不同載體固定化蒙氏腸球菌發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣

趙靜麗，劉遠遠，馬美湖

（華中農業(yè)大學食品科學技術學院，國家蛋品加工技術研發(fā)中心，湖北 武漢 430070）

我國是世界上蛋類生產最多的國家，蛋品加工產生的蛋殼量十分巨大[1]。每年大量廢棄蛋殼在未經任何預處理的情況下被丟棄，殘留的蛋清和其他物質容易引起微生物污染和嚴重的環(huán)境問題，并且造成資源浪費[2]。因此，提高蛋殼廢棄物的利用價值已成為研究的熱點。

蛋殼組成中約含有93%的碳酸鈣，以及少量碳酸鎂、磷酸鈣等[3]。雞蛋殼中含有豐富的鈣，是一種天然的綠色鈣源，可用作碳酸鈣材料，形成不同的鈣鹽，如檸檬酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣[4]。而蛋殼乳酸鈣與其他有機鈣鹽相比具有良好的溶解性和生物利用度[5-6]。目前蛋殼乳酸鈣主要可以通過煅燒[7]、直接中和或發(fā)酵方法制成，與前兩種方法相比，發(fā)酵方法具有綠色無污染且成本低的優(yōu)勢，符合我國的可持續(xù)發(fā)展方向[8]。然而，微生物發(fā)酵法制備乳酸鈣產率低，這很大程度限制了蛋殼廢物的有效利用。

為提高微生物發(fā)酵產乳酸鈣的能力，實驗室前期開展大量的菌種選育工作，從長期深埋廢棄蛋殼的土壤中分離1 株具有較強產乳酸鈣能力的菌株蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）。為進一步提高乳酸鈣產量，采用固定化細胞技術。固定化細胞技術是在固定化酶技術的基礎上發(fā)展起來的，常用于獲得高密度細胞[9-11]，與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，固定化細胞發(fā)酵具有連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)勢。在工業(yè)規(guī)模上，細胞固定可以有效地增加發(fā)酵罐中細胞濃度，改善細胞的操作穩(wěn)定性，并減少下游處理[12-13]。選擇合適的固定化載體對于固定化技術在實際生產中具有重要意義，目前常用的載體為海藻酸鈉（sodium alginate，SA）， 由于其固定的微生物具有生物活性高、制備簡單、對生物的毒性小等被廣泛使用[14-15]，其形成凝膠的機理是SA中鈉離子被氯化鈣中鈣離子置換形成海藻酸鈣。但是，在實際應用中由于發(fā)酵液中存在磷酸鹽體系，易使 鈣離子脫落，從而導致載體破裂和細胞泄露，不利于其應用[16]。已有研究報道，藻酸鹽凝膠可以通過添加聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）與戊醛交聯(lián)反應或發(fā)酵液中的其他鈣離子加強其機械穩(wěn)定性[17]。

考慮到蛋殼廢物的主要成分碳酸鈣可有效提供鈣離子，以解決SA-氯化鈣體系中機械穩(wěn)定性差的問題，采用SA、海藻酸鈉-聚乙烯醇（sodium alginate-polyvinyl alcohol，SA-PVA）、海藻酸鈉-活性炭（activated carbon，SA-C）作為包埋載體，通過比較其機械強度、傳質系數(shù)、細胞操作穩(wěn)定性等指標選擇最適的包埋載體，并對最適包埋載體的性質進行研究，以期為固定化細胞技術有效利用蛋殼廢物生產乳酸鈣提供一定的理論基礎，以實現(xiàn)工業(yè)連續(xù)發(fā)酵的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒙氏腸球菌CGMCC No. 8699由本實驗室從長期深埋廢棄蛋殼的土壤中分離。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g，蛋白胨0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，鹽溶液 4 mL，蒸餾水100 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基：改良種子培養(yǎng)基，根據(jù)實驗加入相應的葡萄糖和蛋殼粉。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計 美國熱電公司；真空干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司；恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；立式殺菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；多功能微生物自動測量儀 芬蘭Growthcurves Ab公司；質構儀 英國Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋殼粉的制備

