性氨基酸殘基暴露于水相，而疏水性基團通常存在于分子內部[30]。如圖4 所示，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的表面疏水性在發酵過程中顯著增加（P＜0.05），主要因為分子內部的疏水性基團暴露到蛋白質表面，這與Chen Qian等[13]的研究結果一致。在發酵末期（12 d），隨食鹽添加量的增加，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的表面疏水性均顯著增加 （P＜0.05）。Kobayashi等[31]研究表明，NaCl有助于魚糜中蛋白質結構的展開，導致疏水性增大。Wang Guan等[32]發現NaCl濃度升高導致肌球蛋白逐漸解離，暴露疏水性氨基酸殘基。表面疏水性的增加會導致蛋白質二級結構和三級結構發生變化，有利于蛋白質發生交聯并生成非共價聚集體[33]。此外，埋藏在蛋白質內部疏水性氨基酸的暴露可能易于蛋白酶對特定位點的識別，加速蛋白質的降解并產生更多的肽和游離氨基酸，促進風味物質的形成[34]。蛋白質還可以作為風味物質的載體，暴露的疏水區域也可增加風味化合物的結合位點，影響風味的感知度[35]。

2.5 食鹽添加量對風干腸揮發性化合物形成的影響

為了研究不同食鹽添加量對風干腸風味形成的影響，以及發酵過程中揮發性物質之間的特征差異，通過氣相色譜-質譜對發酵第0（發酵初期）、6（發酵中期）、12天（發酵末期）的樣品中揮發性化合物的含量進行測定。在所有樣品中共檢測出62 種揮發性化合物，包括6 種醛、7 種酮、19 種醇、7 種羧酸、13 種酯、10 種烯烴。如表1所示，隨著發酵的進行，揮發性化合物的種類和生成量不斷增加，在不同處理組之間存在顯著差異（P＜0.05）。

源自脂質自氧化和蛋白氧化的揮發性化合物一般具有較低的香氣閾值并在風味中占主要地位，但產生量過多時易生成不愉快氣味[36]。在風干腸中檢測出的直鏈醛，如己醛、辛醛和壬醛主要由不飽和脂肪酸過氧化反應產生[37]，而且這些醛類物質經進一步氧化生成了相對應的酸類物質。如表1所示，第0天檢測到壬醛和己酸，其他幾種醛類在發酵過程中逐漸產生并積累。發酵末期，醛類化合物的生成量隨食鹽添加量降低顯著減少 （P＜0.05），這與獲得的POV結果一致，可歸因于NaCl的促脂質氧化作用。蛋白氧化產生的羰基易與氨基酸通過美拉德反應和Strecker降解反應生成醛類[27]，在風干腸中檢測到的苯甲醛和苯乙醛正是由苯丙氨酸經過Strecker降解產生[38]。在發酵末期，食鹽添加量的減少顯著降低了風干腸中這2 種醛類物質的含量，這與羰基結果一致。

微生物代謝產生的揮發性化合物在風干腸中種類最為豐富，由表1可知，碳水化合物發酵產生的酮、醇和酸均與食鹽添加量密切相關。在發酵末期，食鹽添加量越低的風干腸，3-羥基-2-丁酮、乙醇和2,3-丁二醇的含量越高。盡管醇類物質的生成量很多，但由于它們香氣閾值較高，對風干腸的整體風味貢獻不大。然而，由碳水化合物發酵產生的乙酸、丁酸等酸類物質與風干腸特有的成熟香氣有關[39]。微生物代謝產生的揮發性化合物含量隨食鹽添加量降低而呈升高的趨勢，該結果表明降低食鹽添加量可能減少對相關微生物的抑制作用。1-辛烯-3-醇和2-壬酮是由微生物的脂質不完全β-氧化產生的，由于具有低香氣閾值，成為風干腸整體風味的主要貢獻者[40]。

乙酯類化合物在酯類化合物中最為豐富，如乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯等，都是源于微生物的酯化作用[41]。酯類化合物的產生與底物（醇類和酸類）水平以及葡萄球菌的酯酶活性有關[42]。酯類帶有果香味，并且它們的香氣閾值較低，在風干腸的整體風味中起重要作用[43]。 如表1所示，降低食鹽添加量顯著增加了酯類化合物的水平，表明低鹽處理增強了產酯酶微生物的活性，而且這也可以解釋在低鹽處理中以相同比例發現的高水平的醇類物質和酸類物質。此外，在風干腸中檢測到的少量酮、醇、酯類和所有烯烴類化合物，其主要源于香辛料，如小茴香酮、桉葉油醇、芳樟醇、乙酸香葉酯、α-律草烯和α-蒎烯等。在整個發酵過程中，這些化合物的含量逐漸增加，主要由于風干腸在該過程中水分減少濃縮所致。

通常認為OAV大于1的化合物可以作為主要風味物質，而且OAV越大風味貢獻能力越強[18]。圖5結果表明，大部分醛類、酮類和酯類物質均具有較高的OAV，而所有的酸類物質和醇類（除1-辛烯-3-醇）物質的OAV均小于1，因此在風干腸整體風味中，醛類、酮類和酯類物質占據重要地位。源于脂質氧化反應的揮發性化合物都具有較高的OAV，而且在發酵末期，源于蛋白質Strecker醛反應的苯乙醛的OAV也大于1?？梢娭|氧化和蛋白氧化對風干腸的整體風味都有較大的貢獻。

表 1 食鹽添加量對風干腸發酵過程中揮發性化合物含量的影響Table 1 Volatile compounds identified and quantified by GC-MS in dry sausages with different levels of salt addition on day 0, 6 and 12 of fermentation μg/kg

續表1 μg/kg

圖 5 食鹽添加量對風干腸發酵過程中揮發性化合物OAV的影響Fig. 5 Effect of salt addition on the OAV of volatile compounds in dry sausages during fermentation

通過以上結果可知，低鹽處理一方面通過降低脂質氧化和蛋白氧化從而減少來自這2 個途徑的揮發性化合物的生成量；另一方面增加了由微生物代謝途徑產生的揮發性化合物的生成量，改變了風干腸的整體風味構成。另外，前期研究結果表明2.0%食鹽添加量的風干腸在感官評價中可接受性最高[1]，而且風味指標的分值也超過了2.5%添加量的對照組，說明將食鹽添加量減少至2.0%改善了風干腸的整體風味構成。

3 結 論

減少食鹽添加量可顯著降低風干腸中脂質和蛋白的氧化程度，從而降低了源于這2 種氧化途徑的揮發性化合物水平，但是增加了源于微生物代謝作用的化合物水平。結果表明，風干腸的感知香氣主要是由具有較高OAV的醛類、酮類和酯類物質組成，整體而言，低鹽處理降低了終產品中這些醛類物質的水平，增加了酮類、酸類、酯類和醇類物質的水平，使得風干腸的整體風味發生改變。綜上，減少風干腸食鹽添加量至2.0%，不僅減少了產品中20%的NaCl，而且改善了產品的風味結構，有助于生產低鹽健康的哈爾濱風干腸。