體外結腸發(fā)酵對青稞膳食纖維中酚類化合物的含量及抗氧化活性的影響

鄒青飛，楊士花，李永強,，黃勇樺，黃佳琦，李 晴，李梓毓，黃艾祥

（1.云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業(yè)大學外語學院，云南 昆明 650201）

青稞（Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook. f.）是大麥的一個變種，屬禾本科大麥屬。因其籽粒內外稃與穎果分離，籽粒裸露，故稱裸大麥[1]。青稞生長在海拔1 400～4 700 m的高寒地區(qū)，主要分布在我國的西藏、青海、四川、云南、甘肅、黑龍江等地，是一種特有的耐寒耐旱農作物，其生長條件造就了青稞“三高兩低”的營養(yǎng)組成，即高蛋白、高纖維、高維生、低脂肪和低糖，而且在抗逆環(huán)境下積累了豐富的多酚化合物[2]。膳食纖維包括能夠耐受人體消化酶水解的細胞壁多糖、木質以及與之相結合的物質，與膳食纖維相結合的物質也被認為是膳食纖維的一部分[3]，這些物質包括多酚、皂苷類、植酸等化合物。膳食纖維按其溶解性可分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不可溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）[4]。目前青稞主要用于畜牧飼料、青稞酒、炒面、糌粑、烘焙食品等的加工[5]， 而關于青稞的功能研究較少，主要集中在多酚、β-葡聚糖和膳食纖維等方面[6]。

多酚是一種植物次生代謝產物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌等作用，能夠預防心血管疾病、癌癥、高血壓、II型糖尿病等[7]。多酚按溶解度分為總可溶性多酚和不可溶鍵合多酚，不可溶鍵合多酚能與膳食纖維、蛋白質等大分子通過各種化學鍵形成膳食纖維-多酚復合物（dietary fiber-polyphenol complex，DF-PC）[8-9]。 研究發(fā)現(xiàn)，膳食纖維中含有游離多酚和不可溶鍵合多酚，谷物中約95%的不可溶鍵合多酚會與細胞壁多糖連接，形成DF-PC[10]。純多酚在體內的保留時間較短，從攝入到代謝完成大約需要4 h，且在2 h左右出現(xiàn)波；DF-PC在消化過程中可以緩慢釋放多酚化合物，持續(xù)保持人體具有較高的多酚水平，較長時間發(fā)揮其抗氧化活性，能夠促進人體健康。多酚經人體攝入后在腸道消化過程中會發(fā)生降解或轉化，攝入的多酚不能完全被人體吸收利用[11]。多酚在膳食中含量很高，但它們在體內生物有效性較低，只有5%～10%的多酚（主要是游離態(tài)多酚）在小腸中被吸收，90%～95%的多酚（主要是結合態(tài)多酚）會進入結腸[12]，在結腸微生物菌群的作用下進一步降解為活性較高的小分子代謝產物，一部分被人體重新吸收和利用，另一部分則排出體外[13-14]。

體外結腸發(fā)酵是基于體內結腸發(fā)酵的仿生模擬而建立的模型，兩者之間有一定的相關性，既能從一定程度上反映攝入物質的消化利用情況，又具有簡便易行的特點[15]。該方法一般需要先進行體外腸道消化，然后利用消化殘渣進行結腸發(fā)酵[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，在體外模擬腸道消化過程中，多酚化合物在各種消化酶的作用下會逐漸釋放，不但提高了多酚化合物含量，而且能夠提高其抗氧化活性[18-20]。結腸發(fā)酵一般利用人或其他動物糞便作為接種物[16]，在發(fā)酵過程中，接種物中的微生物會進一步促進不可溶鍵合多酚的釋放，不但能提高游離多酚的含量和抗氧化活性，也會提高其生物有效性。研究表明，棗籽經過體外腸消化和結腸發(fā)酵后，其抗氧化活性和生物有效性得到提高[16]。Campos-Vega等[17]發(fā)現(xiàn)多酚在模擬腸消化和結腸發(fā)酵過程中，其含量和抗氧化活性提高，生物有效性增強。目前，利用體外結腸發(fā)酵研究青稞膳食纖維中酚類化合物的含量及抗氧化活性的文獻鮮見報道。因，本實驗以青稞膳食纖維為原料，通過體外模擬腸消化和結腸發(fā)酵，對青稞膳食纖維中多酚含量、黃酮含量、體外抗氧化活性進行研究，以期為科學評價青稞的功能活性及保健食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云黑青稞購自云南香格里拉兵松村；豬糞便采自云南省普洱市景谷朱源家庭養(yǎng)殖農場，采糞便所用豬沒有腸道疾病且6 個月內沒有使用過抗生。

