敲除ptsG基因及共表達透明顫菌血紅蛋白提高大腸桿菌SHMT產量

韓 琴，徐新星，王儒昕，李 鑫，閆達中，吳 菁，劉 軍

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023）

引文格式：韓琴, 徐新星, 王儒昕, 等. 敲除ptsG基因及共表達透明顫菌血紅蛋白提高大腸桿菌SHMT產量[J]. 食品科學, 2020, 41(2): 119-125. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181114-165. http://www.spkx.net.cn

HAN Qin, XU Xinxing, WANG Ruxin, et al. Knockout of ptsG and co-expression with Vitreoscilla hemoglobin enhance the production of serine hydroxymethyltransferase in Escherichia coli[J]. Food Science, 2020, 41(2): 119-125. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181114-165. http://www.spkx.net.cn

L-絲氨酸是一種具有重要價值的氨基酸，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等行業中[1]。L-絲氨酸每年約3 000 t市場量，如果生產成本降低，市場量會進一步增 加[1-2]。L-絲氨酸生產方法主要有蛋白水解提取法[3]、化學合成法[4]、發酵法[5-6]、前體物細胞轉化法[7]或酶轉化法[8]。

蛋白水解提取法存在工藝復雜和分離精制困難等缺點。化學合成法存在污染重和D-絲氨酸與L-絲氨酸分離困難等缺點。發酵法生產L-絲氨酸主要是利用大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌，它們合成L-絲氨酸代謝網絡復雜，并且胞內L-絲氨酸可用于合成甘氨酸、半胱氨酸和色氨酸，作為碳單位來源用于合成嘌呤、胸腺嘧啶核苷酸和磷脂分子。另外，在脫水酶或脫氨酶作用下，胞內L-絲氨酸被降解，故L-絲氨酸在體內很難得到積累[1]。前體物細胞轉化法存在轉化率偏低、反應時間長以及成本高等缺陷[7]。酶轉化法是目前國際上普遍采用的方法，具有反應過程簡單、副反應少和生產效率高等優點。絲氨酸羥甲基轉移酶（serine hydroxymethyltransferase，SHMT）是用于絲氨酸酶法合成的酶，它由glyA編碼，以吡哆醛磷酸酯為輔酶，在四氫葉酸存在下催化甲醛、甘氨酸生成L-絲氨酸[8]。

SHMT的高效制備是酶法生產L-絲氨酸的基礎。菌體高密度培養可以提高單位發酵液產酶水平。然而，在大腸桿菌高密度發酵生產過程中，菌體生物量和外源蛋白表達量往往受到溶解氧不足的限制而難以達到較高的水平，提高細胞的氧利用效率能夠增加菌體生長。血紅蛋白是生物體結合、運輸氧分子的蛋白質，廣泛存在于細菌、真菌和動植物中[9]。透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）是一種專性好氧的革蘭氏性絲狀菌在低氧環境中產生的一種可溶性蛋白，具有較高的氧吸附和解離速率常數[10]。該蛋白已在多種宿主中成功表達，能夠促進細胞生長、蛋白質合成和提高代謝物產率[11]，表明在大腸桿菌中共表達目的蛋白和VHb是改善發酵過程溶氧限制、增加細胞生長和外源蛋白產量的有效手段。已報道，在大腸桿菌中共表達 α-淀粉酶和VHb，提高了α-淀粉酶的表達量[12-13]；Pablos等[14]在大腸桿菌菌株W3110中表達VHb后，微氧環境中菌體生物量提高了約33%，同時菌體比生長速率提高了約30%。于慧敏等[15]將vgb基因插入產聚β-羥基丁酸酯（poly-β-hydroxybutyrate，PHB）重組大腸桿菌VG1（pTU14）染色體中，發現vgb基因的引入可以同時促進菌體生長和PHB的積累，且溶氧水平越低，VHb表達量越大，這種促進作用越明顯。鄭方亮等[16]通過敲除ATP合酶基因并進一步插入vgb基因，使鈍齒棒桿菌T6-13谷氨酸產出累積量提高了36.91%。

