乙醇降解菌種的篩選及其發酵乳產品 解酒功效評價

劉威良，毛瑞霞，王雪,2,，姬 昱，趙存朝，魏光強，黃艾祥

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南省畜產品加工工程技術研究中心，云南 昆明 650201）

飲酒過量或飲酒不當會造成乙醇在體內代謝產生許多有害物質及大量自由基，給人體造成很大傷害，長期飲酒不僅會造成大腦功能障礙和意識障礙，還會形成慢性乙醇中毒[1-3]。飲酒帶來最大傷害的是肝臟，因為乙醇進入人體后90%以上是由肝臟代謝，而肝臟所產生的代謝產物及酒造成肝細胞代謝紊亂，是引起乙醇性肝損傷的主要原因[4-6]。我國古代著名醫藥學家李時珍所著的《本草綱目》中記載有：“凡酒醉不醒之人，用生葛根搗汁飲，方可解‘酒毒’”，可見葛根中含有一些解酒功效成分，具有一定的開發利用價值[7]。現代市售的解酒、醒酒產品發揮其功效多是基于該類產品在人體服用后能夠影響乙醇代謝或抑制乙醇吸收[8-9]，但不能直接降解體內乙醇。很多醒酒藥并沒有實質的醒酒作用，只是起到安慰鎮定、緩解頭痛等作用，有些醒酒藥雖具有一定解酒、醒酒功效，但也會伴隨著不同的副作用，對人體健康不利。

微生物生長過程需要碳水化合物，若其可以利用乙醇作為碳源之一，就能起到降解乙醇的作用，但對于這方面的研究報道較少。因，本實驗以前期確定的10 株發酵性能良好、食用安全的乳酸菌為出發菌種，通過乙醇耐受度、乙醇降解能力測定，篩選出具有較強乙醇降解能力的菌種，并以菌種與瑞士乳桿菌、嗜熱鏈球菌互配，用牛奶、新鮮葛根、蔗糖為原料生產一種解酒發酵乳產品；進一步在體外模擬、腸液消化條件下分析該發酵乳產品對乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性及抗氧化活性的影響，結合體內動物灌實驗構建大鼠急性乙醇致肝損傷模型[10]，檢測大鼠血液中乙醇含量及其對血清中谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性的影響，分析該發酵乳產品對肝細胞的保護作用，為后續解酒功能性產品的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物： S D 雄性大鼠4 0 只（ 體質量180～250 g），動物許可證號 SCXK（滇）2016-0002，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

L-谷光甘肽 北京北納創聯生物技術研究院；1,1-聯苯基-2-苦基肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 上海源葉生物科技有限公司；海王金樽片 海王健康科技發展有限公司；ADH 美國Sigma公司；MRS改良培養基、營養肉湯 廣東環凱微生物科技有限公司；ALT測定試劑盒、AST測定試劑盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

URA14M0018型分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；TGL20M型高速冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限公司；SVJ-358型智能商用型酸奶機 北京世紀陽 光科技發展有限公司；SW-CJ-IF型單人雙面超凈無菌操作臺 蘇州江東精密儀器有限公司；HPX-9272ME型恒溫培養箱 上海博訊實業有限公司；ZQLY-180S型振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；TRACE 1300型氣相色儀、Tri Plus 300型頂空進器、Multiskan Go型酶聯免疫檢測儀 美國Thermo公司；GMSX-280型壓力蒸汽滅菌器 北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

分別取適量乳酸菌菌株凍干粉接種于10 mL滅菌MRS肉湯培養基中，旋渦混勻，恒溫培養箱中37 ℃培養24 h，得到1 代菌懸液。按10%的接種量將1 代菌懸液再接種于MRS肉湯培養基中，37 ℃恒溫培養18 h，得到2 代菌懸液。重復上述步驟，37 ℃恒濕培養12 h，得到3 代菌懸液，4 ℃保存備用。

