發酵條件對植物乳桿菌葉酸合成的影響

李強坤，柳陳堅，羅義勇，楊 恩，李曉然

（昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500）

葉酸，也稱為VB9，在嘌呤、甲酰甲硫氨酸、胸腺嘧啶、泛酸、甘氨酸、絲氨酸和蛋氨酸合成過程中作為一種碳轉移反應的輔因子，對于人體健康極為重要[1]。作為一碳供體，葉酸參與核苷酸生物合成過程中發生的甲基化和甲酰化反應[2]。在妊娠期，如果缺乏葉酸將損害胚胎組織中的DNA合成，導致細胞分裂率降低[3]。植物、真菌、某些原生動物和大多數細菌可以從頭開始合成葉酸，但高等動物缺乏葉酸生物合成途徑的關鍵酶[4]。生物來源的葉酸多為多聚谷氨酸葉酸，而化學合成的葉酸膳食補充劑則多為單谷氨酸葉酸，然而，在生物體內，大多數依賴葉酸的酶更傾向于使用多聚谷氨酸葉酸而不是單體谷氨酸葉酸[5]。因，對于人體來說，從膳食中攝入葉酸比直接通過化學制劑攝取更有優勢。

在細菌和植物等模式生物中，葉酸合成和補救途徑已經被廣泛研究，并且在細菌和植物主要通過誘導相關基因高表達提高其葉酸產量[6-8]。乳酸菌是一類低GC含量的革蘭氏陽性菌，有助于改善食品品質，改良風味，并有助于改善營養和有利于人體健康，越來越多用于生產健康的功能性食品。但在乳酸菌中，Lactococcus lactis和Streptococcus thermophilus不能合成葉酸，研究發現，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）能產生葉酸[9-10]。L. plantarum可利用不同的食品基質進行發酵，包括乳制品、蔬菜、淀粉類和肉類等[11-12]。L. plantarum可以產生 B族維生包括葉酸，且菌株合成葉酸的能力具有一定的差異性，如L. plantarum WCSF1具有較好的合成葉酸能力。產生葉酸的谷氨酸殘基數量和產量主要取決于菌株本身和培養條件[13]。在分析葉酸產量的研究中，大多關注在培養末期葉酸的最終產量，而很少研究在其培養過程中葉酸產量發生的變化，對這些過程進行深入了解對更好調控葉酸產量極為重要[8,14]。

在乳酸菌葉酸合成的兩條代謝支路中存在較多有調節作用的酶，在喋呤代謝支路中，三磷酸鳥苷（guanosine triohosphte，GTP）在環化水解酶I、氫新喋呤三磷酸焦磷酸酶（d i h y d r o n e o p t e r i n triphosphate pyrophosphatase，DHNTPase）、氫新喋呤醛縮酶及6-羥甲基氫蝶呤焦磷酸激酶（6-hydroxymethyldihydropterin pyrophosphate kinase，DHPPK）的催化作用下合成6-羥甲基氫蝶呤焦磷酸（6-hydroxymethyldihydropterin pyrophosphate，DHPPP），這是葉酸生物合成的一個原料，該生物合成涉及的相關酶分別由folE、folQ、folB和folK基因編碼表達而成，DHPPP與對氨基苯甲酸（p-aminobenzoic acid，pABA）在氫蝶酸合酶（dihydropteroate synthase，DHPS）作用下結合生成氫蝶酸，該酶由folP基因編碼表達。這些基因在乳酸菌中通常以基因簇的形式存在，上述5 個基因的表達與否可直接影響整個代謝通路[15]。

本研究使用2 種基質發酵，研究不同基質對葉酸產生的影響。酸性條件下葉酸不穩定，pH值低于4.5時會完全分解；而堿性或中性條件下葉酸較穩定[16-17]，因，在本研究中，用1 株已發現的高產葉酸的L. plantarum 4-3對脫脂奶和豆漿兩種基質進行發酵，通過調節其發酵過程中的pH值，探索不同發酵基質以及pH值對葉酸產量和合成葉酸相關基因表達量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從云南傳統發酵食品分離得到的L. plantarum 4-3菌株，保存于昆明理工大學生命科學與技術學院應用微生物實驗室。