大腸桿菌在高密度發酵過程中，產生乙酸等代謝副產物。乙酸累積是抑制菌體生長和外源蛋白產量的另一重要因，乙酸產生是由于菌體對葡萄糖的攝取速率與細胞的碳代謝速率不平衡所致[17]。大腸桿菌對葡萄糖的攝取主要通過磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）完成，PTS包括EI、HPr以及EIIs，前兩者為胞質可溶型蛋白，分別由ptsH基因和ptsI基因編碼，后者多為蛋白復合體，對碳水化合物具有特異性，包括EIIMan、EIIFru、EIIBgl、EIIAGlc和EIICBGlc等[18]，其中由ptsG基因編碼的酶EIICBGlc在葡萄糖的跨膜轉運中具有重要作用[19]。EIICBGlc蛋白介導的高效葡萄糖磷酸轉運，易導致胞內三羧酸循環和糖酵解不平衡，從而生成大量乙酸，不利于菌體高密度生長[20]。韓武洋等[21]敲除了谷氨酸棒桿菌ATCC13032編碼葡萄糖PTS系統關鍵轉運蛋白基因ptsG、ptsH-ptsI和葡萄糖轉運系統關鍵轉運蛋白基因abc、abc2和iolt1，表明ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1所編碼的轉運蛋白具有葡萄糖轉運功能，并且葡萄糖的轉運除PTS外還存在其他轉運系統。ptsG基因缺陷菌株能使胞內三羧酸循環和糖酵解趨于平衡，乙酸產量減少。因，利用代謝工程技術，構建ptsG基因敲除菌株，能夠降低葡萄糖攝取速率及乙酸累積，促進菌體生長，增加外源蛋白的表達量。

鑒于VHb與ptsG基因的生物學效應，本研究將敲除大腸桿菌ptsG基因，在缺失ptsG基因菌株中共表達SHMT和VHb，以期提高工程菌株產SHMT的能力，實現工程菌株高效生產SHMT，為酶法制備L-絲氨酸提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

透明顫菌（Vitreoscilla）、Escherichia coli DH5α、E. coli BL21（DE3）、質粒pKD13（氯霉抗性）、質粒pCP20（氨芐霉、氯霉抗性）、質粒pKD46（氨芐霉抗性）由本實驗室保存；pET-28a載體 德國Novagen公司。

1.1.2 試劑、試劑盒與引物

限制性內切酶、T4 DNA Ligase、PyrobestTMDNA Polymerase、DNA Marker、蛋白Marker 日本TaKaRa公司；細菌基因組快速提取試劑盒、質粒快速提取試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物回收試劑盒、GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、L-阿拉伯糖、氯霉、氨芐青霉、卡那霉上海捷瑞生物工程有限公司；Tris base、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺 美國Fluka公司；蛋白胨、酵母粉 英國Oxoid公司；其余試劑均為國產分析純。

引物由上海捷瑞生物工程公司合成，具體序列見表1。

表 1 實驗所用引物Table 1 Primer sequences used in this research

1.1.3 培養基

LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L； LBG培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L， 葡萄糖25 g/L。

1.2 儀器與設備

GBox-HR-E-M凝膠成像系統 英國Syngene公司；TProfessional PCR儀 德國Biometra公司；5417R臺式高速冷凍離心機、Electroporator 2010電轉化儀 德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀、DYCZ系列垂直式電 泳槽 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 ptsG基因敲除菌株的構建

利用Red同源重組技術敲除大腸桿菌BL21（DE3）的ptsG基因[22]。以pKD13為模板，Pcmr上和Pcmr下擴增氯霉抗性基因。以大腸桿菌BL21（DE3）基因組為模板，以PptsGA上與PptsGA下擴增ptsG基因上游同源臂，以PptsGB上與PptsGB下擴增ptsG基因下游同源臂。利用重疊PCR連接上述三片段，回收兩端具有ptsG基因的氯霉抗性基因片段，用于敲除大腸桿菌ptsG基因。

按1%接種量，將過夜培養攜帶pKD46質粒的大腸桿菌BL21（DE3）菌液接種至50 mL加有氨芐青霉（60 μg/mL）的LB培養基中，培養至OD600nm為0.5～0.6，加入0.1 g/100 mL L-阿拉伯糖誘導2 h。將菌液冰浴，離心收集菌體。用10%甘油清洗菌體3 次后懸于500 μL甘油中，制備電轉化感受態細胞。將兩端具有同源臂的氯霉抗性基因片段電轉化至感受態細胞（電轉條件：電壓1.8 kV/cm、1 mm電擊杯）。加入1 mL預冷的LB培養基，在37 ℃、100 r/min培養2 h。涂布于含有氯霉（25 μg/mL）的LB平板，篩選重組子，利用PCR鑒定，并測序確證。

1.3.2 表達載體及工程菌株的構建

以大腸桿菌BL21（DE3）基因組為模板，用PSHMT上和PSHMT下擴增出glyA基因；以透明顫菌基因組為模板，用PVHb上和PVHb下擴增出vgb基因。用NcoI和BamHI雙酶切純化后的PCR產物，依次用T4 DNA Ligase連接到用NcoI和BamHI雙酶切的質粒pET-28a上，得到重組質粒pET-glyA和pET-vgb。