1.2 儀器與設備

MF-304型不銹鋼五谷雜糧磨粉機 廣州雷邁機械設備有限公司；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限公司；RE-5205型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；A360型紫外-可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機 鄭州南北儀器設備有限公司；TS-211B型恒溫搖床培養(yǎng)箱 上海天呈實驗儀器制造有限公司；YXQ-LS型立式蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.2 青稞中IDF與SDF的提取

參照李永強[8]、張會香[21]、Guo Weiwei[10]等的方法并進行適當修改。提取膳食纖維時，按料液比為 1∶15（g/mL）加入MES-TRIS緩沖溶液并攪拌均勻，之后分別加入耐高溫α-淀粉酶、堿性蛋白酶、糖化酶進行酶解，反應結束后，將酶解液于4 000 r/min離心15 min，離心后沉淀為IDF；上清液取出，按1∶4的比例加入一定量的95%乙醇溶液，于0～4 ℃冰箱中沉淀過夜；之后取下層渾濁液于4 000 r/min離心15 min，所得沉淀為SDF，將IDF、SDF冷凍干燥后于80 ℃冰箱避光儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 總可溶性與不可溶鍵合多酚的提取

參照Chandrasekara等[22]的方法并進行適當修改。IDF與SDF首先用70%丙酮溶液進行提取，離心得上清液和殘渣，上清液即為總可溶性多酚；殘渣先用4 mol/L NaOH溶液在充氮氣條件下水解4 h，然后用6 mol/L HCl溶液調pH值為2，離心后所得上清液用乙醚和乙酸乙酯按照 1∶1∶1（V/V）萃取3 次，得到不可溶鍵合多酚。

參照Spínola等[23]的方法并經適當修改。分別稱取1 g SDF和IDF置于錐形瓶中，加入15 mL蒸餾水和10 mL 0.85% NaCl溶液，水浴10 min，當品中心溫度達37 ℃時加入1 mL豬α-淀粉酶，37 ℃水浴消化5 min，調節(jié)pH值至2.0，再加1 mL豬蛋白酶，品沖氮氣于37 ℃、100 r/min避光條件下振蕩消化2 h，所得懸濁液進行腸實驗。

1.3.4.2 體外腸消化

參照Gayoso等[24]的方法并經適當修改。經消化后的懸濁液，調節(jié)pH值為6.5，然后依次加入4 mL膽汁鹽、4 mL豬胰液和1 mL豬黏液，品充氮氣于37 ℃、100 r/min避光條件下振蕩消化3 h，消化液于12 000 r/min離心30 min后得到上清液和殘渣，殘渣加入25 mL蒸餾水再次離心，所得殘渣凍干后充氮氣避光保存于80 ℃冰箱，用于結腸發(fā)酵。

1.3.4.3 體外結腸發(fā)酵

參照Sirisena[16]、Chandrasekara[25]等的方法并進行適當修改。在每個錐形瓶中加入135 mL厭氧培養(yǎng)基，然后于121 ℃條件下滅菌15 min，冷卻。之后加入凍干的腸消化殘渣，混勻后充氮氣，于4 ℃冰箱水合16 h。

接種物制備：實驗前將3 頭豬糞便按1∶1∶1混合均勻，用1 mol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液按1∶10（g/mL）進行稀釋，使用3 層紗布過濾，濾液備用。