1.3.2 菌種馴化

將活化好的乳酸菌菌懸液接種到牛乳中進行馴化增殖，依次調整菌種接種量為8%、6%、4%、2%，40 ℃恒溫培養至凝乳，需保證菌種活力能在4 h內凝乳。

1.3.3 乙醇耐受菌種的篩選

將稀釋到適宜稀釋度的10 株乳酸菌分別取0.1 mL接種于添加量為0%、10%、15%、20%無水乙醇的滅菌MRS改良培養基中[11-12]，每組3 個平行，用搖珠進行涂布，于37 ℃厭氧培養12 h。參照GB 4789.35ü 2010《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行乳酸菌總數測定，以活菌數為指標，篩選得到乙醇耐受菌種。

1.3.4 乙醇降解菌種的篩選

1.3.4.1 溶液配制

乙醇標準液：精密吸取無水乙醇適量，加入蒸餾水中，配成體積分數1%、2%、3%、4%、5%的乙醇標準液；重鉻酸鉀-硫酸溶液：取重鉻酸鉀1 g溶于25 mL水中，邊攪拌邊緩慢加入4 mL濃硫酸；乙醇富集培養液：取3%乙醇耐受菌液加入50 mL滅菌MRS改良培養基的三瓶中，于厭氧培養箱中37 ℃恒溫培養8 h，使培養基中乙醇耐受菌充分富集，同時以MRS培養液為溶劑，分別配制20%、40%乙醇體積分數的MRS乙醇培養液，現配現用。

1.3.4.2 乙醇標準曲線繪制

向試管中分別加入0%、10%、20%、30%、40%、50%的乙醇標準液0.1 mL，每個試管中加入重鉻酸鉀-硫酸溶液1.0 mL，充分搖勻，蓋好蓋子；將試管置于沸水浴中10 min，使重鉻酸鉀-硫酸溶液充分氧化；取出試管，于610 nm波長處測定重鉻酸鉀-硫酸溶液的吸光度。以乙醇體積分數為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作乙醇標準曲線（y=0.162x0.002 3，R2=0.997 4），根據標準曲線計乙醇體積分數。

1.3.4.3 乙醇降解能力測定

參照高慧[13]的方法，分別取不同體積分數乙醇培養液5 mL于試管內，將篩選到的菌株200 μL接種于培養液內，混勻靜置，37 ℃厭氧培養24 h。以不加菌液的MRS乙醇培養液作為對照，利用重鉻酸鉀-硫酸法測定乙醇殘留量，分析各菌種的乙醇降解能力。

1.3.5 解酒發酵乳生產工藝流程

選用生產酸奶及發酵乳常用的基礎菌種嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌與最佳的乙醇降解菌種嗜酸乳桿菌復配為發酵菌種，分別發酵牛乳和葛根液，再進行調配得到解酒發酵乳，具體流程如下：

1.3.6 解酒發酵乳體外功能活性分析

人工模擬腸液的配制：稱取KH2PO46.85 g，加蒸餾水500 mL使其溶解，用0.4 g/100 mL NaOH溶液調節pH值至6.8，加水稀釋，然后加入1 g/100 mL的胰蛋白酶，加水使其充分溶解，定容至1 L，混勻備用。

1.3.6.2 解酒發酵乳對ADH活性的影響

1.3.6.3 解酒發酵乳的體外抗氧化活性

1.3.7 解酒發酵乳體內功能活性分析

1.3.7.1 解酒發酵乳對醉酒大鼠體內乙醇含量的影響

雄性大鼠40 只，隨機分為4 組，每組8 只，分為對照組、海王金樽組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，確保各組老鼠體質量無顯著性差異（P＞0.05）。各組大鼠禁食16 h后，用16 mL/kg劑量的白酒進行灌。以翻正反射消失為醉酒指標，達到醉酒狀態后進行解酒發酵乳灌，低、中、高劑量組的解酒發酵乳灌量分別為1.5、3、6 mL/kg，對照組以灌生理鹽水為空白對照、灌解酒藥物海王金樽為陽性對照。灌后，灌酒1 h采用大鼠眼內眥取血（用定量毛細管吸取一定體積血液），灌入解酒發酵乳后1、2、3 h分別取全血，采用頂空氣相色法[16-17]測定乙醇含量，分析解酒發酵乳對醉酒大鼠體內乙醇的降解能力。

