布氏乳桿菌產γ-氨基丁酸發酵條件的優化

司闊林，徐捐捐，岳田利，袁亞宏，郭春鋒

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質氨基酸，廣泛存在于自然界中[1]。GABA作為哺乳動物大腦中的主要抑制性神經遞質[2]，具有降血壓[3]、抗癲癇[4]、抗抑郁[5]、鎮靜[6]、預防糖尿病[7]、預防肥胖[8]和促進睡眠[9]等功能。由于其潛在的生物活性，富含GABA的功能性新食品的開發受到越來越多研究者的關注。生產GABA的方法主要包括化學合成法和生物合成法[10]，由于化學合成法存在生產成本高、反應不容易控制、副產物成分復雜且有害等缺點，因化學合成的GABA很難用于食品工業[11]，而生物合成法則具有反應條件溫和、環境污染小、安全性高等優點[12]，具有較大的生產食品級GABA的潛力。

多種微生物都可以合成GABA，包括細菌[13]、真菌[14]和酵母[15]，而乳酸菌作為安全的食品微生物，已廣泛用于發酵食品的生產中，其GABA產生能力研究也最為廣泛[16]。外，部分乳酸菌菌株還具有免疫調節、抑制病原菌以及控制腸道菌群平衡等生物活性[17]。從日本傳統發酵食品、韓國黑莓汁、朝鮮發酵泡菜、西班牙奶酪和意大利奶酪中分別分離出的副干酪乳桿菌NFRI 7415[18]、短乳桿菌GABA 100[19]、布氏乳桿菌MS[20]、乳酸乳球菌CECT 8184[21]和植物乳桿菌C48[22]均已被報道可產GABA。王興潔等[16]從四川泡菜中篩選出1 株產GABA的植物乳桿菌W1-9，以黃瓜汁為發酵培養基，其GABA產量可達到7.62 g/L；黃德娜等[23]從獨山鹽酸菜液中篩選出1 株產GABA的棉籽糖乳球菌Y-12，其GABA產量為4.06 g/L；Komatsuzaki等[18]從日本發酵水產品分離獲得了1 株產GABA的副干酪乳桿菌NFRI 7415，其在底物濃度為500 mmol/L時，GABA產量為302 mmol/L；Li Haixing等[24]從中國泡菜中分離獲得了1 株高產GABA的短乳桿菌NCL912，其在補料分批發酵之后，GABA產量高達102.78 g/L左右；Shan等[25]從內蒙古發酵乳中分離獲得了1 株產GABA的副干酪乳桿菌NDC75017，其GABA產量最高可達314.56 mg/100 g。

泡菜和酸菜作為中國傳統的發酵蔬菜，其中含有多種乳酸菌，而關于中國傳統發酵蔬菜來源的布氏乳桿菌產GABA的特性還鮮見報道。本研究旨在對前期從泡菜和酸菜中分離獲得的2 株布氏乳桿菌產GABA的發酵條件進行優化，提高其GABA產量，為進一步開發高產GABA的功能性微生態制劑或富含GABA的發酵食品奠定理論基礎和提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

布氏乳桿菌S37和布氏乳桿菌J68篩選自中國傳統發酵蔬菜，經生工生物工程（上海）股份有限公司進行分子生物學鑒定，保藏于西北農林科技大學食品科學與工程學院健康食品制造與安全控制實驗室。

M R S 肉湯培養基 北京陸橋技術有限公司；GABA標準品（99%）、L-谷氨酸鈉（L-monosodium glutamate，L-MSG）、丹磺酰氯 美國Sigma-Aldrich 公司；甲醇、丙酮、葉酸、L-半胱氨酸、氯化錳（均為色級） 中國上海Aladdin公司；其他試劑均為分析純，購自四川西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

1.3.2 布氏乳桿菌產GABA發酵條件的優化

1.3.2.1 發酵時間對GABA產量和細胞生長的影響

發酵溫度35 ℃，MRS肉湯培養基中L-MSG濃度400 mmol/L，初始pH 5.0，考察發酵時間（24、48 h和72 h）對GABA產量的影響。發酵結束后，通過HPLC測定發酵液中的GABA含量，同時測定發酵液在600 nm波長處的光密度（OD600nm），記錄細菌細胞的生長情況。