1.3.5 多酚含量測定

采用福林-酚法[26]測定，以阿魏酸濃度/（μmol/L）為x，吸光度為y，繪制標準曲線：y＝1.289x0.003（R2=0.998 8），多酚含量測定結果以阿魏酸物質的量當量表示，單位為μmol/g。

1.3.6 黃酮含量測定

采用AlCl3比色法[25]測定。以兒茶濃度/（μmol/L）為x，吸光度為y，繪制標準曲線：y＝2.545 9x0.011 43（R2＝0.999 8），黃酮含量測定結果以兒茶物質的量當量表示，單位為μmol/g。

1.3.7 體外抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考羅恒國[27]、黃佳琦[28]等的方法并經適當修改。取適量的結腸發(fā)酵液與4 mL DPPH的甲醇溶液充分混合后，避光反應10 min，在517 nm波長處測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計DPPH自由基清除能力。DPPH自由基清除率計公式如下：

式中：s為結腸發(fā)酵液加DPPH-甲醇溶液吸光度；sb為結腸發(fā)酵液加甲醇溶液吸光度；c為DPPH-甲醇溶液吸光度；cb為甲醇溶液吸光度。

利用阿魏酸繪制標準曲線，標準方程為： y＝451.75x32.31（R2＝0.998 7），其中，y為DPPH自由基清除率/%；x為阿魏酸濃度/（μmol/L）。DPPH自由基清除能力以每克品中相當于阿魏酸的物質的量表示，單位為μmol/g。

1.3.7.2 鐵離子還原/抗氧化能力測定

參考羅恒國[27]、黃佳琦[28]等的方法并經適當修改。取3 mL的鐵離子溶液與適量的結腸發(fā)酵液充分混合，于37 ℃反應4 min，用乙醇做空白，在593 nm波長處測定吸光度。用FeSO4標準儲備液繪制標準曲線。標準曲線方程為： y＝6.24x0.000 5（R2＝0.998 4），其中，y為吸光度； x為硫酸亞鐵濃度/（mmol/L）；鐵離子還原能力以每克品中相當于Fe2的物質的量表示，單位為mmol/g。

1.3.7.3 H2O2清除能力測定

參考羅恒國[27]、黃佳琦[28]等的方法并經適當修改。取適量的結腸發(fā)酵液加入0.5 mL 40 mmol/L的H2O2和0.75 mL 45 mmol/L pH 7.4磷酸鈉緩沖溶液，在30 ℃暗反應40 min，用乙醇作為空白，于230 nm波長處測定吸光度。H2O2清除率計公式如下：

式中：s為結腸發(fā)酵液加H2O2溶液和磷酸鹽緩沖溶液吸光度；sb為結腸發(fā)酵液加磷酸鹽緩沖溶液吸光度；c為H2O2溶液加磷酸鹽緩沖溶液吸光度；cb為磷酸鹽緩沖溶液吸光度。

用阿魏酸繪制標準曲線，標準曲線方程為：y＝47.338x32.772（R2＝0.998 4），其中：y為H2O2清除率/%；x為阿魏酸濃度/（μmol/L）；H2O2清除能力以每克品中相當于阿魏酸的物質的量表示，單位為μmol/g。

1.3.7.4 總抗氧化能力測定

參考羅恒國[27]、黃佳琦[28]等的方法并經適當修改。提前配制ABTS工作液，取適量的結腸發(fā)酵液與1.9 mL ABTS工作液室溫反應6 min，用乙醇溶液作空白，于734 nm波長處測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計ABTS陽離子自由基清除能力。ABTS陽離子自由基清除率計公式如下：

式中：s為結腸發(fā)酵液加ABTS工作液吸光度；sb為結腸發(fā)酵液加乙醇溶液吸光度；c為ABTS工作液吸光度； cb為乙醇溶液吸光度。

利用Trolox繪制標準曲線，標準曲線方程為： y＝103.95x1.566 3（R2＝0.998 4），其中：y為ABTS陽離子自由基清除率/%；x為Trolox濃度/（mmol/L）；ABTS陽離子自由基清除能力以每克品中相當于Trolox的物質的量表示，單位為μmol/g。

