黑果腺肋花楸花色苷與果膠的結合作用對其 穩定性的影響

魏婧琦，李冬男，孟憲軍

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpca Elliot），薔薇屬，又叫不老梅[1]、野櫻莓，其含有極高含量花色苷、酚酸、類黃酮等物質，具有較高的抗氧化能力，對人體健康十分有益，在歐洲也被稱作“超級梅”，其果實形狀渾圓，呈黑紫色，味道酸甜并帶有澀味，原產于北美，我國現已廣泛種植。黑果腺肋花楸中多酚類物質十分豐富，其中的山柰酚、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素等物質已被證實有抗流感、抗細胞毒性的作用[2-3]。黑果腺肋花楸多酚中花色苷占比為25%，僅次于接骨木[4]和越橘[5]。近年來，國內外研究者致力于黑果腺肋花楸花色苷的提取純化[6-8]，提取量可達361 mg/100 g。眾所周知，花色苷是植物中最常見的色素之一，具有很多生理功能，比如抑制DNA的氧化損傷，降低膽固醇[9]和心血管疾病的發病率[10]，對胰島素分泌有促進作用[11]。果膠作為天然可溶性膳食纖維[12]，除了在食品加工中作為增稠劑與穩定劑外，還具有降低血膽固醇水平、影響葡萄糖代謝[13]、降低結腸癌[14]風險等作用。

花色苷主要位于植物細胞的液泡中，在加工過程中植物組織遭到破壞，細胞壁和液泡成分相互接觸，會發生分子間相互作用[15]。進而影響花色苷的提取率，生物利用度，顏色特性和化學穩定性[16]。研究發現，果膠與花色苷結合可防止水溶性環境中花色苷的色素沉淀，增強花色苷的穩定性[17-18]，延長其半衰期[19-21]，降低花色苷在小腸中的損耗[22]。結合親和力越大，對花色苷在胃釋放或外部降解條件下的保護作用越大[23]。因此，果膠與花色苷的相互作用可能會減緩花色苷在人體內的降解，提高其在結腸環境的代謝能力。

現階段關于果膠和花色苷結合物的研究主要集中在探討結合物的穩定性及結構變化[24]，但還缺少各類因素對結合效果及其結合狀況的研究。

為了探索花色苷與果膠相互結合作用及其作用特點，本實驗采用超濾離心法測定花色苷與果膠的結合率，超濾離心法是現階段濃縮、分離樣品溶液的常用手段，通過離心作用力使超濾離心管中待分離樣品快速通過管壁的中空纖維膜，從而使不同分子質量的物質得到分離。本實驗中果膠屬于大分子物質，通過對結合物的超濾離心，即可得出花色苷與果膠的結合率。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析黑果腺肋花楸中不同花色苷與果膠的結合情況，并對結合后產物的穩定性和抗氧化活性進行測定分析，為進一步探究花色苷與果膠相互作用提供理論依據，為保護相關產品中的花色苷成分提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸（“富康源1號”）于2017年8月采自遼寧省海城市，采收當天運至沈陽農業大學食品學院實驗室，置于－80 ℃冰箱中貯藏。

藍莓果膠（食品級） 廣州西楚生物科技有限公司；無水乙醇、鹽酸、氯化鉀、無水乙酸鈉、水楊酸（均為分析純），VC 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純） 西隴科學股份有限公司；矢車菊-3-葡萄糖苷標準品 南京源植生物有限公司；胃蛋白酶（800～1 000 U/mg）、胰蛋白酶（1∶250）、脫氧膽酸鹽 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；2,2’-聯氨-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基試劑盒 碧云天生物技術有限公司；Fe3＋還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP） 試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠； BT-100B型數顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司； IT09A12型磁力攪拌器 上海一恒儀器有限公司；FA2004型電子萬分之一天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；MIX-28型迷你渦旋振蕩器 群安實驗儀器有限公司；5804R型高速冷凍離心機 艾本德生命科學公司；30kDa超濾離心管 美國默克密理博公司；PB-10型pH計 北京賽多利斯科學儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環水真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；CM-10FL型真空冷凍濃縮系統 美國Labconco公司；1290 Infinity II HPLC儀 美國安捷倫公司；130701A型酶標儀 美國博騰儀器有限公司