利用BglII和HindIII雙酶切質粒pET-vgb，回收含T7啟動子和vgb基因的DNA片段。用BamHI和HindIII雙酶切質粒pET-glyA，用T4 DNA Ligase將它與含vgb基因和T7啟動子的DNA片段連接，得到共表達SHMT和VHb重組質粒pET-SV。

將質粒pET-28a、重組質粒pET-glyA及pET-SV轉化宿主菌，得到對照菌株BL21（DE3）/pET-28a，單表達SHMT工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA及共表達SHMT和VHb工程菌株 BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV。

1.3.3 菌株生長測定

挑取單表達SHMT工程菌株及共表達SHMT和VHb工程菌株單菌落，分別接種于LB培養基中，在37 ℃培養10 h后，轉接于LB和LBG培養基中，在37 ℃、200 r/min繼續培養，定時取測定菌密度。

1.3.4 工程菌誘導表達SHMT

1.3.5 SHMT表達水平及酶活力測定

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 ptsG基因敲除

以PptsGA上和PptsGB下為引物，以對照菌株和從氯霉平板上長出的轉化子基因組作模板進行PCR擴增，PCR擴增產物為2 400 bp和2 030 bp，分別與對照菌株和ptsG基因缺失的氯霉抗性轉化子預計擴增產物大小一致，且后者與進行ptsG基因缺失的兩同源臂及氯霉抗性基因三片段拼接產物大小一致（圖1），表明用于ptsG基因缺失片段已整合進大腸桿菌BL21（DE3）基因組，并替換掉其基因組中兩同源臂之間的序列。

圖 1 PCR鑒定ptsG基因缺失菌株BL21（DE3）ΔptsGFig. 1 Identification of the ptsG-deleted strain BL21(DE3)ΔptsG by PCR

2.2 重組載體與工程菌株的構建

質粒pET-glyA和pET-vgb構建過程見圖2。用NcoI和BamHI雙酶切鑒定構建的重組載體pET-glyA和pET-vgb。酶切pET-glyA產生兩條帶，其中大片段與pET-28a單酶切質粒大小一致，小片段約為1 250 bp，與含有T7啟動子和glyA基因的DNA片段大小相符（圖3）。酶切重組 pET-vgb質粒產生兩條片段，大片段與pET-28a質粒大小一致，小片段與vgb基因大小一致（圖4）。序列測定進一步證實，重組載體pET-glyA和pET-vgb構建成功。

從構建的共表達重組載體pET-SV的菌株中提取質粒，以PVHb上和PVHb下為引物進行PCR擴增，結果見圖5，擴增片段與預期大小458 bp一致。序列測定進一步證實，共表達SHMT和VHb的重組載體pET-SV構建成功。

圖 2 重組質粒的構建Fig. 2 Construction of recombinant plasmids

圖 3 酶切鑒定重組質粒pET-glyAFig. 3 Identification of recombinant plasmid pET-glyA by enzymedigestion

圖 4 酶切鑒定重組質粒pET-vgbFig. 4 Identification of recombinant plasmid pET-vgb by enzyme digestion

圖 5 PCR擴增vgb基因Fig. 5 PCR amplification products of vgb gene

將質粒pET-28a、重組質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）及BL21（DE3）ΔptsG，得到對照菌株BL21（DE3）/pET-28a、單表達SHMT工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA及共表達SHMT和VHb工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV。

2.3 重組菌株生長曲線

圖 6 BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和 BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV在LB培養基中的生長曲線Fig. 6 Growth curve of BL21(DE3)/pET-glyA, BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA and BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV in LB medium

將BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV 3 種菌株，分別在LB和LBG培養基中37 ℃培養，每隔2 h取測OD600nm值，繪制生長曲線。從圖6可知，在沒有葡萄糖的LB培養基中，BL21（DE3）/pET-glyA和BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA兩種菌株生長情況相差不大，但BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV菌株在穩定期的OD600nm值比BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.3%，比BL21（DE3）/pETglyA提高了25.5%，表明vgb基因的引入可以促進菌體生長，提高菌體生長密度。

在含有葡萄糖的L B G 培養基中， 穩定期 BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA菌株OD600nm比BL21（DE3）/ pET-gly提高了19.4%，BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV菌株OD600nm值比BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.5%（圖7），表明ptsG基因缺失可以增加菌株在含葡萄糖的培養基中生長，過表達VHb能進一步提高菌株生長量。

圖 7 BL21（DE3）/pET-glyA、BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和 BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV在LBG培養基中的生長曲線Fig. 7 Growth curve of BL21(DE3)/pET-glyA, BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA and BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV in LBG medium

2.4 工程菌株的誘導表達及酶活力分析

圖 8 工程菌表達SHMT和VHb的SDS-PAGE分析Fig. 8 SDS-PAGE analysis of protein expression in recombinant strains