新鮮蛋殼用蒸餾水沖洗，除去表面污垢以及膜上殘留的蛋清液，1 mol/L NaCl溶液浸泡2 h后用蒸餾水沖洗，接著用100 mmol/L EDTA溶液，pH 8.5浸泡2 h，25 ℃烘干。將烘干后的蛋殼經粉碎機短時（10 s）粉碎，200 目篩分出蛋殼粉，與水按料液比1∶10（g/mL）、 600 r/min攪拌15 min，溶液經抽濾烘干得到蛋殼粉[18]。

1.3.2 菌株生長曲線的測定

取蒙氏腸球菌液100 μL于MRS肉湯培養(yǎng)基中活化24 h，將已活化的菌液按2%的接種量接種于內含100 mL種子培養(yǎng)基中，同時以種子培養(yǎng)基作為空白對照，37 ℃振蕩培養(yǎng)，并于600 nm波長處使用多功能微生物自動測量儀測定其生長曲線。

1.3.3 細胞固定化方法

SA載體固定化：菌懸液與等體積SA溶液混合并攪拌5 min，SA質量濃度為20 g/L，將混合溶液置于無菌注射器（5 mL）中并使其逐滴滴入100 mL 20 g/L CaCl2溶液中，并將小球放在37 ℃硬化30 min，然后用無菌蒸餾水洗滌以除去過量的鈣離子和未包埋的細胞，4 ℃保存?zhèn)溆肹19]。

SA-PVA載體固定化：菌懸液與等體積含70 g/L PVA和10 g/L SA的溶液混合，并使用滅菌注射器（5 mL）將混合溶液滴入20 g/L CaCl2溶液中以形成小球。小球在4 ℃貯存24 h后，用無菌蒸餾水洗滌以除去過量的鈣離子和未包埋的細胞，4 ℃保存?zhèn)溆肹20]。

SA-C載體固定化：菌懸液與等體積含10 g/L活性炭和30 g/L SA的溶液混合，并使用滅菌注射器（5 mL）將混合溶液滴入20 g/L CaCl2溶液中以形成小球。小球在4 ℃貯存24 h后，用無菌蒸餾水洗滌以除去過量的鈣離子和未包埋的細胞，4 ℃保存?zhèn)溆肹21]。

1.3.4 不同載體固定化細胞的機械強度和傳質性能測定

機械強度測定采用質構儀。參數(shù)設置：探頭：P6；測試模式：TPA壓縮模式；觸發(fā)值：0.005 N；壓縮比：75%；測前速率、測試速率、測后速率均設為1.0 mm/s；下壓距離為10 mm，選取制備好的凝膠小球5～10 個進行測試，實驗結果取平均值。

傳質系數(shù)測定：參照任靜[22]的方法并稍作改動，無菌條件下，在錐形瓶內裝有100 mL 1 mg/mL的葡萄糖溶液，并隨機取30 粒固定化小球浸泡，37 ℃浸泡24 h，并于540 nm波長處采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定浸泡前后錐形瓶中葡萄糖溶液OD值的變化，按式（1）計算固定化細胞的傳質系數(shù)：

1.3.5 乳酸鈣含量的測定

采用EDTA定鈣法，離心取上清液1 mL，加蒸餾水50 mL，加1 mol/L NaOH溶液4 mL，鈣黃綠素指示劑20 mg，用0.05 mol/L EDTA-Na2溶液至背光觀察黃綠色熒光變?yōu)槌壬珵橹梗⒂涗汦DTA-Na2的體積。根據(jù)乳酸鈣折換為乳酸的系數(shù)為1.711，通過乳酸含量測定乳酸鈣[23]。

1.3.6 殘?zhí)呛康臏y定

采用DNS法測定發(fā)酵液中殘留的葡萄糖含量。葡萄糖標準曲線：用7 支25 mL比色管，分別加1 mg/mL的葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，蒸餾水補至2 mL，加入1.5 mL DNS試劑搖勻，沸水浴5 min，將冷卻至室溫。蒸餾水定容到25 mL，540 nm波長處測OD值。

1.3.7 發(fā)酵液中乳酸鈣的提取與蛋殼粉轉化率計算

菌種發(fā)酵完全后，將獲得的發(fā)酵液進行過濾，以除去菌體和多余的蛋殼粉，將濾液加入氫氧化鈣調節(jié)pH值至10左右，并加入1%的活性碳，于94 ℃除雜并脫色20 min。趁熱用布氏漏斗加雙層化學分析濾紙抽濾，收集濾液。將濾液放置于85 ℃濃縮至合適體積，冷卻靜置結晶24 h，分離晶體與母液，由于母液中還殘留大量的乳酸鈣，濃縮后再次結晶，晶體放置于70 ℃烘箱干燥至合適程度。蛋殼粉轉化率按式（2）計算[24]：

