超聲-微波法合成亞油酸β-谷甾醇酯

袁傳勛，張雪茹，徐 云，郭玉華，金日生

（合肥工業大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

植物甾醇廣泛存在于植物的根、莖、葉、果實和種子中[1]，是以環戊烷全氫菲為骨架的甾體類化合物[2]，有降低血脂[3]和膽固醇[4]、抗癌[5-6]、抗氧化[7]、免疫[8-9]、抗 炎[10]、抗潰瘍[11]等生理功能，被譽為“生命的鑰匙”[12]。

收稿日期：2018-12-27

基金項目：安徽省科技重大專項（16030701085）；安徽大學現代生物制造協同創新中心開放基金項目（BM2016005）

第一作者簡介：袁傳勛（1964ü ）（ORCID: 0000-0003-2464-1411），男，研究員，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail: ycx608@sohu.com

*通信作者簡介：金日生（1982ü ）（ORCID: 0000-0002-2140-6507），男，助理研究員，博士，研究方向為農產品加工。E-mail: jinrisheng@hfut.edu.cn

β-谷甾醇屬于植物甾醇的一種，具有很好的生理活性和安全性，不僅可以降低人體對飲食中膽固醇的吸收，還可以降低人體血漿中總膽固醇和低密度脂蛋白的含量[13]。張帆[14]研究了植物甾醇對Caco-2細胞中膽固醇吸收的構效關系，研究表明這6 種植物甾醇均能濃度依賴性地降低膽固醇吸收，且作用效果為β-谷甾醇＞豆 甾醇＞菜油甾醇＞星魚甾醇。近年來，以β-谷甾醇為代表的植物甾醇類越來越多地應用于食品、醫藥、保健品等[15]行業。然而，植物甾醇類化合物微溶于油，不溶于水的特點限制了它的應用。將植物甾醇與脂肪酸進行酯化反應合成的植物甾醇酯具備植物甾醇所有的優良性能，且合成的甾醇酯對抑制人體膽固醇吸收的作用優于植物甾醇[16]，另外也有研究指出植物甾醇酯能減輕非酒精性脂肪肝大鼠高脂飲食引起的肝脂肪變性[17]。與植物甾醇相比，其在油中具有更高的溶解度以及更低的熔點[18]。目前，為了進一步擴大植物甾醇的應用領域，將植物甾醇合成植物甾醇酯逐漸成為研究中的熱點。

王永高[19]指出超聲波產生的熱效應有利于空化核的產生，可以加速酯交換反應進程，吳梅等[20]指出超聲波和微波聯用可以強化傳質傳熱過程，能顯著縮短酯化反應時間。本研究利用超聲波輔助微波法合成亞油酸β-谷甾醇酯，合理利用超聲波的強穿透力、機械攪拌作用以及空化效應[21-22]，在已有微波酯化工 藝上[23-24]進行改善，與已有方法相比[25-27]，合成工藝更加簡單，大大縮短了酯化反應時間，酯化率高且合成過程中不使用額外催化劑和吸水劑，為后續分離純化工藝節工省時。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-谷甾醇（純度為95%） 西安全奧生物科技有限 公司；亞油酸（純度為95%） 山東西亞化學股份有限公司；β-谷甾醇標品（純度≥98%） 上海廣銳生物科技有限公司；亞油酸β-谷甾醇酯高純品由合肥工業大學農產品生物化工教育部工程研究中心制備，純度≥99.5%；氘代氯仿（純度≥99.99%） 北京邁瑞達科技有限 公司；正己烷、無水乙醇、碳酸氫鉀、溴化鉀均為分析純；甲醇（色級） 德國默克公司。

1.2 儀器與設備

JJ-1B恒速電動攪拌器、JP-020超聲波清洗機、EG720KG3-NR1微波爐 廣東美的廚房電器制造有限公司；DZF-6050真空烘箱 上海和呈儀器制造有限公司；E2695高效液相色（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters 公司；Nicolet 6700傅里葉紅外光（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）儀 美國Thermo Nicolet儀器 公司；Vario EL Cube元分析儀 德國Elementar公司；VNMRS600超導核磁共振波（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）儀 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

固定條件為酸醇物質的量比2∶1，每次加熱4 min，微波加熱3 次，每兩次加熱之間品置于超聲儀（120 W，80 ℃）中超聲60 s。固定其他因水平，分別考察酸醇物質的量比（0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1）、每次微波加熱時間（1、2、3、4、5、6 min）、微波加熱次數（1、2、3、4、5、6 次）、每兩次加熱之間品置于超聲儀（120 W，80 ℃）中超聲時間（0、30、60、90、120、150 s）對酯化率的影響。