對誘導后的菌體全細胞進行SDS-PAGE，結果見圖8。工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA和BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA在分子質量47 kDa處有蛋白表達條帶，大小與SHMT相符。工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pETvgb在分子質量15.7 kDa處有蛋白表達條帶，大小與VHb一致。工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV在分子質量47 kDa和15.7 kDa處均有蛋白表達條帶，產物大小分別與SHMT和VHb一致。上述結果表明，SHMT和VHb在攜帶它們相應編碼基因glyA和vgb的工程菌株中均得到表達。

經IPTG誘導后，測定菌株產SHMT活力，對照菌株BL21（DE3）/pET-28a、工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA、 BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和共表達工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV的SHMT活力分別為30.6、195.8、235.6 U/mL和293.8 U/mL。相比對照菌株，兩種單表達基因工程菌株SHMT活力分別提高了6.4 倍和 7.7 倍；共表達基因工程菌株的SHMT活力提高了9.6 倍。因，ptsG基因的敲除能夠增加工程菌株在含葡萄糖培養基中SHMT的表達量，共表達VHb能進一步提高菌株SHMT產量。

3 討 論

本研究利用Red同源重組技術敲除大腸桿菌ptsG基因。由于ptsG基因編碼的酶EIICBGlc主要在大腸桿菌葡萄糖的跨膜轉運中起作用[18-19]，故在沒有葡萄糖的LB培養基中，ptsG基因缺失菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA和菌株BL21（DE3）/pET-glyA生長情況差別不明顯。在含有葡萄糖的LBG培養基中，敲除了ptsG基因的菌株對葡萄糖吸收速率降低，細胞代謝產物乙酸產生少，減少了乙酸對菌體生長的影響，同時由于菌株仍然能夠利用PTS途徑中的EIIMan等運輸體轉運葡萄糖[20,25]，并利用磷酸烯醇式丙酮酸提供磷酸基團對葡萄糖磷酸化，故ptsG基因缺失工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA比工程菌株BL21（DE3）/pET-glyA在穩定期OD600nm提高了19.4%，并且菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA產SHMT活力比菌株BL21（DE3）/pET-glyA提高了20.3%。

菌體生物量和外源蛋白表達量往往受到發酵液溶解氧水平的影響。VHb能加快大腸桿菌胞內三羧酸循環進程，提高菌體對乙酰輔酶A的消耗速度，進而在一方面能夠促進菌體生物量的增加，另一方面可以抑制乙酸等代謝副產物的生成[26]。本研究表明，在不含葡萄糖或含葡萄糖的LB培養基中，共表達VHb均能夠提高菌株的生物量。在沒有葡萄糖的LB培養基中，共表達VHb工程菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV在穩定期的OD600nm值比菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA提高了21.3%；在含有葡萄糖的LBG培養基中，菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-SV 的OD600nm值比菌株BL21（DE3）ΔptsG/pET-glyA提高了21.5%，并且產SHMT活力比菌株BL21（DE3） ΔptsG/pET-glyA提高了24.7%。

為實現重組蛋白高效生產，高細胞密度培養技術至關重要，得到高密度菌體是提高重組蛋白的前提。在厭氧或供氧不足條件下，大腸桿菌發酵產生乙酸，另外，當大腸桿菌生長的培養基含葡萄糖過多，即使在溶氧充足情況下，也可以產生乙酸[27]。高濃度乙酸會降低菌體生長速率和生物量，從而導致外源蛋白產量降低。目前，在發酵工藝上主要通過控制葡萄糖補料速率，減少大腸桿菌發酵過程中乙酸的生成[28-29]。這種方法能限制大腸桿菌發酵中乙酸積累，但發酵工藝復雜。本研究構建的ptsG缺失菌株，由于葡萄糖的吸收速率降低，可以避免使用復雜的發酵控制工藝，使菌體產乙酸得到控制，在生產中具有優勢。溶氧不足也常會成為大腸桿菌高密度發酵的限制因，雖然在發酵過程中可以通過增加通氣量、加大攪拌速率提高發酵液溶氧水平，但在菌體發酵密度達到一定量時，這些手段的效果會降低。VHb具有高的氧吸附和解離速率常數[10]，可以增加菌株氧利用效率，減少菌株乙酸生成，促進菌體生長，縮短發酵周期，因，構建的共表達VHb工程菌株可提高大腸桿菌對氧的利用和對低溶氧環境的耐受能力，在SHMT高密度發酵產生中將會更加有利。

本研究構建的ptsG基因缺失工程菌株及共表達VHb工程菌株在發酵罐中的生長特性及SHMT表達水平有待進一步分析，期望能夠簡化發酵工藝操作，提高SHMT生產水平，降低L-絲氨酸生產成本。