1.3 方法

1.3.1 花色苷與果膠結合物的制備

花色苷的提取純化參照文獻[6-8]的方法進行，并稍作改動。

將黑果腺肋花揪在常溫解凍后，破碎勻漿，置于燒杯中，按照料液比為1∶30（g/mL）加入60%的酸化乙醇（pH 2.0）溶液，攪拌后用保鮮膜封口，放置于55 ℃水浴鍋中浸提120 min。將提取液抽濾、減壓蒸餾后得到花色苷濃縮液。

花色苷濃縮液經NKA-9樹脂純化后，進行冷凍干燥，得到黑果腺肋花楸花色苷粉末。

用緩沖溶液將花色苷粉末溶解（4 mg/mL）后加入到相同體積不同質量濃度的果膠溶液中，用磁力攪拌器將兩者混合均勻，置于4 ℃避光孵育10 h。

1.3.2 花色苷含量測定

采用酶標儀法，參照王月華等[25]的方法，并稍作 改動。

準確量取2 份0.1 mL樣品分別與0.9 mL氯化鉀緩沖液（pH 1.0）和0.9 mL乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）混合后，置于室溫平衡10 min。分別在520 nm和700 nm波長處測定反應混合物的吸光度，蒸餾水為空白。花色苷含量以每升樣品中矢車菊-3-葡萄糖苷當量表示。實驗重復3 次，取平均值。花色苷含量按式（1）、（2）計算：

式中：mw為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質量（449.2）；DF為樣品的稀釋倍數；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數（269 00 L/（molg cm））；L為光程（1 cm）。

1.3.3 結合率測定

參照Lin Zhuangsheng等[26]的方法，并稍作改動。量取2 mL的結合物樣品于超濾離心管（30 kDa）中，4 ℃、14 000h g離心20 min，取管下部溶液測定花色苷含量。結合率按式（3）計算：

式中：Ci為花色苷與果膠結合物的花色苷初始質量濃度/（mg/mL）；Cj為離心后管下部溶液的花色苷質量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 單因素試驗

選取pH值、花色苷與果膠添加比例、金屬離子濃度、糖類添加量4 個因素，改變單一因素觀察黑果腺肋花楸花色苷與果膠結合率的變化，單因素試驗設計如表1所示，每個單因素試驗重復3 次，結果取平均值。

表 1 單因素試驗設計Table 1 Levels of independent variables used for one-factor-at-a-time design

1.3.5 正交試驗設計

綜合單因素試驗，選定pH值與花色苷與果膠添加比例為影響結合率的主要因素，每個因素選擇3 個水平，進行L9（34）正交試驗（表2）。

表 2 正交試驗因素與水平Table 2 Codes and levels of independent variables used for orthogonal array design

1.3.6 HPLC分析黑果腺肋花楸花色苷與果膠的相互作用

準確抽取1 mL結合樣品，與2 mL甲醇充分混合，經0.45 μm膜過濾，除去沉淀（果膠及與果膠結合的花色苷）后，置于－80 ℃環境中備用分析。

根據Bohkyung等[6]的方法，采用HPLC法測定花色苷的種類組成的方法。HPLC測定條件：Diamonsil C18色譜柱（250 mmh 4.6 mm，5 μm）；柱溫20 ℃；進樣量20 μL；檢測波長520 nm；流動相A為0.1%甲酸溶液；流動相B為乙腈；流速0.7 mL/min；梯度洗脫程序：0～40 min，0%～40% B；40～45 min，40%～45% B；45～52 min，0% B。

1.3.7 花色苷穩定性測定

1.3.7.1 熱處理對黑果腺肋花楸花色苷與果膠結合產物中花色苷穩定性的影響

將結合樣品溶液分別置于70 ℃和90 ℃（恒溫水浴）條件下，避光處理5 h，同一溫度下每隔1 h取樣，于室溫下測定花色苷含量，以相同質量濃度的花色苷溶液作為對照，計算花色苷保留率。

