山楂葉多糖對發酵乳品質及抗氧化活性的影響

趙巖巖，趙圣明,2,，李 帥，康壯麗,2，王正榮,2，朱明明,2，趙 璐，馬漢軍,2，何鴻舉,2

（1.河南科技學院食品學院，河南 新鄉 453003；2.河南省畜禽產品精深加工與質量安全控制工程技術研究中心，河南 新鄉 453003；3.吉林農業科技學院食品工程學院，吉林 吉林 132101）

乳和乳制品由于其富含蛋白質、乳糖、礦物質和維生素等營養物質，目前已經成為人們飲食結構當中重要的組成部分[1]。許多國家人們都在大量的消費乳制品，但是常見的鮮乳或乳粉中功能活性物質的種類較少，已經不能滿足現代消費者對于營養保健的需要。而發酵乳制品不僅保留了原乳的營養品質，并且經過發酵后具有良好的風味以及能產生多種有益健康的功能成分，如乳酸菌代謝產生多種人體必須的維生素，可以滿足人體的營養需要，同時還可產生多種酶類、多肽類和多糖類等，不僅具有清除自由基起到抗氧化延緩衰老的作用，而且還具有提高機體免疫力、維持腸道菌群平衡、防止便秘、降低膽固醇[2]、降血壓及抗癌等多種功效[3-5]。此外還能通過發酵過程中分解乳中的乳糖，從而緩解由于乳糖不耐癥所引起的腹痛、腹泄等腹部不適癥狀。因此，目前發酵乳已經成為深受人們喜愛的功能保健食品[6-7]。

目前，國內外學者已經將多種天然產物應用于功能發酵乳的開發研究中，如沙棘[8]、藍莓[9]、紫薯提取物[10]， 螺旋藻[11]、山核桃[12]等，用于改善發酵乳的風味和品質量，以及增加其保健功能等。同時也有許多研究將杏鮑菇多糖[13]、靈芝多糖[14]、松茸多糖[15]、紅棗多糖[16]和凝膠多糖[17]等應于發酵乳的研究開發中，結果發現不僅可以改善發酵乳的感官品質，還可以提供益生菌活性以及提高發酵乳的抗氧化活性等。此外由于多數多糖化合物都具有一些特殊的生理活性，如枸杞多糖、松茸多糖、藠頭多糖和松花粉多糖等具有抗氧化、免疫調節和腫瘤等功效[18]，因此將活性多糖用于功能性發酵乳的開發具有廣闊的應用前景。山楂葉多糖是一種功能活性多糖，具有降血壓、降血脂和抗氧化等活性功能[19-20]，目前國內對山楂葉多糖的研究僅限于提取工藝方面[20-21]， 而關于山楂葉多糖對發酵乳品質影響的研究鮮見相關報道。且河南新鄉南太行山區野生山楂樹資源豐富，將山楂葉變廢為寶，開發山楂葉作為功能活性物質的新來源，提取山楂葉多糖用于開發功能性食品，具有廣闊的市場前景。本研究以山楂葉多糖和發酵乳為研究對象，通過測定不同添加量山楂葉多糖發酵乳的乳度、乳酸菌活菌數、持水力、質構、流變和抗氧化活性等，研究山楂葉多糖對益生菌發酵乳的品質影響，為新型山楂葉多糖益生保健發酵乳的開發提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

山楂葉采自新鄉南太行山山區；生鮮牛乳購自河南省新鄉市段村奶牛養殖場。發酵劑（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌）為河南科技學院食品微生物實驗室保藏。

1.1.2 試劑與培養基

水楊酸、鐵氰化鉀 國藥集團化學試劑有限公司；硫酸亞鐵 天津科密歐試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海 阿拉丁試劑有限公司；三氯乙酸 上海山浦化工有限 公司；其他試劑均為市售分析純。

乳酸菌培養基（MRS培養基） 青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Sartious電子精密天平 北京賽多利斯天平有限 公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺 蘇州蘇凈集團；5418高速離心機 芬蘭Eppendorf公司；Orion 3 STAR pH計 美國Thermo公司；GXZ-9240 MBE鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；冷凍干燥機 德國Christ公司；TA-XT.plus質構儀 英國Stable Micro Systems 公司；TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；HH-42水浴鍋 常州國華電器有限公司；HAAKEMARS流變儀 美國Thermo Scientific公司； CR-400色差計 日本美能達公司。