1.3.7.5 還原能力測定

參考羅恒國[27]、黃佳琦[28]等的方法并經適當修改。吸取適量的結腸發(fā)酵液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后加入2.5 mL 10% TCA溶液，于4 000 r/min離心10 min；取上清液1 mL加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液和2.5 mL蒸餾水，用乙醇溶液作空白，于700 nm波長處測定吸光度。用抗壞血酸繪制標準曲線，標準曲線方程為：y＝0.080 1x0.157 9 （R2＝0.991 6），其中：y為吸光度；x為抗壞血酸 濃度/（μmol/L）；還原能力以每克品中相當于抗壞血酸的物質的量表示，單位為μmol/g。

1.3.8 體外結腸過程中酚類化合物的組成分析

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗至少重復3 次，數(shù)據(jù)以f s表示。運用SPSS 18.0軟件，通過單因方差分析和Tukey多重比較對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析（P＜0.05）；運用Execl 2007軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 IDF和SDF中總可溶性和不可溶鍵合多酚含量

表 1 IDF和SDF中總可溶性和不可溶鍵合多酚的含量Table 1 Contents of total soluble and insoluble-bound phenolics in IDF and SDF μmol/g

對IDF和SDF中總可溶性多酚、總可溶性黃酮、不可溶鍵合多酚和不可溶鍵合黃酮進行測定，結果見表1。 IDF和SDF中總多酚含量分別為（24.45f 2.28）、（7.5 3 f 2.3 8）μ m o l/g，總黃酮含量分別為（1.51f 0.05）、（0.39f 0.07）μmol/g。

2.2 體外結腸發(fā)酵液中酚類化合物的含量

表 2 IDF和SDF體外結腸發(fā)酵液中多酚和黃酮的含量變化Table 2 Changes in contents of phenolics and flavonoids in colonic fermentation broths of IDF and SDF in vitro

如表2所示，IDF在結腸發(fā)酵過程中多酚含量隨著發(fā)酵時間的延長呈逐漸升高的趨勢，當結腸發(fā)酵第30小時多酚含量最高，為（54.00f 1.02）μmol/g；SDF在結腸發(fā)酵過程中多酚含量隨著發(fā)酵時間的延長呈先升高后降低的趨勢，當結腸發(fā)酵第30小時多酚含量達到最高，為（50.62f 2.45）μmol/g。黃酮含量的變化趨勢與多酚相似，IDF在結腸發(fā)酵過程黃酮含量呈逐漸升高趨勢，結腸發(fā)酵第48小時，黃酮含量最高，為（1.51f 0.18）μmol/g； SDF在結腸發(fā)酵過程中黃酮含量呈先升高后降低趨勢，結腸發(fā)酵第30小時，黃酮含量最高，為（0.69f 0.09）μmol/g。 結合表1可知，IDF中含有豐富的不可溶鍵合多酚，可能與膳食纖維的結合強度較強有關，在結腸微生物的作用下，不可溶鍵合多酚被緩慢釋放出來，導致多酚含量呈增加趨勢，甚至高于化學法提取的多酚[29]；SDF中不可溶鍵合多酚相對較少，可能與膳食纖維的結合強度較弱、穩(wěn)定性較差有關，在結腸發(fā)酵第30小時，多酚被全部釋放，之后隨著發(fā)酵時間的延長，在結腸微生物的作用下，多酚可能被分解代謝，導致含量下降。

2.3 體外結腸發(fā)酵液中酚類化合物的體外抗氧化活性

如圖1所示，在體外結腸發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，IDF中酚類化合物的體外抗氧化活性呈逐漸升高的趨勢，在第48小時達到最高，說明在結腸微生物的作用下，IDF-PC中化學鍵逐漸被打斷，多酚得到釋放，同時可能被進一步分解代謝，形成活性更高的小分子代謝產物，導致抗氧化能力增強[29]。SDF中酚類化合物的體外抗氧化活性呈先升高后下降趨勢，在第30小時達到最高，說明結腸發(fā)酵第30小時，SDF-PC中酚類化合物在結腸微生物作用下全部得到釋放，然后隨發(fā)酵時間的延長，酚類化合物在結腸微生物的作用下，可能進一步被分解或轉化為小分子代謝產物，導致抗氧化活性降低。

