大豆7S、11S蛋白的結構與熱致凝膠特性的分析

馮 芳，劉文豪，陳志剛,

（1.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095；2.河南向上食品有限公司，河南 鶴壁 456250）

大豆分離蛋白具有許多功能特性，因此廣泛應用于食品工業[1]，例如添加至肉制品中可以改善產品的質構和保水性[2]。大豆7S和11S蛋白是大豆分離蛋白的主要組分，約占組分70%以上[3]，與大豆分離蛋白的功能性質密切相關[4]。大豆7S蛋白，也被稱為β-伴大豆球蛋白[5]，約占大豆球蛋白的34%[5]，是分子質量約為150～200 kDa的三聚體共軛型糖蛋白[1]，主要由α′（≈71 kDa）、 α（≈67 kDa）和β（≈50 kDa）亞基[6]組成。大豆11S蛋白，又稱為大豆球蛋白[5]，約占大豆種子中球蛋白的42%[7]，是分子質量為300～380 kDa的六聚體非糖蛋白[1]，由酸性亞基（35～37 kDa）[8]和堿性亞基（20 kDa）[8]通過二硫鍵連接在一起[9]，大豆11S蛋白含硫氨基酸豐富，具有良好的凝膠保水性[5]。

凝膠性作為大豆分離蛋白的重要功能性質之一，不僅應用于食品工業，同時其展現的優良性能也為其他領域的應用提供廣闊前景[10]。大豆分離蛋白成膠方式較多，例如加熱、加酸、離子誘導等，均使蛋白形成凝膠[11]。蛋白凝膠性受多種因素的影響，包括內在因素如表面疏水性、巰基等因素，這些因素影響著蛋白凝膠的形成。除此之外，外在因素如蛋白質量濃度、加熱溫度、pH值、Na＋質量濃度等也是影響凝膠作用的重要因素[12]。

凝膠形成的過程首先是巰基、疏水基團等功能性基團的逐漸暴露，緊接著暴露的基團通過疏水、氫鍵、靜電相互作用或二硫鍵形成聚集體，當蛋白質濃度足夠高，會進一步形成凝膠[13]。由于蛋白質在熱凝膠形成過程中產生結構變化，因此官能團的變性以及暴露程度會影響凝膠的形成[14]。

本研究通過對大豆7S和11S蛋白的表面疏水性、巰基、粒徑等理化性質進行測定，通過傅里葉紅外光譜法對蛋白質的二級結構進行分析，并研究蛋白質量濃度、加熱溫度、pH值、Na＋質量濃度對凝膠的影響通過蛋白凝膠的硬度、膠黏性及彈性反映凝膠特性，進而探討大豆7S和11S蛋白的結構與凝膠性的關系，為改善其凝膠性及擴大應用范圍提供實驗基礎及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粉購于秦皇島金海食品工業有限公司。

三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris） 北京索萊寶科技有限公司；亞硫酸氫鈉 成都市科龍化工試劑廠；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甘氨酸、β-巰基乙醇、溴酚藍 Biosharp生物科技公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 國藥集團化學試劑有限公司；ANS-Mg、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、四甲基乙二胺 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DYY-7C型電泳儀 北京六一生物科技公司；Lab Tech紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限 公司；Varioskan Flash多功能酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；Zetasizer Nano-zeta電位儀 英國馬爾文 公司；J-26S冷凍離心機 美國貝克曼公司；IR200傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；TLP質 構儀 美國Food Technology Corporation公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆7S及11S蛋白的制備與純化

采用Liu Chun等[15]的方法進行大豆7S及11S蛋白組分的制備。通過G200柱分子篩純化大豆7S蛋白：取實驗室自制大豆7S蛋白1 mL，加入50%硫酸銨沉淀后取上清液，調pH值為6.2，離心取上清液，加0.2% TCEP。用上樣緩沖液（2.6 mmol/L KH2PO4、32.5 mmol/L K2HPO4、400 mmol/L NaCl，0.1% TCEP，pH 7.5）平衡柱后，緩慢加入蛋白溶液。

通過G200柱分子篩純化大豆11S蛋白：取實驗室自制大豆11S蛋白1 mL，加入0.2% TCEP，0.45 μm過膜后，用上樣緩沖液（2.6 mmol/L KH2PO4、32.5 mmol/L K2HPO4、400 mmol/L NaCl，pH 8.8）平衡層析柱后，緩慢加入蛋白溶液。