1.3.8 不同包埋載體固定化小球的微觀結構觀察

將不同材料的固定化細胞置于2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定6 h，然后用無菌蒸餾水洗滌固定化細胞3 次，每次10 min，以去除戊二醛。洗滌后樣品依次浸泡于30%、50%、70%和90%乙醇溶液中進行梯度脫水，每個梯度洗滌一次，每次10 min，最后用無水乙醇洗滌2 次，每次15 min，以移除最后的水分。將充分脫水后的樣品于冷凍干燥儀中進行干燥，干燥后樣品粘在具有雙面膠帶的樣品臺上固定、噴金，最后使用掃描電鏡進行觀察。

1.3.9 最適包埋載體分析

1.3.9.1 葡萄糖加入量對固定化細胞產乳酸鈣的影響

發(fā)酵液采用種子培養(yǎng)基改良，蛋殼粉80 g/L，設置6 組實驗葡萄糖加入量分別為80、100、120、140、160、180 g/L，并接種后于37 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，研究葡萄糖加入量對乳酸鈣產量的影響。

1.3.9.2 蛋殼粉加入量對固定化細胞機械強度的影響

發(fā)酵液采用種子培養(yǎng)基改良，葡萄糖120 g/L，設置5 組實驗蛋殼粉加入量分別為0、40、60、80、100 g/L，研究蛋殼粉加入量對固定化細胞機械強度的影響，發(fā)酵條件同1.3.9.1節(jié)。

1.3.9.3 溫度、pH值對乳酸鈣產量的影響

設置溫度為18、23、28、33、38、43 ℃，pH值為4.3、5.7、6.8、7.6、8.7，探究溫度與pH值對乳酸鈣產量的影響。

1.3.9.4 固定化細胞的貯存穩(wěn)定性

將制備好的固定化小球保存于4 ℃的無菌生理鹽水中，每隔9 d測定其發(fā)酵蛋殼粉生產乳酸鈣產量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析，Duncan多重比較，各表中數(shù)值以f s表示，并使用Origin 2015軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 蒙氏腸球菌的生長曲線

圖 1 蒙氏腸球菌的生長曲線和相應的pH值變化Fig. 1 Growth curve of E. mundtii and corresponding pH evolution curve

由圖1可以看出，在2 h后，菌種開始進入對數(shù)生長期，相應的pH值也在急速下降，并在10 h左右達到穩(wěn)定期，其OD600nm值與pH值趨于穩(wěn)定。由于處于對數(shù)生長期的微生物代謝旺盛，生長速率最大，在實際生產中通常選擇對數(shù)期的微生物作為種子，使微生物發(fā)酵的延遲期縮短，而用于固定化的微生物要求生長旺盛，因此，實驗選擇培養(yǎng)10～12 h的菌種進行固定化，以提高微生物的利用效率。

2.2 不同載體固定化細胞的機械強度和傳質系數(shù)

表 1 不同載體固定化細胞的機械強度與傳質系數(shù)的比較Table 1 Comparison of mechanical strength and mass transfer coefficient of cells immobilized on different carriers

由表1可知，3 種載體中SA載體固定化細胞的機械強度值最大，而SA-PVA載體固定化細胞的傳質系數(shù)值最大。在實際生產中，固定化細胞機械強度較低時，其固定化顆粒內部交聯(lián)結構的致密程度低，利于增加其內部傳質，但易使被固定的細胞泄漏、凝膠球破碎，且固定之后經過洗滌會造成菌體損失，從而不利于其發(fā)酵并失去連續(xù)發(fā)酵的意義。而當機械強度較高時，凝膠過于緊密，會降低其傳質性，不利于底物和產物的擴散，從而導致其發(fā)酵性能降低。因，固定化細胞的機械強度并不是越大（或小）對發(fā)酵就越有利[25-26]。在比較3 種載體固定細胞的機械強度及傳質系數(shù)后，選擇載體為SA-C為宜。