1.3 方法

1.3.1 山楂葉多糖提取

選取新鮮的山楂葉洗凈烘干后粉碎，參考Yuan Qingxia等[22]的方法，取山楂葉干粉進行熱水浸提，提取條件：溫度90 ℃、添加量40 g/L、提取時間4 h。浸提結束后4 000 r/min離心20 min，收集上清液。向上清液中加入3 倍體積無水乙醇醇沉，4 ℃放置過夜， 5 000 r/min離心10 min得沉淀物。采用蒸餾水復溶沉淀后，真空冷凍干燥得到山楂葉粗多糖。山楂葉粗多糖的純度為70.28%。

1.3.2 山楂葉多糖發酵乳制備

100 mL的鮮牛乳經65 ℃預熱加入5%蔗糖溶解后，分別加入0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.2%的山楂葉多糖，在95 ℃巴氏殺菌10 min，待冷卻到室溫后，分別接種1‰的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌復合菌粉，在42 ℃的恒溫培養箱中發酵6 h，冷卻后放入4 ℃冰箱后熟24 h制得山楂葉多糖益生菌發酵乳[23]，以不添加山楂葉多糖的樣品為對照組。

1.3.3 乳酸菌活菌數測定

將加入不同比例山楂葉多糖的發酵乳，采用MRS平板計數法進行乳酸菌活菌數的測定[13]。

1.3.4 持水力測定

稱取50 mL離心管的質量記為M0，將加入10 mL山楂葉多糖發酵乳的離心管質量記為M1。經3 000 r/min離心10 min的樣品靜置10 min后棄去上清液，稱量質量記為M2，平行測定3 次取平均值。持水力計算如式（1）所示：

1.3.5 酸度測定

pH值測定：采用精密pH計測定。

滴定酸度測定：取冷卻后熟后的添加不同比例山楂葉多糖發酵乳樣品，分別取10 mL發酵乳樣品于250 mL錐形瓶中，加入20 mL蒸餾水混勻，再加入適量酚酞指示劑，以0.1 mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色，且30 s內不退色。記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，乘以10即為樣品的滴定酸度（吉爾涅爾度）[24]。

1.3.6 色澤測定

采用CR-400色差計測定發酵乳的L*值、a*值和b*值[25]。采用標準比色板進行校正，標準比色板為L*=97.22、a*=－0.14、b*=1.82。其中L*表示亮度值， a*表示紅度值，b*表示黃度值。

1.3.7 質構測定

參考Bedani等[26]方法，略有改進。采用質構儀選擇質地剖面分析測試模式和P/0.5探頭對發酵乳的凝膠結構進行測定。速率分為測前2.0 mm/s、測中1.0 mm/s和測后2.0 mm/s；下壓間隔時間為1 s；最小觸發力為0.3 N。

1.3.8 儲能模量和損失模量測定

采用HAAKEMARS流變儀測定發酵乳的儲能模量和損失模量[27-28]。使用50 mm實心定轉子的同心圓筒，將少量經攪拌的發酵乳樣品置于流變儀上進行測定，測定條件為溫度5 ℃，縫隙1 mm，固定頻率（0.1～20 Hz）。

1.3.9 DPPH自由基清除能力的測定

樣品均用95%乙醇溶液配制成質量濃度為0.11 g/mL溶液，向2 mL樣品溶液中加入2 mL 0.16 mmol/L DPPH溶液（溶解于95%乙醇溶液），于25 ℃水浴加熱30 min后，在517 nm波長處測得試樣吸光度（Ai）。同時以2 mL蒸餾水代替上述體系中2 mL樣品測得空白吸光度（A0）。同時以2 mL 95%乙醇溶液代替上述體系中2 mL DPPH-乙醇溶液。測得樣品本底吸光度（Aj），其中Ai和Aj每個樣品質量濃度做3 個平行，取平均值。 按式（2）計算清除率[29]：