1.3.7.2 解酒發酵乳對醉酒大鼠肝損傷的保護作用

1.3.8 測定方法

1.3.8.1 ADH激活率測定

采用瓦勒-霍赫法[20-21]測定ADH活性。吸取焦磷酸鈉緩沖液1.5 mL、NAD1.0 mL、乙醇溶液0.5 mL和品0.1 mL相混合，25 ℃加蓋溫浴5 min后，立即加入ADH溶液0.1 mL并搖勻，用分光光度計測定340 nm波長處的吸光度，以后每隔10 s讀數一次，連續測定5 min。以不加品的反應組為空白對照，以吸光度對時間作曲線圖，取反應液最初組分，計在340 nm波長處吸光度每10 s的增加值，再根據NADH在340 nm波長處的摩爾消光系數為6.2，計酶活性。ADH活性以每分鐘NADH生成物質的量（nmol）表示，ADH激活率計如式（1）所示：

1.3.8.2 DPPH自由基清除能力測定

參照曾麗等[22]方法，分別吸取處理方式不同的解酒發酵乳的等量上清液，加入31 μg/mL DPPH溶液，充分振搖后，室溫下暗處放置0.5 h，于517 nm波長處測定吸光度。以谷光甘肽為標準品，繪制標準曲線回歸方程為y=0.017 1x0.318 6（6.4～38.4 μg/mL，R2= 0.992 5）；y為DPPH自由基清除率，x為谷光甘肽質量濃度（μg/mL）。DPPH自由基清除率計如式（2）所示：

式中：A1為實驗組吸光度；A2為品干擾實驗吸光度（調零）；A3為DPPH-甲醇溶液吸光度；A4為蒸餾水吸光度（調零）。

1.3.8.3 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參照黃佳琦[23]、Agrawal[24]等方法并進行修改。分別吸取處理方式不同的解酒發酵乳的等量上清液，加入ABTS稀釋工作液3.8 mL，室溫下反應6 min，于734 nm波長處測定吸光度。以谷光甘肽為標準品，繪制標準曲線回歸方程為y=0.010 9x0.057 6（9.6～57.6 μg/mL，R2=0.992 6）；y為ABTS陽離子自由基清除率，x為谷光甘肽質量濃度（μg/mL）。ABTS陽離子自由基清除率計如式（3）所示：

式中：A1為實驗組吸光度；A2為品干擾實驗吸光度（調零）；A3為ABTS工作液吸光度；A4為蒸餾水吸光度（調零）。

1.3.8.4 大鼠全血中乙醇含量測定

標準曲線制作：分別取0、0.1、0.2、0.4、0.8 mL的乙醇標準儲備液（200 mg/100 mL）于10 mL頂空瓶中，加入空白組血液至1 mL，配制成質量濃度為0、20、40、80、160 mg/100 mL，混勻后置于頂空裝置中70 ℃恒溫30 min，自動進上層氣體1 mL，以保留時間定性，以面積定量，以乙醇質量濃度（mg/100 mL）為橫坐標，面積（mV）為縱坐標繪制標準曲線。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2003軟件進行數據處理分析，結果以f s表示，統計學差異分析方法采用ANOVA的Tukey方法， P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 乙醇降解菌種的篩選

2.1.1 乙醇耐受菌篩選

表 1 10 株乳酸菌在不同乙醇體積分數下培養12 h的活菌數變化Table 1 Changes in viable cell count of 10 Lactobacillus strains cultured at different ethanol concentrations for 12 h

實驗前期通過發酵性能測定選取嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌等10 株發酵性能良好且食用安全的菌株，在15%、20%乙醇體積分數下測定其對乙醇的耐受度。由表1可知，副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌3 株菌相比其他7 株乳酸菌，在2 種乙醇體積分數下的活菌數較多，其中以嗜酸乳桿菌的存活數最多，可能是3 株菌自身帶有相關乙醇耐受基因[25-26]，在含有乙醇的環境下依然能夠較好的生長，具有較好的乙醇耐受能力。

2.1.2 乙醇降解菌篩選

通過乙醇耐受度測定得到1 株乙醇耐受效果最明顯的菌種嗜酸乳桿菌。由圖1可知，在20%乙醇體積分數下，嗜酸乳桿菌乙醇降解效果最好，培養24 h后乙醇為10%左右，副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌次之，其他菌株變化不明顯；在40%乙醇體積分數下，嗜酸乳桿菌的乙醇降解效果也是最好，培養24 h后乙醇降為15%左右，副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌次之，降解效果均沒有嗜酸乳桿菌明顯。由表明，在20%、40%乙醇體積分數下，嗜酸乳桿菌能夠有效利用乙醇作為碳源之一，從而發揮降解乙醇的作用[27]。因，最終選取嗜酸乳桿菌作為最佳的乙醇降解菌種。