2.3 游離細胞與不同載體固定化細胞生產乳酸鈣產量的比較

圖 2 游離細胞與不同載體固定化細胞生產乳酸鈣能力比較Fig. 2 Comparison of calcium lactate production by free cells and cells immobilized on different carriers

圖2 顯示，游離細胞與S A、S A-C 及S A-P VA 3 種載體固定化細胞隨著發(fā)酵時間的延長，其乳酸鈣產量顯著增加（P＜0.05），并在72 h達到最大值，分別為（102.01f 2.56）、（96.33f 1.86）、（101.02f 1.83）、（76.09f 1.97）g/L，且SA-C載體的固定化細胞其乳酸鈣產量比其他2 種載體的乳酸鈣產量高，而與游離細胞相當。可能是因為活性炭具有大的表面積和低的傳質阻力利于細胞生長[27]，而在SA-PVA載體固定化細胞中觀察到低水平的乳酸鈣產生，可能是因為PVA是一種高黏性物質，在交聯(lián)過程中易于發(fā)生黏連現(xiàn)象，且PVA凝膠存在很大的水溶脹性，其機械強度低，在固定化過程中易發(fā)生細胞泄漏[28]，引起部分菌體損失，從而降低菌種發(fā)酵性能。

2.4 游離細胞與不同包埋載體固定化細胞的操作穩(wěn)定性

圖 3 不同載體的固定化細胞和游離細胞的重復分批發(fā)酵Fig. 3 Repeated usability of immobilized and free cells

為更好地確定包埋載體，對3 種載體固定化細胞及游離細胞進行重復發(fā)酵實驗，結果如圖3所示。僅在重復發(fā)酵9 次時，游離細胞中乳酸鈣產量與初始值相比降低近半，而SA-PVA載體固定化細胞機械穩(wěn)定性比較差，在發(fā)酵過程中有部分溶解，在重復使用12 次時已大部分溶解，不利于實際生產的使用。SA載體在重復使用18 次后，其乳酸鈣產量仍保留在80%以上，而SA-C載體在重復使用10 次之后，其發(fā)酵周期縮短為48 h即可達到 第1次產乳酸鈣的含量，并且由于發(fā)酵液中蛋殼粉的存在，可提供鈣離子，避免了固定化小球出現(xiàn)機械強度差的問題，始終維持著良好的機械穩(wěn)定性[29]。而SA-C載體顯示出比其他2 種載體更好的固定化效果，可能是因為它是通過包埋和吸附相結合使用復合固定化方法制備，克服了單一固定化技術的缺點[30]，固定化細胞的有效再利用可能是由于其酶活性高于游離細胞[31]，具有更高的細胞操作穩(wěn)定性。

2.5 不同載體固定化細胞的微觀結構

圖 4 固定化細胞的掃描電鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of immobilized cells

圖4A顯示，SA載體表面光滑，不利于其菌體細胞的附著；由圖4B可以看到，SA-C載體的表面粗糙，為固定在其上的菌體細胞提供良好的附著微環(huán)境；由圖4C可知，SA-PVA載體表面有許多空隙，具有較大的比表面積利于菌體細胞的附著。而觀察圖4D～F可知，SA、SA-C兩種包埋載體內部均成功的附著有大量菌體細胞，且菌體細胞顆粒飽滿，而SA-PVA包埋載體內部圖發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了許多小孔，且沒有發(fā)現(xiàn)菌體的附著，可能是由于PVA凝膠具有很大的水溶脹性，在處理品過程中導致其機械穩(wěn)定性差使得部分菌體細胞脫落，從而未觀察到；在重復發(fā)酵18 次后，由圖4G、H可知，SA-C與SA載體固定化細胞內部相比聚集了更多的菌體細胞，且內部構造強度仍然很好，維持著高密度細胞發(fā)酵，有利于乳酸鈣產量的提高，這可能是其在重復發(fā)酵10 次后有縮短發(fā)酵周期趨勢的主要原因。因，最終選擇SA-C載體作為固定化蒙氏腸球菌的最適包埋載體。