1.3.10 羥自由基清除能力的測定

樣品均用95%乙醇溶液配制成質量濃度為0.11 g/mL溶液，向4 mL樣品溶液中加入8.8 mmol/L H2O2溶液、9 mmol/L FeSO4溶液和9 mmol/L水楊酸溶液各0.5 mL，混勻，37 ℃水浴加熱30 min，于510 nm波長處測定樣品吸光度（Ai），將體系中的樣品溶液改為加入4 mL蒸餾水，測得空白對照吸光度（A0），將加入0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液代替為0.5 mL蒸餾水時，測得樣品本底吸光度（Aj），其中Ai和Aj每個質量樣品濃度做3 個平行，按式（3）計算羥自由基清除率[30]：

1.3.11 Fe3＋還原能力的測定

樣品均用95%乙醇溶液配制成質量濃度為0.11 g/mL 溶液，向2 mL樣品溶液中加入1%的鐵氰化鉀溶液和0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）各2 mL，于50 ℃保溫20 min后加入10%三氯乙酸溶液2 mL，3 000 r/min混合離心10 min后取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液，室溫反應10 min后，測定其在700 nm波長處的吸光度[31]。每個樣品做3 個平行。

1.3.12 發酵乳感官評定

選取20 位有發酵乳感官評價經驗的食品專業教師和同學，從色澤、組織狀態、風味、口感和風味等方面，對添加不同比例山楂葉多糖的發酵乳進行感官評定，根據 表1所示的評分標準進行評分，滿分為100 分，感官評分為20 人打分的平均分值[32]。

表 1 發酵乳感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented milk

1.4 數據處理

數據采用SPSS 20.0軟件進行分析，所有實驗重復3 次，結果以f s表示，顯著性分析采用Duncan檢驗。

2 結果與分析

2.1 山楂葉多糖對發酵乳中乳酸菌活菌數的影響

表 2 山楂葉多糖對發酵中乳酸菌活菌數的影響Table 2 Effects of HLP on viable cell count of fermented milk

由表2可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，益生乳酸菌的活菌數量呈遞增趨勢，從4.42h 108CFU/mL增加至4.51h 109CFU/mL，且當山楂葉多糖添加量高于0.12%時，其益生菌活菌數顯著高于對照組（P＜0.05），至添加量為0.16%時，乳酸菌活菌數達到109CFU/mL以上，說明山楂葉多糖可以有效促進益生乳酸菌的增殖，提高發酵乳中益生乳酸菌的數量。已有研究報道天然植物多糖可以作為益生元，促進益生乳酸菌的生長[33-34]，而益生乳酸菌可以通過代謝產生維生素、多肽等功能成分，提高發酵乳的營養價值，還可抑制有害微生物的生長。因此，在發酵乳中添加山楂葉多糖可以增加益生乳酸菌的數量，提高發酵乳的益生效果。

2.2 山楂葉多糖對發酵乳持水力的影響

圖 1 山楂葉多糖對發酵乳持水力的影響Fig. 1 Effect of HLP on water-holding capacity of fermented milk

由圖1可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發酵乳的持水力呈先升高后降低的變化，不同山楂葉多糖添加量發酵乳的持水力均顯著高于對照組（P＜0.05），且當山楂葉多糖添加量為0.12%時，發酵乳的持水力達到最高為60.24%。發酵乳由于其含有大量的酪蛋白，蛋白分子之間可以形成網狀空間膠體結構，該結構可以容納水分和其他小分子物質。當添加一定量多糖后，可能進一步促進了酪蛋白之間的相互作用，因此提高了持水性[35-36]。但是當山楂葉多糖添加量高于0.16%后，可能由于過量的多糖破壞了蛋白質之間的互相聚集作用，導致乳清析出增多，從而導致持水力下降[37]。本研究與已研究報道的松茸多糖和紅棗多糖的研究結果基本一致，添加適量的天然多糖可以改善發酵乳的持水性，改善其組織狀態，提高發酵乳的品質。

