利用Illumina MiSeq測序分析手筑茯磚茶 發酵及干燥階段真菌群落多樣性

陳夢娟，蔣立文,2,，徐元昊，周紅麗,2，周 輝,2

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

安化茯磚茶是我國一種獨具特色的后發酵茶，也是湖南安化縣的地理標志性產品[1-2]。其成品呈黑褐色、香氣沁心，“金花”濃密，而茶湯濃郁清透，甘而不澀。隨著學者對茯磚茶研究的不斷深入，發現茯磚茶不僅含有豐富的茶類功能性成分，諸如多酚、多糖和氨基 酸等[3-4]，其獨特的“金花”還具有調節脂代謝、腸道微生物、抗炎防癌等功效[5-8]，因而受到人們極大的關注。

目前對茯磚茶中微生物的相關研究主要集中于優勢菌種的分離與鑒定[9-10]、優勢菌種代謝物的生理活性研究[11-12]及生產中某階段微生物菌群結構的研究等，但是對生產全過程中微生物菌群結構變化的研究較少。近年來，基于分子生物學技術的不斷發展，對茯磚茶中微生物多性的探索已逐漸深入化、全面化。Xu Aiqing等[13]采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）法對原料、發酵及貯藏中的茶進行真菌多性分析，發現了8 個屬，而散囊菌屬（Eurotium）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）和曲霉屬（Aspergillus）是茯磚茶發酵過程中的優勢菌屬。劉石泉等[14]對發花階段茯磚茶中的真菌進行18S rDNA區擴增并采用DGGE技術分析，發現發花過程前期與后期優勢菌群有明顯差異，并檢測到32 株真菌，包括好干性酵母（Wallemia sebi、Wallemia muriae）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、假絲酵母菌（Candida sp.）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）、曲霉（Aspergillus penicillioides）等。隨著高通量技術的發展和運用，越來越多的研究者也將其運用于茯磚茶微生物群落結構的研究，相較于PCR-DGGE法所得的結果，Illumina MiSeq測序所得結果能更準確反映出菌群結構及動態變化。趙仁亮等[15]采用MiSeq技術對不同產地茯磚茶中細菌和真菌多性進行分析發現，湖南產區加工的茯磚茶中曲霉屬是優勢菌種且相對豐度高于90%，其次是Trichocomaceae unclassified、Eurotiomycetes unclassified和Eurotiales unclassified。Li Qin等[16]采用Illumina MiSeq測序技術研究了產自湖南益陽的機壓茯磚茶品中的微生物菌群變化，結果表明發酵前3 d相對豐度較高的是曲霉屬、Cyberlindnera和念珠菌屬（Candida），3～22 d的品中曲霉屬為絕對優勢菌種。

茯磚茶按照現有工藝分為兩類，即機壓茯磚茶和手筑茯磚茶兩類，前者采用機械自動成型，后者茶葉經汽蒸軟化后人工成型，兩者由于成型工藝不同有所差異。本實驗中的毛茶原料產自湖南安化，原料中加入12%的茶汁，梗的比例約為8%，然后進行2 次汽蒸軟化（105 ℃汽蒸，攪拌20 s），再渥堆發酵14～16 h。在筑制之前測定茶葉的水分，并用105 ℃蒸汽蒸制茶筑10 s，手筑成磚時茶磚中水分約為26%。然后將手筑并包裝后的茶磚置于發酵房（相對濕度70%～75%）28 ℃發酵10～15 d，以2.5 ℃/d的速率緩慢升溫10 d進行干燥制成成品。本實驗采用Illumina MiSeq技術[17]對“控溫發酵及升溫干燥一條龍”的手筑茯磚茶中真菌菌群結構變化進行研究，以期為合理調控加工進程、揭示微生物的作用機理及構建產品安全保障體系的研究提供一定的參考依據[18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.2 試劑

Pusion Hot start flex 2X Master Mix 上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000 DNA Maker 寶日醫生物技術（北京）有限公司；Gene colour 北京金博益生物技術有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 美國Invitrogen Life Technologies公司；瓊脂糖G-10 西班牙Biowest 公司；50h TAE Buffer 生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPrep PCR Cleanup Kit 美國Axygen公司；Soil DNA Kit 美國OMEGA BioTek公司。

1.2 儀器與設備

5424型常溫離心機 德國Eppendorf Centrifuge公司；Microfuge 22R型冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；WH-861型旋渦振蕩儀 太倉市華利達實驗設備有限公司；DK-8D型三溫三控恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司；A200型PCR儀 杭州朗基科學儀器有限公司；MiSeq pe300測序儀 美國Illumina公司；Tanon-2500型電泳儀、凝膠成像儀 上海天能公司；DW-HL388型超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴增和ITS 2測序

1.3.2 數據分析

2 結果與分析

2.1 測序數據優化及統計

表 1 有效數據統計Table 1 Statistic analysis of effective data

為提高后續分析質量和可靠性，對原始下機數據進行雙端拼接、質量控制、嵌合體過濾后，統計有效數據得到表1。可以看出，本次測序質量值較高，6 組品中有效Tags數均在35 000 條以上，并且數據質量≥Q20和≥Q30的數據比例高，所有品的測序數據都已達到后續分析的要求。