1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

用不連續垂直板狀凝膠電泳，濃縮膠為4%，分離膠為15%，凝膠厚度1 mm，上樣量10 μL。分離膠時恒壓80 V，濃縮膠時恒壓120 V，考馬斯亮藍R-250染色30 min，用脫色液進行多次脫色直至背景清晰。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

將干燥的溴化鉀與待測樣品按質量比100∶30充分混合，瑪瑙研缽研磨至細粉末狀，置于專用壓片機中，在10 N壓力下保持60 s，壓制成均勻透明的圓形薄片，用單純溴化鉀壓片作為空白對照。掃描范圍4 000～400 cm－1， 分辨率4 cm－1，掃描次數32 次/s。由于大豆7S和11S蛋白的二級結構信息重疊在紅外光譜的酰胺I 帶（1 600～1 700 cm－1）[16]，酰胺I帶譜峰主要歸屬于C＝O鍵伸縮振動[7]，可反映蛋白質的二級結構。通過對酰胺I帶進行基線校正，平滑處理，在二階導數基礎上采用Gauss分峰擬合的方法[17]，得到大豆7S及11S蛋白擬合圖。

1.3.4 大豆7S及11S蛋白理化性質的測定

1.3.4.1 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法[17]。將0.06 g蛋白溶于30 mL磷酸鹽緩沖溶液（2.6 mmol/L KH2PO4、32.5 mmol/L K2HPO4，pH 7.6）緩沖液中，20 ℃攪拌1 h，8 000 r/min離心30 min。分別將大豆7S及11S蛋白稀釋成一系列質量濃度40、80、120、160、200、240、280 μg/mL，用相同的緩沖液配制8 mol/L ANS-Mg溶液。每2 mL樣品加入10 μL ANS-Mg溶液，8 000 r/min離心5 min，在390 nm激發波長，470 nm發射波長下測樣品溶液的熒光強度，同時測定未加ANS的相應質量濃度的樣品溶液的熒光強度做空白。以蛋白質量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數S0[18]。

1.3.4.2 游離巰基含量的測定

用Ellman試劑法[19-20]測定游離巰基含量。配制Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.04 mol/L EDTA），用2 mol/L HCl溶液調pH值至8.0。用相同的Tris-Gly緩沖液配制質量濃度為 4 mg/mL的DTNB溶液即Ellman試劑。將5 mg/mL的蛋白溶液和Tris-Gly緩沖液1∶1混合稀釋，每5 mL稀釋溶液加入50 μL Ellman試劑，渦旋振蕩，每個樣品測3 個平行。以加入Ellman試劑的Tris-Gly緩沖液作為空白對照。樣品及空白25 ℃保溫1 h，3 000h g離心30 min，取上清液。用分光光度計測定其在412 nm波長處的吸光度，按 下式[20]計算游離巰基含量：

式中：A為吸光度；D為稀釋倍數；C為樣品質量濃度/（mg/mL）。

1.3.4.3 總巰基含量的測定

配制Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.04 mol/L EDTA、8 mol/L尿素），用2 mol/L HCl溶液調pH值至8.0，其他條件同1.3.4.2節。

1.3.4.4 粒徑的測定

將大豆7S及11S蛋白配制為50 μg/mL的溶液，上清液用0.45 μm水系濾膜過濾，然后用Zeta電位儀測定粒徑，參數設置如下：分散介質為蛋白質；分散劑為水；溫度25 ℃，平衡時間60 s，樣品池DTS0012。

1.3.5 凝膠性的測定

用質構儀對凝膠的硬度、膠黏性及彈性進行測定。測定模式和選項為TPA，測定時參數設置如下：力量感應元為50 N，選用凝膠專用探頭P12.7，形變量30%，速率60 mm/min，間隔時間3 s，最小起始力0.05 N。

1.3.5.1 蛋白質量濃度對凝膠性的影響

凝膠的制備參照唐曉婷等[21]的方法，稍作修改。

將蛋白樣品配制成蛋白質量濃度0.07～0.12 g/mL的蛋白溶液，充分溶解。用保鮮膜密封，在90 ℃的恒溫水浴鍋中加熱30 min，快速冷卻至室溫，在4 ℃冰箱內放置24 h，制得的凝膠用于測定凝膠性。

1.3.5.2 溫度對凝膠性的影響

將蛋白樣品配制成蛋白質量濃度0.12 g/mL的溶液，充分溶解，用保鮮膜密封，分別在70、75、80、85、90、95 ℃的恒溫水浴鍋中加熱30 min，其他條件同1.3.5.1節。