2.6 葡萄糖加入量對乳酸鈣產量的影響

在確定SA-C作為最適包埋載體后，對發(fā)酵液中葡萄糖加入量對乳酸鈣產量的影響進行探究，如圖5所示，隨發(fā)酵液中葡萄糖加入量增加，乳酸鈣產量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在葡萄糖加入量為120 g/L時乳酸鈣產量最高，達（100.07f 2.58）g/L，且蛋殼粉轉化率為82.43%。隨著葡萄糖加入量的繼續(xù)增加反而使乳酸鈣產量降低，主要是由于發(fā)酵液中葡萄糖加入量過高時，對菌體的生長和產乳酸鈣速率的抑制也會增強[32]。因，綜合考慮選擇發(fā)酵液中的葡萄糖加入量為120 g/L。

圖 5 葡萄糖加入量對乳酸鈣產量的影響Fig. 5 Effect of glucose concentration on calcium lactate production

2.7 蛋殼粉加入量對固定化細胞機械強度的影響

機械強度的穩(wěn)定性對于固定化細胞在長期應用中具有重要意義，機械強度太高，會阻礙營養(yǎng)物質的傳遞，相反會導致細胞滲漏、凝膠破裂[33]。由表2可知，發(fā)酵液中加入不同量蛋殼粉對固定化細胞機械強度的影響具有顯著差異（P＜0.05）。在發(fā)酵72 h后，沒有加入蛋殼粉的固定化細胞機械強度明顯降低，不利于實際應用，易造成凝膠破裂、細胞滲漏。而發(fā)酵液中加入蛋殼粉的固定化細胞，由于蛋殼粉的存在，其主要成分是碳酸鈣，可為凝膠體系補充鈣離子從而防止凝膠體系中的鈣離子因被發(fā)酵液中磷酸鹽等離子置換出來，而導致凝膠體系破裂的現(xiàn)象。結果說明蛋殼粉的存在有效維持了固定化細胞在長期發(fā)酵過程中的機械穩(wěn)定性[29]。

表 2 蛋殼粉加入量對固定化細胞機械強度的影響Table 2 Effect of eggshell powder content on mechanical strength of immobilized cells

2.8 溫度和pH值對乳酸鈣產量的影響

圖 6 溫度（A）和pH值（B）對乳酸鈣產量的影響Fig. 6 Effect of temperature (A) and pH (B) on calcium lactate production

如圖6A所示，游離細胞與固定化細胞的最適溫度相同，乳酸鈣產量均在38 ℃時達到最大值，當溫度過高或者過低時，均不利于乳酸鈣的生成，而固定化細胞對不同溫度的適應能力明顯高于游離細胞。如圖6B所示，在最適反應溫度條件下，游離細胞與固定化細胞最適宜的pH值都為5.7，說明固定化以后沒有改變蒙氏腸球菌生長適宜的pH值，而在pH值過低或過高時，固定化細胞生產乳酸鈣的能力高于游離細胞，說明將細胞固定化之后提高了其pH值穩(wěn)定性。

2.9 固定化細胞的貯存穩(wěn)定性

將固定化細胞與游離細胞分別置于無菌生理鹽水中，于冰箱中4 ℃保存。如圖7所示，隨著貯存時間的延長，固定化細胞的貯存穩(wěn)定性明顯高于游離細胞，且在4 ℃冷藏54 d后，乳酸鈣產量與新制備的固定化細胞相比僅下降13.45 g/L，由說明固定化細胞具有良好的貯存穩(wěn)定性。

圖 7 游離細胞與固定化細胞的貯存穩(wěn)定性Fig. 7 Storage stabilities of free and immobilized cells

3 結 論

本研究采用固定化細胞技術利用蛋殼廢物生產乳酸鈣，對固定化包埋載體進行探討，并確定SA-C作為最適包埋載體，其產乳酸鈣能力與游離細胞相當，在重復發(fā)酵18 次后仍維持高產率的乳酸鈣。而發(fā)酵液中蛋殼廢物的存在既維持了固定化細胞的機械穩(wěn)定性，又與乳酸充分結合生成乳酸鈣，有效提高了蛋殼廢物的利用。與游離細胞相比，固定化細胞的操作穩(wěn)定性、溫度、pH值及貯存穩(wěn)定性在一定范圍內都有明顯的提高，為利用固定化細胞技術生產蛋殼乳酸鈣提供一定的理論支持，且所制得的凝膠球可滿足連續(xù)化發(fā)酵生產工藝的要求。