2.2 OTU統計及分類學分析

按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，并繪制出Venn圖（圖1）。根據對有效數據進行聚類總共得到186 個OTU，圖1a 4 組品中OTU數目分別為172、115、96和48，而共有OTU僅38 個。圖1b 3 組品的OTU數量相近，且共有的OTU數為30 個。根據統計這兩個階段品中OTU數目可以發現，放入控溫室后物種的數量總體呈現出下降的趨勢。

圖 1 OTU分布Venn圖Fig. 1 Venn diagram of OTU distribution

圖 2 稀釋性曲線Fig. 2 Rarefaction curves

表 2 發酵及干燥階段真菌群落多樣性指數 Table 2 Diversity indexes of fungal community during fermentation and drying

2.4 發酵及干燥過程中組間真菌群落結構差異性分析

圖 3 主坐標分析Fig. 3 Principal coordinate analysis

表 3 Anosim分析結果Table 3 Results of Anosim analysis

2.5 物種注釋及分類統計

根據測序結果及物種注釋結果，在門和屬兩個水平上對物種組成進行統計分析并構建對應的豐度。本實驗共注釋到5 個門、14 個綱、29 個目、47 個科、65 個屬，選取豐度最高的20 個物種分類進行真菌菌群結構及豐度變化分析。

圖 4 門分類水平上的相對豐度Fig. 4 Relative abundance at the phylum level

由圖4可知，在門分類水平上，發酵及干燥過程中共注釋到3 個門的真核微生物，1 個未知分類地位的Fungi unclassified及1 個無法確認分類學信息的unidentified。3 個門類分別是子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）。其中子囊菌門在這6 組品中占絕對優勢，在Fj_0 d、Fj_4 d、Fj_8 d、Fj_12 d、Gz_17 d及Gz_22 d中的豐度依次是89.12%、99.32%、99.74%、99.98%、99.88%和99.89%。其次是擔子菌門及接合菌門，但這兩個門類在6 組品中的相對豐度較低。

圖 5 屬分類水平上的相對豐度Fig. 5 Relative abundance at the genus level

由圖5 所示，在屬分類水平上，明確注釋到分類地位的有1 5 個屬，還有1 個無法確認分類學信息的unidentified及4 個未知分類地位（Ascomycota unclassified、Saccharomycetales unclassified、Hypocreales incertae sedis unclassified、Pleosporales unclassified）。在0 d時，真菌的多性最高，其中相對豐度最高的是曲霉屬（Aspergillus），達40.59%。其次是德巴利酵母屬（Debaryomyces）、散囊菌屬（Eurotium）和青霉屬（Penicillium），相對豐度分別為17.26%、9.02%、8.55%。在4 d時，手筑茯磚茶中散囊菌屬的相對豐度上升至97.27%，而其他屬相對豐度的總和已降至3%以下，并且在手筑茯磚茶發酵的中后期（8、12 d）及干燥階段（17、22 d）的品中，相對豐度最高的菌屬均為散囊菌屬，分別為97.94%、99.85%、99.51%及99.50%。

圖 6 屬分類水平上熱圖分析Fig. 6 Heatmap analysis at the genus level

3 討 論

茯磚茶生產過程中有多種微生物參與，但因以前的研究側重點在茶中的優勢菌種，并且研究的方法和檢測技術受到限制，因對微生物的多性及其作用機制研究較少。隨著高通量測序技術的出現及更新，使發酵茶領域的微生物多性研究取得了巨大的進展[27-29]，從而得到發酵茶中更加全面和準確的菌群結構信息。本實驗采用高通量測序技術對手筑茯磚茶生產過程中真菌多性及分類學概況進行了研究，在6 組品中共得到990 522 個有效Tags，并注釋到5 個門、14 個綱、29 個目、47 個科、65 個屬。與趙仁亮[15]及Li Qin[16]等的研究結果不同，根據其文獻中注釋結果發現茯磚茶成品中曲霉屬為優勢菌屬，并且在屬的類別及數量上與本實驗結果存在較明顯的差異，推測差異的原因可能與加工工藝及生產環境相關。而與胡治遠[2]采用的傳統分離鑒定及18S rDNA測序技術和文宇杰[30]所采用的PCR-DGGE技術相比，Illumina MiSeq技術所檢測到的微生物種類及相對豐度信息更加全面、準確，為后續研究提供了更多的數據依據。

研究也發現，在手筑茯磚生產過程中，發酵過程中微生物主要來源于毛茶及茶梗本身帶入，也可能是生產環境中帶入，在恒溫控濕發酵過程中，散囊菌屬一開始就占據比較高的比例，盡管其他微生物也存在，但包裝后創造相對密封條件微生物之間相互拮抗、相互協調創造了必要環境[33-34]，微生物群屬也會發生相應變化，而緩慢升溫干燥水分減少為微生物“適者生存”提供了外部條件，這些相互影響因值得以后研究中進一步探索。

由于目前對冠突散囊菌具體特征屬性物質的研究還不多，它是否屬于散囊菌屬也還存在一些爭議，而實驗結果中高表達豐度的散囊菌屬，其具體的種以及涉及的功能，還有待進一步研究分析。因后續實驗將利用蛋白組學、代謝組學等[35-37]技術對手筑茯磚茶中微生物間的相互作用、特征性物質種類的鑒定及特殊風味物質形成的機理進行進一步深入分析。