圖 1 IDF和SDF在體外結腸發(fā)酵液中酚類化合物的體外抗氧化活性Fig. 1 Antioxidant activities of in vitro colonic fermentation broths of IDF and SDF

2.4 體外結腸發(fā)酵液中酚類化合物組成

圖 2 多酚標準品高效液相色譜圖Fig. 2 Chromatograms of mixed standards of phenolic compounds

表 3 IDF在體外結腸發(fā)酵液中酚類化合物的含量*Table 3 Contents of phenolic compounds in in vitro colon fermentation broth of IDF*μg/g

從表3、4可看出，青稞膳食纖維經體外結腸發(fā)酵后，發(fā)酵液中有18 種酚類化合物，分為羥基苯甲酸、羥基肉桂酸和類黃酮3 類。同時，在體外結腸發(fā)酵過程中，各種酚類化合物含量有的呈逐漸增加的趨勢，有的呈逐漸減少的趨勢，有的呈先升高后降低的趨勢，沒有明顯的變化規(guī)律。阿魏酸是谷物中含量最豐富的酚類 化合物[9]，可作為生物標志物，研究多酚在腸道和結腸發(fā)酵過程中的含量、抗氧化活性和生物有效性[16-17]。青稞中阿魏酸約占總酚含量的68%，是含量最高一種酚類化合物[30]。由表3可知，在結腸發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，阿魏酸的含量呈先升高后下降的趨勢，在第24小時含量最高，為（10.53f 1.91）μg/g。由表4可知，在結腸發(fā)酵48 h過程中，阿魏酸的含量呈先升高后降低趨勢，在第5小時含量最高，為（0.72f 0.07）μg/g。在IDF中，阿魏酸可能與膳食纖維通過化學鍵結合比較緊密，在發(fā)酵第24小時被完全釋放，含量達到最高；之后在結腸微生物的作用下，分解生成其他代謝產物，導致含量降低[29]。在SDF中，阿魏酸可能與膳食纖維結合較弱，在發(fā)酵第5小時被完全釋放，之后在結腸微生物的作用下進一步分解行成其他代謝產物，導致含量呈逐漸降低的趨勢[31]。

表 4 SDF在體外結腸發(fā)酵液中酚類化合物的含量*Table 4 Contents of phenolic compounds in in vitro colon fermentation broth of SDF*μg/g

3 結 論

通過體外結腸發(fā)酵，測定青稞膳食纖維中多酚含量、黃酮含量、多酚組成和體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)在體外結腸發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，IDF中多酚和黃酮含量呈逐漸升高趨勢，在第48小時含量最高，分別為（54.00f 1.02）、（1.51f 0.18）μmol/g；SDF中多酚和黃酮含量呈先升高后下降趨勢，在第30小時含量最高，分別為（50.62f 2.45）、（0.69f 0.09）μmol/g；膳食纖維中多酚抗氧化活性的變化趨勢與含量變化趨勢相似，IDF中多酚的抗氧化活性逐漸增強，在第48小時達到最高；SDF中多酚的抗氧化活性呈先升高后下降趨勢，在第30小時達到最高；同時，對體外結腸發(fā)酵液中多酚的組成分析可知，青稞膳食纖維中酚類化合物分為羥基苯甲酸、羥基肉桂酸和類黃酮，包括18 種酚類化合物，阿魏酸可作為青稞中酚類化合物的生物標志物，隨著發(fā)酵時間的延長，在IDF和SDF中含量均呈先升高后下降趨勢。說明青稞膳食纖維經體外結腸發(fā)酵后，其中的酚類化合物會被逐漸釋放出來，導致多酚含量升高，抗氧化活性增強，為青稞功能食品的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。