2.3 山楂葉多糖對發酵乳酸度的影響

圖 2 山楂葉多糖對發酵乳滴定酸度的影響Fig. 2 Effect of HLP on titratable acidity of fermented milk

由圖2可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發酵乳的滴定酸度呈持續升高的趨勢，且不同山楂葉多糖添加量發酵乳的滴定酸度均顯著高于對照組（P＜0.05）。由于山楂葉多糖的添加可以促進發酵乳中益生乳酸菌的生長，而乳酸菌的生長過程中會利用多糖類物質進行發酵產生乳酸及其他有機酸類[38]。

圖 3 山楂葉多糖對發酵乳pH值的影響Fig. 3 Effect of HLP on pH value of fermented milk

由圖3可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發酵乳的pH值呈持續降低的趨勢，且不同山楂葉多糖添加量發酵乳的pH值均顯著低于對照組（P＜0.05），這與滴定酸度的測定結果一致。發酵乳pH值的降低主要由乳酸菌生長發酵糖類物質產生有機酸引起的[39]，pH值不僅與發酵乳的風味和凝膠特性相關，還影響到食品安全[40]。適當降低發酵乳的pH值，可以改善發酵乳的風味和組織狀態，而且較低的pH值可以抑制有害微生物的生長，提高發酵乳貯藏期間安全性。

2.4 山楂葉多糖對發酵乳色澤的影響

由表3可知，與對照組相比，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發酵乳的L*值逐漸降低，而a*值和b*值卻逐漸升高，且添加不同質量分數山楂葉多糖發酵乳的L*、a*和b*值與對照組之間具有顯著性差異（P＜0.05）。這主要因為山楂葉多糖本身具有褐色，多糖提取中摻雜了一些色素，而隨著添加量的增加，導致發酵乳的顏色逐漸變暗，賦予發酵乳咖啡色的色澤。

表 3 發酵乳的色澤Table 3 Effect of HLP on color parameter of fermented milk

2.5 山楂葉多糖對發酵乳質構的影響

表 4 發酵乳的質構特性Table 4 Effect of HLP on textural properties of fermented milk

由表4可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發酵乳的硬度、咀嚼性、黏性和內聚性呈現先增大后減小的變化，除0.20%添加量組，添加山楂葉多糖組的硬度均顯著高于空白對照組（P＜0.05），當添加量為0.16%時，其硬度達到最大值204.91 g；同時發酵乳的咀嚼性和黏性隨著硬度的變化而變化，當添加量為0.16%時，其咀嚼性、黏性和內聚性均達到最大值，分別為達到139.50、119.33和0.47。當山楂葉多糖添加量超過0.20%后，其硬度、咀嚼性、黏性和內聚性均呈現顯著下降（P＜0.05）。

添加山楂葉多糖導致發酵乳質構發生變化，可能由于適量的多糖添加，有利于增強發酵乳的凝膠狀態，導致其內部分子間相互作用力增強，相互聚集形成的網狀結構更加穩定，增強發酵乳的硬度[41]；黏性可以使發酵乳具有更黏稠的口感，在一定的范圍內，硬度和黏性高的發酵乳具有更好的口感[42]；而咀嚼性高的發酵乳會使吞咽狀態的能力需求更多，賦予發酵乳一定的黏稠口感。但是添加過量的多糖后，可能會破壞分子間的相互作用，導致形成的網絡結構變得不穩定，發酵乳質構變差[43]。

2.6 山楂葉多糖對發酵乳儲能模量和損失模量影響

儲能模量G’和損失模量G”與凝膠中作用力的大小呈正相關，G’主要表示能量高的相互作用力，而G”主要反映能量低的相互作用力。此外二者主要與發酵乳中的總固形物有關，尤其是發酵乳中蛋白質的數量和類型。如圖4所示，所有的發酵乳樣品在頻率的變化下G’和G”都具有相似的變化趨勢，可能因為樣品中的總固形物含量接近，但所有發酵乳樣品的G’都明顯高于G”，這是凝膠網狀結構所具有的典型特征，表明發酵乳形成了弱凝膠網狀結構，具有黏彈性的性質[44]。添加山楂葉多糖后，發酵乳的G’和G”都發生明顯的變化，隨著山楂葉多糖添加量的增加，G’和G”呈遞增的趨勢，變化曲線逐漸高于空白對照組。G’和G”在開始階段（頻率0～1 Hz）時均快速增加，隨后才呈現緩慢增加的趨勢，這與Sah[27]和Haque[45]等的研究結果一致。G’主要表示每個頻率變化周期貯存的能量，變高說明發酵乳體系中的相互作用力強度較高，凝膠的貯存穩定性變好。因此，添加適量的山楂葉多糖，可有效改善發酵乳的凝膠品質。