1.3.2.2 發酵溫度對GABA產量和細胞生長的影響

發酵時間72 h，MRS肉湯培養基中L-MSG濃度400 mmol/L，初始pH 5.0，考察發酵溫度（25、30、35 ℃和40 ℃）對GABA產量的影響。發酵結束后，通過HPLC測定發酵液中的GABA含量，同時測定發酵液OD600nm，記錄細菌細胞的生長情況。

1.3.2.3 L-MSG濃度對GABA產量、L-MSG轉化率和細胞生長的影響

發酵時間72 h，發酵溫度35 ℃，初始pH 5.0，考察底物濃度（50、100、200、400 mmol/L和600 mmol/L）對GABA產量的影響。發酵結束后，通過HPLC測定發酵液中的GABA含量，同時測定發酵液OD600nm，記錄細菌細胞的生長情況。L-MSG轉化率的計公式如下：

式中：A為發酵液中GABA最終濃度；B為發酵液中L-MSG初始添加濃度。

1.3.2.4 初始pH值對GABA產量和細胞生長的影響

發酵時間72 h，發酵溫度35 ℃，MRS肉湯培養基中L-MSG濃度400 mmol/L，考察初始pH值（4.5、5.0、5.5和6.0）對GABA產量的影響。發酵結束后，通過HPLC測定發酵液中的GABA含量，同時測定發酵液OD600nm，記錄細菌細胞的生長情況。

1.3.3 影響GABA產量的響應面試驗優化

在布氏乳桿菌產GABA最優發酵條件的基礎上，根據不同的營養成分對2 株布氏乳桿菌產GABA影響的單因試驗結果，篩選出影響合成GABA的主要因，即葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳添加量，并確定了其合適的水平范圍。以GABA產量為評價指標，以葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳添加量為考察因，進行3因3水平 Box-Behnken響應面試驗，因與水平見表1。

表 1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables use for Box-Behnken design

1.3.4 GABA含量測定

參照Liu Sijin等[26]HPLC法測定發酵液中GABA含量。首先對發酵液進行前處理，發酵液于8 000h g離心10 min，取上清液，進行適當稀釋，取50 μL品，與0.5 mL 20 g/L碳酸氫鈉溶液和0.5 mL 5 g/L丹磺酰氯丙酮溶液混合，渦旋混勻30 s，60 ℃避光溫育30 min，然后向反應混合物中加入100 μL氨水以除去過量的衍生試劑，最后添加甲醇將體積調至2 mL，過0.22 μm有機濾膜，取20 μL品進行HPLC分析。空白對照為不接菌的含有50 mmol/L L-MSG的MRS肉湯培養基。

1.4 數據處理

實驗重復3 次，數據表示為f s。利用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，采用一維方差分析統計組間的顯著性差異，組間多重比較采用Tukey法，P＜0.05，差異顯著。使用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面試驗設計并進行相關數據分析。

2 結果與分析

2.1 HPLC分析

圖 1 GABA標準品（A）和發酵液樣品（B）的HPLC分析圖譜Fig. 1 HPLC chromatograms of GABA standard (A) and fermentation broth sample (B)

2.2 發酵條件的優化

2.2.1 發酵時間對GABA產量和細胞生長的影響

圖 2 發酵時間對GABA產量（A）和細胞生長（B）的影響Fig. 2 Effect of fermentation time on GABA yield (A) and cell growth (B)

由圖2A可知，在24～72 h內，隨著發酵時間的延長，2 株布氏乳桿菌的GABA產量均逐漸增加。發酵時間在前48 h內，GABA產量增加迅速，在48～72 h之間產量增加緩慢，但增長仍顯著（P＜0.05）。由圖2B可知，布氏乳桿菌J68在發酵48 h后依然顯著增長，而布氏乳桿菌S37在發酵第48小時已經進入了穩定生長期，但依然可以將培養基中剩余的L-MSG緩慢轉化為GABA。由可知，布氏乳桿菌產GABA可能并不是嚴格依賴于細菌細胞的生長，并且選擇72 h作為后續產GABA的發酵時間。