1.3.2 正交試驗

表 1 L9（34）正交試驗因素與水平Table 1 Level of independent variables used for L9(34) orthogonal array design

1.3.3 最佳工藝條件驗證

以正交試驗所確定的最佳合成工藝條件對亞油酸和β-谷甾醇進行酯化反應合成亞油酸β-谷甾醇酯，驗證比較酯化率的大小。

1.3.4 亞油酸β-谷甾醇酯的純化

取正己烷80 mL，無水乙醇120 mL混勻，置于50 ℃水浴鍋中加熱至恒溫，加入0.3 mol/L的KHCO3溶液至pH 7～8，溶解所制得的亞油酸β-谷甾醇酯粗品，并移入分液漏斗中靜置分層，取上層清液，再重復萃取 一次[28]。將第2次萃取的上層清液于真空烘箱中烘干，得到純化后的亞油酸β-谷甾醇酯，下一步對得到的亞油酸 β-谷甾醇酯進行分析鑒定，亞油酸與β-谷甾醇酯化反應方程式見圖1。

圖 1 酯化反應方程式Fig. 1 Esterification reaction equation

1.3.5 反應產物的定性分析

1.3.5.1 HPLC分析檢測條件[28]：色柱：C18反相色柱（4.6 mmh 250 mm，5 μm）；流動相：丙酮-乙腈（3∶1，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進量：10 μL。

1.3.5.2 FTIR分析

F TI R儀以衰減全反射技術（attenuate d tota l reflectance，ATR）測試β-谷甾醇以及亞油酸β-谷甾醇酯的特征結構。測試范圍：4 000～525 cm1，分辨率為4 cm1；掃描次數為32 次；檢測配件：ATR。

1.3.5.4 超導NMR分析

1.3.7 油溶性

取4 份50 mL的茶籽油水浴加熱至80 ℃，邊攪拌邊加入亞油酸β-谷甾醇酯至飽和，然后分別置于5、4、25、40 ℃條件12 h，然后取茶籽油皂化洗滌處理[28]，HPLC檢測。亞油酸β-谷甾醇酯的油溶度計見式（2）：

式中：M為茶籽油總質量；M1為總亞油酸β-谷甾醇酯的質量；M0為油空白亞油酸β-谷甾醇酯的質量。同理，計β-谷甾醇的油溶度。

1.4 數據處理

所有數據均采用Origin 8.0軟件作圖，每組數據重復3 次采，數據以f s表示，采用獨立本t檢驗，用SPSS 17.0分析兩組數據之間的差異，P＜0.05， 差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因試驗結果

2.1.1 酸醇物質的量比對酯化率的影響

從圖2可以看出，酯化率隨著酸醇物質的量比的增大先減小后增大，酸醇物質的量比等于1∶1時酯化率最低為52.31%。當酸醇物質的量比小于1∶1時，即逐漸增加體系中β-谷甾醇的濃度，亞油酸的轉化率增大；當酸醇物質的量比大于1∶1時，即逐漸增加體系中亞油酸的濃度， β-谷甾醇的轉化率增大，酯化反應程度隨著酸醇物質的量比的增加而增加[30]，平衡向減少反應物的方向移動，即正向移動，符合勒夏特列原理[31]。當酸醇物質的量比達到2∶1時，酯化率已基本達到最高為78.82%，繼續增加亞油酸的濃度，酯化率不再有明顯的提高，可能是β-谷甾醇的轉化率已達到最大，酸醇物質的量比2∶1為單因試驗最優水平。

圖 2 酯化率與酸醇物質的量比的關系Fig. 2 relationship between esterification rate and molar ratio of acid to alcohol

2.1.2 微波加熱時間對酯化率的影響

圖 3 酯化率與微波加熱時間的關系Fig. 3 Relationship between esterification rate and microwave heating time

從圖3可以看出，微波加熱時間在1～4 min時，酯化率由10.06%增長到80.12%，酯化反應程度隨著微波加熱時間的延長而更加徹底，所以酯化率逐漸增高。當微波加熱時間為4 min時，酯化反應達到平衡，酯化率基本達到最高，繼續延長微波加熱時間，酯化率不再提高反而有所下降，可能是因為隨著微波加熱時間延長酯化反應過程中生成了一些副反應物質[32]，因微波加熱時間 4 min為單因試驗最優水平。