1.3.5.3 pH值對凝膠性的影響

將蛋白樣品配制成蛋白質量濃度0.12 g/mL的溶液，充分溶解，分別調節pH值為2～10，于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，其他條件同1.3.5.1節。

1.3.5.4 Na＋質量濃度對凝膠性的影響

將蛋白樣品配制成蛋白質量濃度0.12 g/mL的溶液，充分溶解，分別添加NaCl，制成0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012 g/mL的溶液，于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，其他條件同1.3.5.1節。

1.4 數據處理

數據以f s表示，采用IBM SPSS Statistics 20軟件進行數據分析，并用OriginPro 9.1軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 大豆7S及11S蛋白的SDS-PAGE結果分析

圖 1 大豆7S和11S蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE patterns of soybean 7S and 11S proteins

由圖1可以看出，泳道2顯示實驗室自提大豆11S蛋白被大豆7S蛋白輕微污染，而實驗室自提大豆7S蛋白主要被大豆11S蛋白的酸性亞基和堿性亞基污染。這主要是因為提取大豆7S蛋白的pH值為4.8，在此pH值條件下，溶液中所有的蛋白均被提取出來，因此溶液中殘留的大豆11S蛋白亞基及其他蛋白會污染大豆7S蛋白，使大豆7S蛋白純度降低。因此實驗室自提條件下，大豆11S蛋白純度高于大豆7S蛋白。

2.2 大豆7S和11S蛋白純化

圖 2 分子篩G200純化大豆7S（A）及11S（B）蛋白圖譜Fig. 2 Sephadex G-200 molecular-sieve chromatograms of soybean 7S (A) and 11S (B) proteins

圖 3 純化后大豆7S及11S蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE patterns of purified soybean 7S and 11S proteins

大豆7S蛋白純化（圖2A），對P1～P7處的蛋白進行SDS-PAGE分析后，P4處的蛋白純度較高，即圖3泳道2，純化后的大豆7S蛋白純度在95%以上。大豆11S蛋白純化（圖2B），對P1～P7處的蛋白進行SDS-PAGE分析后，P5處的蛋白純度較高，即圖3泳道3，純化后的大豆11S蛋白純度在95%以上。

2.3 蛋白結構性質

如圖4所示，酰胺I帶中各子峰與二級結構的對應關系：1 612 cm－1附近的吸收峰為蛋白質和多肽的側鏈吸收；1 618～1 640 cm－1為β-折疊結構；1 640～1 649 cm－1為無規卷曲結構；1 650～1 660 cm－1為α-螺旋結構；1 660～1 700 cm－1為β-轉角結構[7]。通過對各子峰積分面積的計算，得出大豆7S及11S蛋白的二級結構信息， 見表1。大豆7S及11S蛋白的二級結構中β-折疊、β-轉角含量較高；α-螺旋和無規卷曲相對含量較少。大豆7S蛋白的β-轉角及無規卷曲的相對含量略高于大豆11S蛋白，而大豆11S蛋白α-螺旋及β-折疊含量略高于大豆7S蛋白。

圖 4 大豆7S和11S蛋白紅外光譜圖Fig. 4 FT-IR spectra of soybean 7S and 11S proteins

表 1 大豆7S及11S蛋白紅外光譜酰胺I帶擬合結果Table 1 Secondary structure contents of 7S and 11S proteins based on second-derivative FT-IR spectra in the amide I region

2.4 蛋白理化性質

表 2 大豆7S和11S蛋白理化性質Table 2 Physicochemical properties of soybean 7S and 11S proteins

游離巰基與總巰基的比值反映了蛋白質三級結構的解折疊程度，游離巰基與總巰基的比值越大，蛋白的解折疊程度越高，分子結構越趨于暴露式，疏水性殘基的增強使得表面疏水性增強[22]。研究表明，蛋白質的表面疏水性顯著影響蛋白質的凝膠性等功能特性[23]。由表2可知，大豆7S蛋白的游離巰基/總巰基的比值為93.82%，高于大豆11S蛋白的82.85%，這說明大豆7S蛋白的解折疊程度高于大豆11S蛋白，蛋白質的表面疏水性主要取決于暴露在蛋白質分子表面的疏水性殘基[24]，疏水基團暴露程度大，使得大豆7S蛋白表面疏水性（136.79）也大于大豆11S蛋白（83.08），符合解折疊程度大，表面疏水性增大的規律。