1.3.7.2 體外模擬消化對黑果腺肋花楸花色苷與果膠結合產物中花色苷穩定性的影響

模擬體外消化過程參照王月華[25]和劉翼翔[27]等的方法，并稍作改動。

胃消化：量取2 mL結合樣品，用10 mL生理鹽水（0.9% NaCl）稀釋后，用1 mol/L HCl溶液調節混合溶液pH值至2，隨后加入4.5 mg胃蛋白酶，混合后在37 ℃避光振蕩培養2 h。

腸消化：向胃消化后的樣品中加入NaCO3溶液調節pH值至7.5，再加入胰蛋白酶（2 mg/mL）和脫氧膽酸鹽（3.4 mg/mL），充分混合后37 ℃避光振蕩培養2 h。

2 組消化過程分別在消化30、60、90、120 min時取樣，并將樣品迅速降溫及酸化至pH 2，測定每個時間點花色苷含量，計算其保留率。

1.3.8 抗氧化活性測定

1.3.8.1 FRAP測定

參照相關文獻[6,28]方法。配制反應液：1）空白對照組：180 μL FRAP工作液＋5 μL蒸餾水；2）標準曲線組：180 μL FRAP工作液＋5 μL各濃度FeSO4標準溶液；3）測定組：180 μL FRAP工作液＋5 μL樣品。振蕩混勻，在37 ℃反應5 min后測定593 nm波長處吸光度，重復3 次取平均值，以蒸餾水作為空白對照，VC作為陽性對照。得到標準曲線為y=2.643 2x－0.392 5（R2=0.993 7），y為樣品對應的吸光度；x為FeSO4標準品濃度/（mmol/L）。

1.3.8.2 羥自由基清除能力測定

將5 0 μ L 樣 品 溶 液，依 次 加 入5 0 μ L F e S O4（6 mmol/L）、100 μL H2O2（6 mmol/L）充分搖勻后室溫放置10 min；加入50 μL水楊酸（6 mmol/L乙醇溶解），溶解后搖勻室溫放置30 min，在波長510 nm處測定吸光度，重復3 次取平均值，以蒸餾水作為空白對照，VC作為陽性對照。羥自由基清除率按式（4）計算：

式中：A0為空白組于波長510 nm處吸光度；Ai為樣品于波長510 nm處吸光度。

1.3.8.3 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參照Urszula等[29]的方法略有修改。配制反應液：1）空白對照組：200 μL ABTS工作液＋10 μL蒸餾水；2）標準曲線組：200 μL ABTS工作液＋10 μL各濃度Trolox標準溶液；3）測定組：200 μL ABTS工作液＋10 μL樣品。振蕩混勻，在37 ℃反應5 min后測定734 nm處吸光度，重復3 次取平均值，VC作為陽性對照。得到標準曲線為y=－0.760 6x＋1.039 8（R2=0.986 8），y為樣品對應的吸光度，x為Trolox標準品濃度/（mmol/L）。

1.4 數據統計分析

所有實驗重復3 次，采用Origin 8.0軟件對實驗數據進行整理繪圖，用SPSS 19.0軟件分析顯著性，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 pH值對結合率的影響

圖 1 pH值對結合率的影響Fig. 1 Effect of environmental pH on binding rate

如圖1所示，pH值對果膠與花色苷的結合具有顯著影響，這與Lin Zhuangsheng等[26]的結論一致，花色苷陽離子和游離果膠羧基之間的離子相互作用可能是結合的主要機制。

隨著pH值的升高，黑果腺肋花楸花色苷與果膠的結合率呈現先升高后降低的趨勢。當結合pH值為3時結合率最高為80.52%（P＜0.05）。這種現象的產生可能是由于酸性環境中，部分果膠發生去質子化，形成ü COO－，而花色苷分子大多以花色苷陽離子形式存在，果膠游離的羧基與帶正電的花色苷陽離子發生離子交聯，而溶液中的H＋與花色苷陽離子存在競爭關系，使得結合率在pH 3.0時到達結合峰值。