2.1.3 微波加熱次數對酯化率的影響

從圖4可以看出，隨著微波加熱次數的增加，酯化率逐漸提高，由微波加熱1 次的34.11%增加到78.22%（加熱4 次），微波加熱次數的增加即是對整體加熱時間的增加，在一定時間內酯化反應程度隨著總體微波加熱時間的延長而更加徹底，所以酯化率逐漸增高，體現了微波的熱效應[33]。當微波加熱次數為4 次時，酯化率已基本達到最高，繼續增加加熱次數，酯化率不再有明顯的提高，證明當反應已基本達到平衡時微波并不能改變反應平衡常數[34]，因微波加熱次數4為單因試驗最 優水平。

圖4 酯化率與微波加熱次數的關系Fig. 4 Relationship between esterification rate and number of microwave heating cycles

2.1.4 超聲時間對酯化率的影響

圖 5 酯化率與超聲時間的關系Fig. 5 Relationship between esterification rate and ultrasonic irradiation time

從圖5可以看出，沒有超聲波輔助時，合成亞油酸β-谷甾醇酯的酯化率僅為54.11%，引入超聲波輔助（0～150 s）后，酯化率顯著提高，超聲90 s時酯化率達到76.18%證明超聲波酯化反應具有較明顯的促進作用。產生這一現象的原因是自然狀況下β-谷甾醇粉末與亞油酸在反應體系中分為明顯的兩相，而酯交換反應只能在兩相界面發生，亞油酸較為黏稠，有很大的傳質阻力，超聲波具有強大的傳質和乳化作用，可以降低反應的活化能[35]，并且可以促進羥自由基和甲氧基的產生，從而強化酯交換反應進程[36-37]。當超聲時間為120 s時，酯化率為75.24%，有稍許降低，其原因可能是經過較長時間的間斷加熱，超聲產生的熱效應[38]小于反應體系降低的熱量，等于間接短時間降低了反應溫度，導致酯化率稍有下降。而在超聲時間為150 s時，超聲產生的熱效應在一定程度上彌補了反應體系降低的熱量，因酯化率又有所回升達到76.22%。整體來看，當超聲90 s時，酯化率基本達到最高，繼續增加超聲時間，酯化率不再有明顯提高，因超聲時間90 s為單因試驗最優水平。

2.2 正交試驗結果

表 2 L9（34）正交試驗設計及結果Table 2 L9(34) orthogonal array design with experimental results

從表2可知，RB＞RA＞RC＞RD，所以影響反應因的主次為B＞A＞C＞D，即每次微波加熱時間＞酸醇物質的量比＞微波加熱次數＞超聲時間。最佳工藝組合為：A3B3C2D2，即酸醇物質的量比2.2∶1、每次微波加熱時間5 min、微波加熱4 次、每次超聲90 s。

2.3 最佳工藝條件驗證

按照正交試驗得到的最佳合成工藝條件，即酸醇物質的量比為2.2∶1，每次微波加熱時間5 min，微波加熱4 次，每次超聲90 s 進行酯化反應，平行做3 次實驗，酯化率為（89.56f 1.24）%，高于正交試驗中各試驗結果，表明該最佳合成工藝條件能提高亞油酸β-谷甾醇酯的酯化率。

2.4 反應產物的定性分析

2.4.1 HPLC分析

圖 6 β-谷甾醇HPLC圖Fig. 6 HPLC profile of β-sitosterol

圖 7 亞油酸β-谷甾醇酯HPLC圖Fig. 7 HPLC profile of linoleyl β-sitosterol

圖6 為β-谷甾醇的HPLC圖，保留時間為14.397 min，圖7為分離純化后的亞油酸與β-谷甾醇反應產物的HPLC圖，其中有且只有一個，且其保留時間為26.098 min，證明非β-谷甾醇。在分離純化過程中過量的飽和KHCO3溶液可以充分洗去產物中未反應完全的亞油 酸[28]，又由于亞油酸β-谷甾醇酯的極性小于β-谷甾醇，在反向色中極性強的組分先流出，且與亞油酸β-谷甾醇酯高純品的出時間一致，所以保留時間為26.098 min的可能為高純度的亞油酸β-谷甾醇酯。