MRS培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉 8.0 g，酵母提取物4.0 g，葡萄糖20.0 g，Tween-80 1 mL，磷酸氫鉀2.0 g，醋酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g，加蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌15 min，冷卻后4 ℃保存備用。

cowala脫脂奶購于GMP Dairy Limited公司，按10%的比例用蒸餾水溶解，105 ℃滅菌40 min。

豆漿：將溫水浸泡15 h的1 kg黃豆制備成原始豆漿，采用100 目篩對原始豆漿進行過濾，并用純水將過濾后的豆漿稀釋至5 L，105 ℃滅菌40 min。

1.2 儀器與設備

BIOFLO 415發酵罐 德國Eppendorf公司；Applied Biosystems 7300實時聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）系統 美國Thermo Fisher公司；QTRAP?4500高效液相色-質聯用儀 美國AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 L. plantarum 4-3菌株發酵條件

取冷凍保存的L. plantarum 4-3菌株解凍，涂布后37 ℃培養，挑取單菌落于MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養12 h，按1%比例接種至5 mL MRS肉湯培養基中，37 ℃恒溫靜置培養12 h，再將其按1%接種至50 mL MRS培養基中，37 ℃擴大培養12 h，通過活菌計數法計菌液濃度，按107CFU/mL的終濃度將其接種至5 L脫脂奶或豆漿中，37 ℃、150 r/min發酵。在控制pH值發酵過程中，使用10 mol/L NaOH溶液使MRS發酵液pH值維持在6.0。

1.3.2 L. plantarum 4-3菌株生長動態監測

1.3.3 葉酸合成相關基因表達量測定

取L. plantarum 4-3菌株12、24、36、48 h發酵液進行RNA提取，使用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），使用反轉錄試劑盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（南京諾唯贊生物科技有限公司）進行反轉錄，最后進行熒光實時定量PCR（quantitative PCR，qPCR）測定L. plantarum 4-3葉酸合成相關基因表達情況。qPCR所使用的引物均為本研究自行設計，具體序列信息見表1，使用ChamQTMSYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）對反轉錄后的產物進行擴增，以16S rRNA基因為內參，每個品做3 個重復，經過梯度PCR測試。雖然每對引物溶解溫度不完全一，但在60 ℃退火溫度條件下均能達到較好的擴增效率，因擴增程序統一為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃復性30 s，擴增40 個循環后置于4 ℃保存。qPCR結果用ΔΔCt代表相對表達量，以MRS培養基中12 h品各個基因表達量作對照。

表 1 qPCR所使用引物及擴增效率Table 1 Sequences of primers used in qPCR and their amplification efficiency

1.3.4 葉酸含量測定

取L. plantarum 4-3在12、24、36、48、60、72、84、96 h發酵液超聲破碎10 min，12 000 r/min離心5 min，將處理好的品用高效液相色-質聯用儀進行葉酸含量測定。質條件：氣簾氣壓力25 psi，碰撞氣中等，離子源氣1壓力45 psi，離子源氣2壓力50 psi，電噴霧電壓5 500 V，加熱器溫度350 ℃，選用正離子模式進行檢測，離子源為電噴霧電離源。

1.4 數據統計分析

每組實驗重復3 次，使用GraphPad Prism 6軟件對實驗所得數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 L. plantarum 4-3發酵過程中生長特性

L. plantarum在發酵過程中會產生大量的有機酸，使得培養環境處于酸性條件，微生物細胞對pH值的改變非常敏感，即使是乳酸菌，在較低pH值條件下也會抑制其生命活動[17-18]。用脫脂奶發酵時，42 h的pH值降到最低，約為3.9（圖1A）；而以豆漿為發酵基質時，12 h時pH值降到最低，約為4（圖1B）。熊濤等[19]研究發現，pH值控制在5.8～6.3之間，乳酸菌活菌數最高，不在范圍內的乳酸菌生長的活菌數較低，特別是控制pH 4.8～5.3內活菌數最低。在本研究中，使用可以自動監測并調節pH值的發酵罐培養，在整個培養周期內pH值維持在6.0時，不僅延長了平臺期，而且在較長時間內維持較高的活菌數。在沒有調節pH值的情況下，L. plantarum達到穩定期后在較短時間內活菌數迅速減少（圖1），結果表明，調節pH值保持在6.0可以使L. plantarum 4-3菌株細胞死亡速度降低，使培養基內的活細胞密度長時間維持在較高水平。外，從菌株生長曲線可知，當以豆漿為發酵基質且維持pH 6.0時， L. plantarum 4-3達到穩定期的時間最短，且維持穩定期的時間最長，有利于次級代謝產物的產生。