2.1.2 花色苷與果膠添加比例對結合率的影響

圖 2 花色苷與果膠添加比例對結合率的影響Fig. 2 Effect of ratio of anthocyanins to pectin on binding rate

實驗過程中始終保持花色苷質量濃度（4 mg/mL） 不變，增加果膠添加量，結果如圖2所示，果膠出現從飽和狀態至非飽和狀態的轉變，花色苷與果膠添加比例為1∶2.5時結合率達到87.96%（P＜0.05）的峰值水平。由于花色苷與果膠添加比例為1∶2與1∶2.5時結合率差異變化不大，為降低成本，節約果膠用量，選擇花色苷與果膠添加比例為1∶2進行實驗。

2.1.3 金屬離子濃度對結合率的影響

圖 3 金屬離子濃度對結合率的影響Fig. 3 Effect of metal ions on bonding rate

如圖3所示，隨著金屬離子濃度的增加，Ca2＋、Mg2＋結合率曲線均呈現逐步降低的趨勢，但Mg2＋結合率曲線降低趨勢較小（P＞0.05）。Ca2＋與結合率呈負相關。 Ca2＋、Mg2＋同時存在于酸性條件下，金屬離子與羧基之間存在一定的相互作用[30]，果膠離解的游離羧基與陽離子的交聯順序為Ca2＋＞H＋＞Mg2＋，所以Ca2＋的存在阻礙了花色苷與果膠的結合。所以在黑果腺肋花楸的食品工業生產中，以果膠作為增稠劑穩定劑的情況下，要嚴格控制生產用水的硬度，尤其是Ca2＋的含量。

2.1.4 糖類添加量對結合率的影響

圖 4 糖類添加量對結合率的影響Fig. 4 Effect of carbohydrates on bonding rate

糖類會對高甲氧基果膠體系的凝膠強度產生影響，所以分別選取果糖、葡萄糖、蔗糖研究糖類對于結合率的影響。如圖4所示，隨著糖添加量的增加，結合率無顯著差異（P＞0.05）。表明糖類添加對于花色苷與果膠的結合率無顯著影響。

2.2 正交試驗結果

表 3 正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

表 4 方差分析Table 4 Analysis of variance of the effect of various factors on binding rate

由表3可知，極差值RA為11.64，RB為4.33，說明pH值（A）對于結合率的影響要高于花色苷與果膠添加比例，最佳的結合條件組合為A2B2，即在pH 3、花色苷與果膠添加比例為1∶2.0時進行結合率最高（78.77%）。由表4方差分析可知，FA=128.020 1＞F0.05（2,2），FB=20.663 0＞F0.1（2,2），說明兩因素均對結合率存在影響，并且pH值對于結合率的影響更顯著。經驗證最優條件為pH 3、花色苷與果膠添加比例為1∶2.0。

2.3 HPLC分析黑果腺肋花楸花色苷與果膠的結合情況

圖 5 黑果腺肋花楸花色苷色譜圖Fig. 5 HPLC profile of anthocyanins from A. melanocarpa extracts

如圖5所示，共出現4 個主體峰[6,31]，依次為矢車菊-3-半乳糖苷（55.3%）、矢車菊-3-葡萄糖苷（6.1%）、矢車菊-3-阿拉伯糖苷（31.4%）、矢車菊-3-木糖苷（7.0%），這4 種花色苷占整體花色苷的99%以上。

圖 6 黑果腺肋花楸花色苷與果膠相互作用HPLC分析Fig. 6 HPLC analysis of the interaction of anthocyanins with pectin