圖 1 20%（A）和40%（B）乙醇體積分數下菌種的降解效果Fig. 1 Ethanol degradation ability of 10 strains at 20% (A) and 40% (B) ethanol concentration

2.2 解酒發酵乳的體內外功效評價

表 2 模擬胃、腸液消化條件下ADH激活率測定Table 2 ADH activation rates of fermented milks in simulated gastrointestinal tract

表 3 模擬胃、腸液消化條件下自由基清除能力 Table 3 Free radical scavenging capacities of fermented milks in simulated gastrointestinal tract μmol/mL

2.2.3 解酒發酵乳對醉酒大鼠體內乙醇含量的影響

圖 2 灌入解酒發酵乳前后大鼠血液中乙醇含量變化Fig. 2 Change in blood alcohol concentration of alcohol-drinking rats at different times after oral administration of fermented milk

2.2.4 解酒發酵乳對醉酒大鼠肝損傷的保護作用

血清酶學中對ALT和AST的檢查是診斷肝損傷的重要指標，肝細胞發生實質性損害時，細胞膜通透性改變，胞內的ALT和AST釋放至血液中，導致血中酶活性 偏高[32]。正常肝臟組織中轉氨酶含量是血液的100 倍，當肝臟出現實質性損傷時，若出現1%的肝細胞壞死狀況，血清中的轉氨酶活性即提高數倍，所以AST和ALT活性是考察肝損傷的敏感性指標[33]。

圖 3 灌入解酒發酵乳前后大鼠血清中AST（A）、ALT（B）活性變化Fig. 3 Changes in serum AST (A) and ALT (B) activity in rats at different times after oral administration of fermented milk

如圖3所示，與空白對照組相比，大鼠灌酒1 h后分別灌入低、中、高劑量的解酒發酵乳，在3 個時間段大鼠血清中AST和ALT活性均顯著降低，且呈現劑量依賴性，陽性對照組后3 個時間段血清中AST和ALT活性均高度顯著（P＜0.001）。其中，中、高劑量組分別在2、3 h后大鼠血清中AST和ALT活性出現明顯下降（P＜0.001），尤其在3 h遠低于空白對照組、略高于陽性對照組，可能是因為解酒發酵乳中的乙醇降解菌和葛根發生了協同作用，有效緩解大鼠肝細胞發生實質性損害，從而抑制了胞內ALT和AST的釋放[34]。由表明，解酒發酵乳對乙醇致肝損傷有較好的保護作用，降低動物血清中AST和ALT活性，可有效預防肝細胞因乙醇過度刺激導致的壞死。

3 結 論

過量飲酒會使乙醇在人體內代謝產生有害物質及大量自由基，為緩解過量飲酒對人體造成的傷害，本實驗以前期確定的10 株發酵性能良好、食用安全的乳酸菌為出發菌種，通過乙醇耐受度、乙醇降解能力測定，篩選出具有高效乙醇降解能力的嗜酸乳桿菌，并以菌種與瑞士乳桿菌、嗜熱鏈球菌互配，用牛奶、新鮮葛根、蔗糖為原料生產出一種解酒發酵乳產品。該發酵乳產品在體外模擬、腸液消化條件下，能使ADH激活率分別達到（36.87f 1.58）%、（33.64f 1.90）%，ABTS陽離子自由基清除能力分別為（1 293.72f 4.12）、（729.98f 21.37）μmol/mL，DPPH自由基清除能力分別為（16.14f 0.12）、（11.26f 0.10）μmol/mL；大鼠體內灌不同劑量的解酒發酵乳均能降低血液中乙醇含量，尤其是高劑量組3 h后降為51.62 mg/100 mL（P＜0.001），并能不同程度地降低大鼠血清中ALT和AST活性且呈劑量依賴性，對乙醇所致肝損傷有較好的保護作用。該研究可為后續解酒功能性產品的研發提供一定的科學依據。