2.2.2 發酵溫度對GABA產量和細胞生長的影響

溫度對布氏乳桿菌GABA產量和細胞生物量有較大影響。由圖3可知，2 株布氏乳桿菌的GABA產量和菌體量的變化趨勢基本一致，即在25～35 ℃之間，隨著溫度的升高而增加，并且在35 ℃達到最高值，隨后隨著溫度的升高而降低。對于S37，在不同的發酵溫度（30、35、40 ℃）下，GABA產量未發現顯著差異，且菌體量有著較小的差異，并且發酵溫度為35 ℃時，GABA產量達到最高。對于J68，盡管菌體量在30 ℃和35 ℃之間沒有顯著差別，且超過35 ℃時菌體量開始緩慢下降，而其GABA產量在35 ℃略高于40 ℃，明顯高于30 ℃。這些結果表明，GABA產量在一定情況下取決于菌株的生物量，后續選擇35 ℃作為最適發酵溫度。這與之前的研究結果基本一致，李海星[27]優化從中國泡菜分離的短乳桿菌NCL912發酵條件之后的最適溫度為32 ℃，Lu Xiaoxue等[28]優化從中國傳統卷心菜泡菜分離的乳酸乳球菌發酵條件發現最適溫度是34 ℃，而且Dhakal等[29]也報道稱乳酸菌生長細胞產GABA的最適發酵溫度在30～40 ℃之間。

圖 3 發酵溫度對GABA產量（A）和細胞生長（B）的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on GABA yield (A) and cell growth (B)

2.2.3 L-MSG濃度對GABA產量、L-MSG轉化率和細胞生長的影響

在一些乳酸菌中，L-谷氨酸或其鈉鹽可在谷氨酸脫羧酶（EC 4.1.1.15）作用下發生不可逆的脫羧反應從而合成GABA[30]。由圖4A可知，L-MSG濃度在50～400 mmol/L時，2 株布氏乳桿菌的GABA產量逐漸增加，底物濃度為400 mmol/L時，GABA產量達到最高，分別為233.9 mmol/L 和159.3 mmol/L，對應的L-MSG轉化率分別為58.5%和39.8%，當L-MSG濃度在400～600 mmol/L時，GABA產量及L-MSG轉化率均顯著降低。由圖4B可知，隨著L-MSG濃度的增加，對應的L-MSG轉化率會持續降低。由圖4C可知，當L-MSG濃度超過100 mmol/L時，菌體量開始減少。因GABA產量的降低可能是由于高濃度的L-MSG抑制了細菌生長和谷氨酸脫羧酶活性[18]。上述結果表明，將底物高效轉化為GABA不僅需要高菌體量，還需要適當的初始L-MSG濃度，所以綜合考慮，布氏乳桿菌產GABA的最佳L-MSG濃度為400 mmol/L。

圖 4 L-MSG濃度對GABA產量（A）、L-MSG轉化率（B）和 細胞生長（C）的影響Fig. 4 Effect of L-MSG concentration on GABA yield (A), L-MSG conversion rate (B) and cell growth (C)

2.2.4 初始pH值對GABA產量和細胞生長的影響

微生物生物合成 GABA受到嚴格的pH值調控，而且在發酵過程中具有顯著作用[28-29]，保持乳酸菌谷氨酸脫羧酶活性的最佳pH值在4.5～6.0之間[31-32]。由圖5可知，初始pH值對GABA產量和細胞生長具有顯著影響。當pH值低于或高于5.0時，GABA產量和細胞生物量均迅速下降，即布氏乳桿菌產GABA的最佳初始pH值為5.0，這與先前關于乳酸菌生長細胞生產GABA的最佳初始pH值的報道一致[18,20,24]。然而由于在通過特異性轉運蛋白攝取底物后，細胞質脫羧會導致細胞內質子的消耗以及細胞外谷氨酸交換到GABA[29]等更為堿性的底物，發酵液的pH值會隨著發酵先下降后略有增加[33]。因，通過控制發酵過程中pH值，GABA生產效率將會更大提高。