圖 4 發酵乳G’（A）和G”（B）隨頻率變化曲線Fig. 4 Changes in storage modulus (A) and loss modulus (B) with frequency for fermented milk

2.7 山楂葉多糖對發酵乳抗氧化性的影響

圖 5 山楂葉多糖對發酵乳DPPH自由基（A）、羥自由基（B） 清除能力和Fe3＋還原能力（C）的影響Fig. 5 Effect of HLP on DPPH (A) and hydroxyl (B) free radical scavenging ability and Fe3+ reducing power (C) of fermented milk

由圖5A可知，與對照組發酵乳的DPPH自由基清除率38.4%相比，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發酵乳的DPPH自由基清除能力呈現逐漸遞增的趨勢，清除率最高可達到80.7%，且各處理組均顯著高于空白對照組 （P＜0.05）。結果表明添加一定量的山楂葉多糖可以有效提高發酵乳的DPPH自由基清除能力。山楂葉多糖可能作為一種供氫物質，能夠與自由基反應形成穩定的物質，從而阻止了DPPH自由基鏈式反應[46]。

由圖5B可知，與對照組發酵乳的羥自由基清除率45.6%相比，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發酵乳清除羥自由基的能力呈現逐漸升高的趨勢，清除率最高可達到81.6%，且各處理組和空白對照組之間羥自由基清除率具有顯著差異（P＜0.05）。說明添加一定量的山楂葉多糖可以有效提高發酵乳的羥自由基清除能力。山楂葉多糖可能是一種良好的電子供體，提供給羥自由基后將其還原為OH－，從而導致羥自由基被清除。

由圖5C可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發酵乳對Fe3＋的還原能力不斷提高，且添加不同量山楂葉多糖的發酵乳的Fe3＋還原能力均顯著高于對照組 （P＜0.05）。空白對照組吸光度僅為0.24，而添加山楂葉多糖的發酵乳吸光度最高達到0.56，吸光度越高，則說明發酵乳將更多的Fe3＋還原成為Fe2＋。山楂葉多糖可能為一種良好的電子供體，所提供的電子不僅可以使Fe3＋還原為Fe2＋，還可能直接與自由基物質反應生成更穩定的物質。因此山楂葉多糖的添加可以在一定程度上提高發酵乳的抗氧化能力。

2.8 山楂葉多糖對發酵乳感官品質的影響

表 5 發酵乳的感官評分Table 5 Effect of HLP on sensory evaluation of fermented milk

由表5可知，當山楂葉多糖在0.04%～0.16%范圍時，隨添加量的增加，發酵乳的感官評分呈升高趨勢，且發酵乳的感官評價分數高于空白對照組，當山楂葉多糖添加量為0.16%時，發酵乳的感官評分最高，說明添加山楂葉多糖可以改善發酵乳的色澤、組織狀態、風味和口感。但當山楂葉多糖添加量為0.20%時，感官評分開始下降且低于空白對照組?？赡苡捎谔砑舆^量的山楂葉多糖會部分破壞發酵乳的組織凝膠結構，導致乳清析出過多，且發酵酸度過高，影響發酵乳的感官品質。因此，適量添加量的山楂葉多糖可以增加發酵乳的風味，改善發酵乳的組織狀態，提高發酵乳的口感。

3 結 論

添加山楂葉多糖可以提高發酵乳中益生乳酸菌的活菌數、滴定酸度、持水力和抗氧化活性以及改善發酵乳色澤、儲能模量、損失模量和質構特性等，當山楂葉多糖添加量為0.16%時，其硬度、黏性和咀嚼性達到最大。添加山楂葉多糖可以有效改善發酵乳的組織狀態，增強發酵乳的風味，提高發酵乳的品質。