由表2可以看出，大豆11S蛋白粒徑分布主要在100 nm以上，大豆7S蛋白粒徑分布主要在10～100 nm，這是由于大豆11S蛋白在中性條件下的溶解性小于在堿性條件下的溶解性，溶于水后的大豆11S蛋白形成了聚集體。蛋白質的粒徑分布越大，說明聚集體形成的越多，這會減少蛋白質表面疏水基團的暴露，從而導致蛋白質表面疏水性降低[25]，與表2結果一致。蛋白的表面疏水性也與二級結構相關，表面疏水性隨著α-螺旋、β-折疊的增大而減小，隨著β-轉角和無規卷曲的增大而增大。大豆7S蛋白的α-螺旋、β-折疊含相對量均低于大豆11S蛋白，β-轉角和無規卷曲含量均高于大豆11S蛋白（表1），因此大豆7S蛋白的表面疏水性高于大豆11S蛋白（表2）。

2.5 凝膠性結果

圖 5 蛋白質量濃度（A）、溫度（B）、pH值（C）和Na＋ 質量濃度（D）對大豆7S及11S蛋白凝膠的影響Fig. 5 Effects of protein concentration (A), temperature (B), pH (C) and Na+ concentration (D) on appearance of soybean 7S and 11S protein gels

圖 6 蛋白質量濃度（A）、溫度（B）、pH值（C）及 Na＋ 質量濃度（D）對大豆7S蛋白凝膠的影響Fig. 6 Effects of protein concentration (A), temperatures (B), pH (C) and Na+ concentration of (D) on gel texture properties of soybean 7S protein

圖 7 蛋白質量濃度（A）、溫度（B）、pH值（C）及 Na＋ 質量濃度（D）對大豆11S蛋白凝膠的影響Fig. 7 Effects of protein concentration (A), temperature (B), pH (C) and Na+ concentrations (D) on gel texture properties of soybean 11S protein

蛋白濃度是凝膠形成的決定性因素之一[26]。濃度過低時，蛋白質-溶劑的相互作用起主導作用，隨著蛋白濃度的增加，蛋白質間相互作用加強，形成的凝膠網絡結構較密實[10]。如圖5～7所示，在蛋白質量濃度為0.07～0.09 g/mL時，大豆7S及11S蛋白形成的凝膠仍具有流動性。從圖6A、7A可以看出，在蛋白質量濃度為0.1～0.12 g/mL時，凝膠硬度及膠黏性均隨著質量濃度的增大而增大，而蛋白質量濃度對大豆7S蛋白的彈性影響較小（彈性變化范圍在3.13～3.39 mm），對大豆11S蛋白彈性影響較大（彈性變化范圍在0.88～3.31 mm）。

加熱處理是使蛋白質凝膠化的常見方法[13]，隨著溫度的升高，蛋白質分子受熱變性，環狀結構展開成伸展的鏈狀，原本埋在卷曲結構內部的疏水基團暴露 出來[27]，有利于分子間通過疏水性相互作用形成交聯。當溫度為70、75 ℃時，大豆7S及11S蛋白無法形成凝膠（圖5B）。溫度低于80 ℃時，蛋白質游離巰基含量較少，且蛋白質分子間的相互接觸少，因此容易導致聚集體的形成，而不利于凝膠網絡的形成[28]。圖6B顯示，當溫度高于90 ℃，大豆7S蛋白的網絡結構破壞越嚴重，因此凝膠的硬度及膠黏性呈下降趨勢。圖7B顯示，隨著溫度升高至95 ℃，凝膠硬度及膠黏性持續增加。由圖6B、7B可知，大豆11S蛋白形成凝膠比大豆7S蛋白形成凝膠需要更高溫度，且硬度、膠黏性大豆11S蛋白也更高，主要是因為大豆11S蛋白凝膠中形成的二硫鍵數量比大豆7S蛋白形成的多[4]。