在正交試驗所得的最佳結合條件（pH 3、花色苷質量濃度4 mg/mL、果膠質量濃度8 mg/mL）下制備結合物進行結合情況的HPLC分析檢測，根據峰面積的減少量計算結合率，以此衡量結合能力。由圖6可知，由于花色苷結構上的差異，造成了各類花色苷與果膠結合效果的不同。由于1號峰（矢車菊-3-半乳糖苷）在黑果腺肋花楸花色苷中占有較大比重，總花色苷結合率與1號峰結合率差異不顯著（P＞0.05）。前3 個峰（矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷）的結合率分別為58.05%、57.66%和58.41%，差異不 顯著（P＞0.05），全部高于4號峰（矢車菊-3-木糖苷）的結合率（51.34%）。

在花色苷與果膠的相互作用中，羥基的存在可以增強兩者結合作用，而甲氧基的存在則會對結合產生負面影響[26]。黑果腺肋花楸花色苷的糖基中，半乳糖與葡萄糖同為六碳糖，所有相較于只有5 個碳的阿拉伯糖苷和木糖苷具有更好的結合效果。而阿拉伯糖與木糖苷兩者只存在構型上的差異，阿拉伯糖屬于L（＋）構型，木糖苷屬于D（＋）構型。因此，可以推測花色苷與果膠的結合效果不僅與花色苷分子上羥基和甲氧基的數量有關，還可能受到花色苷分子糖基構型的影響。

2.4 黑果腺肋花楸花色苷與果膠結合產物的穩定性

2.4.1 熱處理對黑果腺肋花楸花色苷與果膠結合產物穩定性的影響

圖 7 溫度對花色苷與果膠結合物穩定性的影響Fig. 7 Effect of temperature on the stability of anthocyanin and pectin conjugate

將花色苷與果膠在pH 3、果膠質量濃度8 mg/mL的條件下制備結合物，進行熱穩定性實驗。隨著處理溫度升高、處理時間延長，各樣品溶液顏色均發生了明顯變化。在70 ℃條件下，隨著溫度的升高，實驗組和對照組溶液顏色逐漸由深紫紅色向淺紫色轉變。在90 ℃條件下，顏色轉變迅速加快，從深紫紅色褪至橘黃色，這是由于花色苷在熱環境下發生水解或去糖基開環反應，降解為酚酸和醛類[32]。降解速度隨溫度的升高而加快[33]。

由圖7可知，隨著溫度和處理時間的延長，各樣品溶液中的花色苷保留率都呈下降趨勢，并且90 ℃條件下花色苷降解速度明顯高于70 ℃，實驗組的花色苷保留率均高于對照組。說明果膠對花色苷分子在高溫條件下的快速降解具有抑制作用。

2.4.2 體外模擬消化對黑果腺肋花楸花色苷與果膠結合產物穩定性的影響

圖 8 體外模擬胃腸消化對花色苷與果膠結合物穩定性的影響Fig. 8 Effect of in vitro simulated gastrointestinal digestion on the stability of anthocyanin and pectin conjugate

將花色苷與果膠在pH 3、果膠質量濃度8 mg/mL的條件下制備結合物，進行體外模擬消化實驗。在pH值為2的條件下，花色苷分子以紅色黃烊鹽陽離子形式穩定存在，隨著pH值的升高，花色苷分子會從紅色黃烊鹽離子形式轉化為無色的甲醇假堿式，接著經過查爾酮式后分解成褐色物質[34]。所以花色苷在經過胃腸道消化的過程中，胃消化階段幾乎不會對花色苷造成影響。經過胃消化過后，環境pH值驟升至7.5，花色苷含量也驟減，并在2 h的腸消化階段內，從深紫紅色、淺紫色褪至黃褐色。

由圖8可以看出，添加了果膠的黑果腺肋花楸花色苷溶液（實驗組）的保留率高于不添加果膠的果腺肋花楸花色苷溶液（對照組），與熱穩定性實驗規律一致，但其對花色苷的影響程度沒有溫度對花色苷的影響程度大。可能是由于pH值對花色苷穩定性的影響較大。

2.5 黑果腺肋花楸花色苷與果膠結合產物的抗氧化活性

2.5.1 羥自由基清除能力比較分析

圖 9 花色苷與花色苷果膠結合物羥自由基清除能力比較Fig. 9 Comparison of hydroxyl radial scavenging ability of anthocyanins with that of anthocyanins and pectin conjugate