圖 5 初始pH值對GABA產量（A）和細胞生長（B）的影響Fig. 5 Effect of initial pH on GABA yield (A) and cell growth (B)

2.3 重要營養成分優化

表 2 葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳添加量對菌株GABA產量的影響Table 2 Effects of addition of folic acid, L-cysteine and manganese chloride on GABA yield

在確定最優的發酵條件之后，通過篩選確定了葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳為促進菌株GABA產生的關鍵化學添加物。將其按照不同水平添加到發酵培養基中，然后在確定的最優發酵條件下進行發酵實驗。如表2所示，葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳在適當質量濃度范圍下均能顯著提高菌株GABA產量。當葉酸添加量低于10 mg/L 時，GABA產量隨添加量增加而升高，當添加量超過10 mg/L時，GABA產量開始下降；當L-半胱氨酸添加量低于1.4 g/L時，菌株的GABA產量隨添加量增加而升高，當添加量超過1.4 g/L時，GABA產量保持穩定不變；當氯化錳添加量低于0.6 g/L時，菌株GABA產量隨添加量增加而升高，當添加量超過0.6 g/L時，GABA產量開始下降。

2.3.2 響應面優化

2.3.2.1 Box-Behnken設計方案及結果

表 3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken design with experiment results

2.3.2.2 模型的建立與方差分析

利用Design-Expert V8.0.6軟件對表3中數據分別進行回歸擬合分析，結果如表4、5所示。兩個模型的P值均小于0.000 1，失擬項P值均大于0.05，表明回歸模型極顯著。預測值與試驗值之間有很好的相關性，R2值分別為0.990 5和0.992 8。由F值可知，各因對菌株S37產GABA的影響大小為：氯化錳添加量（C）＞葉酸添加 量（A）＞L-半胱氨酸添加量（B）；而對菌株J68產GABA的影響大小為：氯化錳添加量（C）＞L-半胱氨酸添加量（B）＞葉酸添加量（A）。經回歸擬合，分別得到2 株菌Y1和Y2的次多元回歸方程：

表 4 菌株S37 Box-Behnken試驗方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model for GABA yield of strain S37

表 5 菌株J68 Box-Behnken試驗方差分析Table 5 Analysis of variance of quadratic polynomial model for GABA yield of strain J68

利用Design-Expert V8.0.6軟件對回歸模型進行極值求取分析，發現對于菌株S37，葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳的最優添加量分別為8.37 mg/L、0.94 g/L和 0.60 g/L，對于菌株J68，葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳最優添加量分別為10.16 mg/L、0.97 g/L和0.60 g/L。模型預測的最高產量分別為323.3 mmol/L和261.4 mmol/L。在最佳水平下進行驗證實驗，發現菌株S37和J68的實際GABA產量分別為312.6 mmol/L和251.2 mmol/L，對應的L-MSG轉化率分別為78.2%和62.8%，與預測值基本一致，表明響應面試驗建立的模型具有較高的準確度。與未添加上述物質的對照培養基相比，2 株菌的GABA產量分別提高了34%和58%。盡管在發酵過程中未使用發酵罐控制發酵系統的pH值，也未采用分批補料發酵模式，但2 株菌的GABA產量也高于大多數文獻報道的乳酸菌的GABA產量。由于優化后布氏乳桿菌S37的GABA產量顯著高于氏乳桿菌J68，因布氏乳桿菌S37更具有潛在的工業應用價值。

3 結 論

本研究以中國傳統發酵蔬菜來源的2 株布氏乳桿菌為研究對象，研究不同發酵條件對布氏乳桿菌GABA產量和菌株生長的影響，結果表明2 株菌S37和J68具有相似的變化趨勢，且其產GABA的最優發酵條件一致：發酵時間72 h、發酵溫度35 ℃、底物L-MSG濃度 400 mmol/L、初始pH 5.0。培養基中添加葉酸、L-半胱氨酸和氯化錳能顯著提高2 株菌的GABA產量，通過響應面試驗優化其添加量后，其GABA產量分別為 312.6 mmol/L和251.2 mmol/L，對應的L-MSG轉化率分別為78.2%和62.8%。布氏乳桿菌S37具有更高的GABA產量，具有進一步開發利用的潛力。