圖 1 L. plantarum 4-3的脫脂奶（A）和豆漿（B）發酵pH值及 活菌數動態變化Fig. 1 Dynamic changes in pH and viable cell count during culture of L. plantarum 4-3 in skim milk (A) and soybean milk (B)

2.2 L. plantarum 4-3葉酸產量

圖 2 L. plantarum 4-3發酵的脫脂奶（A）和豆漿（B）葉酸含量Fig. 2 Change in folate concentration in skim milk (A) and soybean milk (B) inoculated with L. plantarum 4-3

臨床推薦孕婦葉酸攝入量為400 μg/d，但主要補充化學合成葉酸，研究表明，化學合成葉酸存在一定的副作用[22-23]；因，雖然L. plantarum 4-3發酵的脫脂奶和豆漿不能提供足夠的葉酸，但可以作為天然葉酸的膳食補充劑。與其他L. plantarum野生型菌株相比[8]，本研究發酵條件下，葉酸產量更高，尤其是在基因改造菌株難以直接進入食品的情況下，對其發酵條件進行調整和優化獲得更多的生物合成葉酸產量極為必要[24-25]。

2.3 L. plantarum 4-3合成葉酸基因表達量

圖 3 L. plantarum 4-3發酵的脫脂奶（A）和豆漿（B）葉酸合成中 主要基因的相對表達量Fig. 3 Expression levels of major genes involved in folate biosynthesis in L. plantarum 4-3 cultured in skim milk (A) and soybean milk (B)

為研究在培養過程中pH值對葉酸合成相關基因的影響，使用qPCR方法對葉酸生物合成過程中合成DHPPP和氫蝶酸的主要基因進行定量檢測。

圖3顯示，在pH 6.0條件下，葉酸相關合成基因在脫脂奶和豆漿兩種基質中的表達均顯著提高，當維持pH 6.0時，葉酸分別在第36小時和第24小時開始積累，說明pH 6.0有利于葉酸的合成。Sybesma等[26]研究發現，乳酸菌中的DHPPK與GTP環化水解酶I是由一個folKE基因編碼的雙功能蛋白，過量表達該基因可以使胞外葉酸從 10 ng/mL明顯增加到80 ng/mL；folE基因編碼的GTP環化水解酶I是喋呤代謝支路反應的第1步，也是限速步驟[27]。維持pH 6.0發酵時，在脫脂奶和豆漿兩種基質中folE基因表達量顯著提高，但與其他基因相比其表達量相對較低，可能限制了葉酸的合成。folQ基因編碼DHNTPase，據報道，目前只在乳酸菌和植物中被發現[28-29]。然而大部分乳桿菌屬的乳酸菌中沒有folQ基因，使該類乳酸菌不能有效合成葉酸[30-32]。結果顯示，L. plantarum 4-3在兩種基質中都具有較高的表達量；DHPS由folP基因編碼表達，梁業紅[33]研究表明，過量表達細菌中的folP基因可以顯著提高擬南芥植株的葉酸含量。外，DHPS催化合成的底物氫蝶酸對DHPS有強烈的抑制作用[34]，因過量表達folP基因可能提高了氫蝶酸的含量，但氫蝶酸被競爭性地用于葉酸的合成和抑制DHPS的活性，兩種反應競爭的結果導致葉酸的合成速度只能有限度增加。folP基因在兩種基質中都有很高的表達量，但葉酸含量相對較低，也可能是由反饋抑制造成的。

葉酸合成的其他基因，如pABA合成通路上的相關基因，也與葉酸產量密切相關。pABA是葉酸的重要前體[13]，較多葉酸合成的研究在培養基中額外添加pABA提高葉酸產率[14,24]。后續研究將深入分析支路對 L. plantarum葉酸合成的影響，為開發富含葉酸的發酵食品提供理論支持。

3 結 論

L. plantarum是應用廣泛的益生菌，其可以合成葉酸的特性賦予了這類細菌更好的應用價值。乳酸菌葉酸相關合成基因數量很多，發酵條件對葉酸的合成影響很大。結果顯示，與脫脂奶相比，用豆漿發酵能產生更多的葉酸。外，L. plantarum在生長過程中持續產生有機酸使得培養基的pH值降低，將pH值穩定在6.0有利于細菌長時間保持高密度生長，在條件下，葉酸合成相關基因也有較高的表達，大大提高了葉酸的生產水平。