pH值的改變會影響蛋白質分子的離子化作用和凈電荷值，從而改變蛋白質分子間的相互作用以及蛋白質分子與溶劑分子結合的能力，因此會影響凝膠形成和維持的作用力[29]。實驗結果表明，大豆7S蛋白在pH 2和pH 10時不能形成凝膠，整體呈流體；pH 4和pH 5時由于靠近大豆7S蛋白的等電點（pI 4.8），蛋白質絮凝聚集不能形成凝膠（圖5C1）。圖6C顯示，大豆7S蛋白凝膠硬度在pH 6時最大，彈性在pH 7時最大。大豆11S蛋白在pH 2和pH 3時不能形成凝膠，可能是由于強酸條件下，球蛋白的空間結構在很大程度上展開，分子間的二硫鍵斷裂[30]； pH 4、pH 5和pH 6時由于靠近大豆11S蛋白的等電點（pI 6.4），蛋白質聚集不能形成凝膠，尤其是pH 6時，蛋白質聚集的同時有大量的水析出（圖5C2）。由圖7C可看出，堿性條件更適合大豆11S蛋白凝膠的形成。當pH值在等電點附近時，蛋白質分子的電荷降低，分子間相互排斥作用下降，蛋白質隨機聚合形成“粗凝膠”，這種凝膠彈性差，表面粗糙，有水析出；當pH值逐漸遠離等電點時，分子間相互排斥作用增強，聚合變得緩慢從而形成規則有序的凝膠網絡，凝膠變得透明彈性增加[31]。

中性鹽對蛋白質溶液可產生2 種影響：一是鹽離子與蛋白質分子中的極性和離子基團作用，降低蛋白質分子的活度系數，使其溶解度增加；二是鹽離子也與偶極分子水作用，使水的活度系數降低，導致蛋白質水合程度降低，使蛋白質溶解度減少，蛋白質沉淀[32]。從圖6D、7D可看出，隨著Na＋質量濃度的增加，凝膠硬度和膠黏性呈現先增大后下降的趨勢，因為低質量濃度時，Na＋屏蔽了蛋白質表面的電荷，從而減少了蛋白質分子間的靜電斥力[33]，促進了蛋白質的溶解度，同時加熱更有利于蛋白質結構的展開和基團的暴露，隨著Na＋質量濃度的加入，蛋白的變性溫度變高，蛋白質結構的展開和基團的暴露較少，同時蛋白質的重新折疊作用，不利于凝膠的形成[31]，從實驗現象也可看出，隨著Na＋質量濃度增加，蛋白質逐漸析出，凝膠的外觀形態由透明細膩變得發白粗糙（圖5D）。

因此，形成凝膠的最優條件，要同時考量凝膠的硬度，膠黏性以及彈性。大豆7S蛋白形成凝膠最優條件為蛋白質量濃度0.12 g/mL、溫度90 ℃、pH 6～8、Na＋質量濃度0.002 g/mL。大豆11S蛋白形成凝膠最優條件為蛋白質量濃度0.12 g/mL、溫度95 ℃、pH 8～9、Na＋質量濃度0.002 g/mL。

3 結 論

本研究表明凝膠性受多種因素共同影響，主要分為內在因素以及外在因素。凝膠形成首先是通過蛋白質的變性，即蛋白質構象的改變以及功能性基團（巰基、疏水基團等）的暴露[13]，這將有利于蛋白質接下來通過二硫鍵、氫鍵等相互作用，從而進一步形成凝膠。巰基、粒徑和表面疏水性這些理化指標可以反映出蛋白質分子暴露的程度，通過實驗發現實驗室自提大豆7S及11S蛋白，在水溶液中大豆7S蛋白暴露程度更大，表面疏水性也更大，這更有利于蛋白間的相互作用。但是，外界條件的改變會影響蛋白的內在因素，因此外在因素對凝膠形成也起到重要作用。

當蛋白濃度較低時，蛋白間的相互作用較弱，網絡結構薄弱不利于凝膠的形成。溫度在熱凝膠起始的變性階段起到了重要作用，蛋白質分子受熱變性，環狀結構變成鏈狀結構，疏水基團暴露更有利于分子間交聯，但是當溫度高于90 ℃時，大豆7S蛋白的凝膠網絡結構遭到了破壞，凝膠質構性下降，由于大豆11S蛋白凝膠中二硫鍵更多，因此溫度的升高更有利于大豆11S蛋白凝膠的形成。pH值影響蛋白質分子的吸引力和排斥力，因此在等電點附近，大豆7S和11S蛋白聚集沉淀，而遠離等電點凝膠變得透明且富有彈性。Na＋質量濃度在0.002 g/mL時，大豆7S和11S蛋白均能形成較好的凝膠，而隨著Na＋質量濃度的增大，凝膠質構特性逐漸降低。

凝膠的形成是內外因素共同作用的結果，分析凝膠形成的條件應該從多因素相互影響相互制約的角度分析。本研究表明，蛋白質的二級結構決定了蛋白的表面疏水性，而表面疏水性影響了凝膠的形成，同時凝膠形成的各外在因素又影響著蛋白的表面疏水性。同時，本研究對于蛋白的其他功能性質研究提供了新策略，具有一定參考價值。