2.4.2 FTIR分析

圖 8 β-谷甾醇FTIR譜圖Fig. 8 Infrared spectrum of β-sitosterol

圖 9 亞油酸β-谷甾醇酯FTIR譜圖Fig. 9 Infrared spectrum of linoleyl β-sitosterol

表 3 元素分析結果Table 3 Results of element analysis%

2.4.4 NMR鑒定結果'

圖 10 亞油酸β-谷甾醇酯結構圖Fig. 10 Structure of linoleyl β-sitosterol

圖 11 β-谷甾醇的1H-NMRFig. 11 1H-NMR profile of β-sitosterol

圖 12 亞油酸β-谷甾醇酯的1H-NMRFig. 12 1H-NMR profile of linoleyl β-sitosterol

亞油酸β-谷甾醇酯的結構圖見圖10，β-谷甾醇和亞油酸β-谷甾醇酯的核磁圖分別見圖11和圖12，經過分析兩者C2、C3、C4和C9位置上的質子化學位移（表4），發現β-谷甾醇在這些位置上的化學位移均小于亞油酸β-谷甾醇酯相應位置上的質子化學位移，這是因為氫原子的電負性小于酯基的電負性。酯基的存在對質子產生誘導效應，酯基附近的H電子云密度降低，屏蔽效應減弱，質子靠近低場出，化學位移增大。

表 4 幾種不同環境的質子化學位移Table 4 Chemical shifts of protons in β-sitosterol and linoleyl β-sitosterol in different environments

經積分得出β-谷甾醇的C2C9、C3、C4上的質子質量比是2.99∶1∶1.98，約為3∶1∶2，C2和C9上的質子化學位移相同，經推測C2和C9質量比為2∶1，符合β-谷甾醇的結構式。亞油酸β-谷甾醇酯中C2和C9上的質子化學位移不同，是由于酯基對C2上的質子有更強的誘導效應，且其C2、C3、C4、C9上的質子質量比是2.02∶1.00∶2.02∶1.00，約為2∶1∶2∶1，符合亞油酸β-谷甾醇酯的結構式。

δ=0.897（s，J＝0.99，6H）、0.923（s，J＝0.92，6H）、1.016（s，J＝1.02，3H）、1.165（s，J＝1.16，3H）、1.299（s，J＝1.30，9H）、1.304（s，J＝1.30，10H）、1.314（s, J＝1.30，6H）、1.341（s，J＝1.34，2H）、1.363（s，J＝1.36，3H）、1.456（s，J＝1.46，1H）、1.49（s，J＝1.49，2H）、1.62（s，J＝1.62，5H）、1.83（s，J＝1.83，2H）、1.902（s，J＝1.90，1H）、1.943（s，J＝1.95，2H）、1.994（s，J＝1.99，1H）、2.015（d，J＝2.01，2H）、2.064（d， J＝2.04，4H）、2.36（m，2H）、2.400（m，2H）、2.768 （t，J＝2.77，2H）、4.62（s，J＝4.62，1H）、5.304（s，J＝5.33，1H）、5.334（d，J＝5.37，2H）、5.403（s，J＝5.39，2H）。

2.5 HPLC定量分析

將0.02、0.08、0.16、0.24、0.28、0.32 mg/mL的高純亞油酸β-谷甾醇酯溶液依次進，測定方法參考1.3.5.1節。分別以亞油酸β-谷甾醇酯溶液的面積和濃度作為橫縱坐標繪制標準曲線，計得出標準曲線的回歸方程為y＝1 428x36.58，R2＝0.999 6。最后測得合成的亞油酸β-谷甾醇酯經過分離純化后的純度為98.36%。2.6 油溶性分析

圖 13 β-谷甾醇和亞油酸β-谷甾醇酯的溶解度Fig. 13 Solubilities of β-sitosterol and linoleyl β-sitosterol

3 結 論

本研究優化亞油酸β-谷甾醇酯的最佳合成條件為酸醇物質的量比2.2∶1、每次微波加熱時間5 min、微波加熱4 次、每次超聲90 s，酯化率為89.56%。所得產物經過分離純化后，用HPLC分析知產物中無未反應完的β-谷甾醇，經過FTIR分析知反應中生成了酯，經過元分析知產物與所求證化合物及其吻合，經過NMR分析產物確證為亞油酸β-谷甾醇酯。最后，經過HPLC測定產物純度為98.36%，在茶籽油（25 ℃）中的溶解度為33.68%，相比于β-谷甾醇（1.33%）提高了25 倍，可以更廣泛的應用于食品、化妝品、保健品領域。至于亞油酸β-谷甾醇酯的具體的生物活性以及亞油酸和β-谷甾醇合成的亞油酸 β-谷甾醇酯在降血脂方面能否產生協同效應可以進行更加深入的研究。本合成工藝簡單，耗時短，不使用額外的催化劑，為合成甾醇酯類產品開辟了更加綠色、經濟、簡潔、高效的途徑。