分別測定相同質量濃度（4 mg/mL）下花色苷溶液、花色苷果膠結合溶液的羥自由基清除能力，結果如圖9所示。以VC作為陽性對照，得出VC羥自由基清除標準曲線為y=0.263 5x＋0.061 8，R2=0.949 9，x為VC標準品質量濃度/（mg/mL），y為羥自由基清除率。由圖9可知，花色苷溶液與結合物的羥自由基清除率分別為55.24%和45.1%，相當于1.86 mg和1.48 mg VC當量，且兩者差異顯著（P＜0.05）。說明果膠與花色苷的結合使花色苷的羥自由基清除能力減弱，但結合物仍然具備1.48 mg VC當量的羥自由基清除能力。

2.5.2 ABTS陽離子自由基清除能力比較分析

圖 10 花色苷與花色苷果膠結合物ABTS陽離子自由基清除能力比較Fig. 10 Comparison of ABTS radical cation scavenging ability of anthocyanins with that of anthocyanins and pectin conjugate

分別測定相同質量濃度（4 mg/mL）下花色苷溶液、花色苷果膠結合溶液ABTS陽離子自由基清除能力，結果見圖10。以VC作為陽性對照，得出VC清除ABTS陽離子自由基標準曲線為y=15.85x－0.276 6，R2=0.99，x為VC質量濃度/（mg/mL），y為Trolox標準品 濃度/（mmol/L）。由圖10可知，花色苷溶液與結合物的ABTS陽離子自由基清除效果相當于2.50 mmol/L和1.33 mmol/L的Trolox當量，相當于0.17 mg和0.1 mg的VC當量，且兩者差距顯著（P＜0.05）。說明花色苷與果膠結合后對ABTS陽離子自由基清除能力產生了一定的負面影響，但結合物仍然具有0.1 mg VC當量的ABTS陽離子自由基清除能力。

2.5.3 FRAP比較分析

圖 11 花色苷與花色苷果膠結合物對FRAP比較Fig. 11 Comparison of Fe3+ reducing ability of anthocyanins with anthocyanins and pectin conjugate

分別測定相同質量濃度（4 mg/mL）下花色苷溶液、花色苷果膠結合溶液的FRAP，結果見圖11。以VC作為陽性對照，得出VC的FRAP標準曲線為y=7.421x－0.130 1，R2=0.989，x為VC質量濃度/（mg/mL），y為Fe2＋標準品濃度/（mmol/L）。由圖11可知，花色苷溶液與結合物分別能還原1.50 mol/L和0.28 mol/L Fe2＋， 相當于0.22 mg和0.06 mg VC當量，且兩者差異顯 著（P＜0.05）。說明果膠與花色苷的結合對花色苷的FRAP產生了負面影響，但結合物仍然具有0.06 mg VC當量的Fe3＋還原能力。

3 結 論

本研究通過單因素試驗比較pH值、花色苷與果膠添加比例、金屬離子濃度和糖添加量對結合率的影響，結果表明，pH值和花色苷與果膠添加比例對黑果腺肋花楸花色苷與果膠的結合效果影響顯著；在pH值為3，花色苷與果膠添加比例為1∶2的條件下，結合率可達78.77%；Mg2＋和糖類物質對結合效果影響不顯著，Ca2＋的添加則會抑制結合作用。

結果表明，不同類型的花色苷與果膠具有不同的結合效果，結合效果不僅與花色苷分子上羥基和甲氧基的數量有關，還可能受到花色苷分子糖基構型的影響。果膠可以提高花色苷在體內以特殊結構存在的時間，防止花色苷分子在高溫處理和堿性條件下的快速降解。同等質量濃度下的花色苷溶液與果膠結合后的花色苷抗氧化能力有一定程度上的減弱，但仍具備較強的抗氧化能力。

研究結果為黑果腺肋花楸花色苷與果膠作用機理研究提供理論基礎，對于黑果腺肋花楸相關產品的開發具有指導意義。