利用Illumina MiSeq測序分析手筑茯磚茶 發(fā)酵及干燥階段真菌群落多樣性

陳夢娟，蔣立文,2,，徐元昊，周紅麗,2，周 輝,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

安化茯磚茶是我國一種獨具特色的后發(fā)酵茶，也是湖南安化縣的地理標志性產(chǎn)品[1-2]。其成品呈黑褐色、香氣沁心，“金花”濃密，而茶湯濃郁清透，甘而不澀。隨著學者對茯磚茶研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)茯磚茶不僅含有豐富的茶類功能性成分，諸如多酚、多糖和氨基 酸等[3-4]，其獨特的“金花”還具有調(diào)節(jié)脂代謝、腸道微生物、抗炎防癌等功效[5-8]，因而受到人們極大的關注。

目前對茯磚茶中微生物的相關研究主要集中于優(yōu)勢菌種的分離與鑒定[9-10]、優(yōu)勢菌種代謝物的生理活性研究[11-12]及生產(chǎn)中某階段微生物菌群結(jié)構的研究等，但是對生產(chǎn)全過程中微生物菌群結(jié)構變化的研究較少。近年來，基于分子生物學技術的不斷發(fā)展，對茯磚茶中微生物多性的探索已逐漸深入化、全面化。Xu Aiqing等[13]采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）法對原料、發(fā)酵及貯藏中的茶進行真菌多性分析，發(fā)現(xiàn)了8 個屬，而散囊菌屬（Eurotium）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）和曲霉屬（Aspergillus）是茯磚茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬。劉石泉等[14]對發(fā)花階段茯磚茶中的真菌進行18S rDNA區(qū)擴增并采用DGGE技術分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)花過程前期與后期優(yōu)勢菌群有明顯差異，并檢測到32 株真菌，包括好干性酵母（Wallemia sebi、Wallemia muriae）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、假絲酵母菌（Candida sp.）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）、曲霉（Aspergillus penicillioides）等。隨著高通量技術的發(fā)展和運用，越來越多的研究者也將其運用于茯磚茶微生物群落結(jié)構的研究，相較于PCR-DGGE法所得的結(jié)果，Illumina MiSeq測序所得結(jié)果能更準確反映出菌群結(jié)構及動態(tài)變化。趙仁亮等[15]采用MiSeq技術對不同產(chǎn)地茯磚茶中細菌和真菌多性進行分析發(fā)現(xiàn)，湖南產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中曲霉屬是優(yōu)勢菌種且相對豐度高于90%，其次是Trichocomaceae unclassified、Eurotiomycetes unclassified和Eurotiales unclassified。Li Qin等[16]采用Illumina MiSeq測序技術研究了產(chǎn)自湖南益陽的機壓茯磚茶品中的微生物菌群變化，結(jié)果表明發(fā)酵前3 d相對豐度較高的是曲霉屬、Cyberlindnera和念珠菌屬（Candida），3～22 d的品中曲霉屬為絕對優(yōu)勢菌種。

茯磚茶按照現(xiàn)有工藝分為兩類，即機壓茯磚茶和手筑茯磚茶兩類，前者采用機械自動成型，后者茶葉經(jīng)汽蒸軟化后人工成型，兩者由于成型工藝不同有所差異。本實驗中的毛茶原料產(chǎn)自湖南安化，原料中加入12%的茶汁，梗的比例約為8%，然后進行2 次汽蒸軟化（105 ℃汽蒸，攪拌20 s），再渥堆發(fā)酵14～16 h。在筑制之前測定茶葉的水分，并用105 ℃蒸汽蒸制茶筑10 s，手筑成磚時茶磚中水分約為26%。然后將手筑并包裝后的茶磚置于發(fā)酵房（相對濕度70%～75%）28 ℃發(fā)酵10～15 d，以2.5 ℃/d的速率緩慢升溫10 d進行干燥制成成品。本實驗采用Illumina MiSeq技術[17]對“控溫發(fā)酵及升溫干燥一條龍”的手筑茯磚茶中真菌菌群結(jié)構變化進行研究，以期為合理調(diào)控加工進程、揭示微生物的作用機理及構建產(chǎn)品安全保障體系的研究提供一定的參考依據(jù)[18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.2 試劑

Pusion Hot start flex 2X Master Mix 上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000 DNA Maker 寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；Gene colour 北京金博益生物技術有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 美國Invitrogen Life Technologies公司；瓊脂糖G-10 西班牙Biowest 公司；50h TAE Buffer 生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPrep PCR Cleanup Kit 美國Axygen公司；Soil DNA Kit 美國OMEGA BioTek公司。

1.2 儀器與設備

5424型常溫離心機 德國Eppendorf Centrifuge公司；Microfuge 22R型冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；WH-861型旋渦振蕩儀 太倉市華利達實驗設備有限公司；DK-8D型三溫三控恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；A200型PCR儀 杭州朗基科學儀器有限公司；MiSeq pe300測序儀 美國Illumina公司；Tanon-2500型電泳儀、凝膠成像儀 上海天能公司；DW-HL388型超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴增和ITS 2測序

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)優(yōu)化及統(tǒng)計

表 1 有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Statistic analysis of effective data

為提高后續(xù)分析質(zhì)量和可靠性，對原始下機數(shù)據(jù)進行雙端拼接、質(zhì)量控制、嵌合體過濾后，統(tǒng)計有效數(shù)據(jù)得到表1。可以看出，本次測序質(zhì)量值較高，6 組品中有效Tags數(shù)均在35 000 條以上，并且數(shù)據(jù)質(zhì)量≥Q20和≥Q30的數(shù)據(jù)比例高，所有品的測序數(shù)據(jù)都已達到后續(xù)分析的要求。

2.2 OTU統(tǒng)計及分類學分析

按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，并繪制出Venn圖（圖1）。根據(jù)對有效數(shù)據(jù)進行聚類總共得到186 個OTU，圖1a 4 組品中OTU數(shù)目分別為172、115、96和48，而共有OTU僅38 個。圖1b 3 組品的OTU數(shù)量相近，且共有的OTU數(shù)為30 個。根據(jù)統(tǒng)計這兩個階段品中OTU數(shù)目可以發(fā)現(xiàn)，放入控溫室后物種的數(shù)量總體呈現(xiàn)出下降的趨勢。

圖 1 OTU分布Venn圖Fig. 1 Venn diagram of OTU distribution

圖 2 稀釋性曲線Fig. 2 Rarefaction curves

表 2 發(fā)酵及干燥階段真菌群落多樣性指數(shù) Table 2 Diversity indexes of fungal community during fermentation and drying

2.4 發(fā)酵及干燥過程中組間真菌群落結(jié)構差異性分析

圖 3 主坐標分析Fig. 3 Principal coordinate analysis

表 3 Anosim分析結(jié)果Table 3 Results of Anosim analysis

2.5 物種注釋及分類統(tǒng)計

根據(jù)測序結(jié)果及物種注釋結(jié)果，在門和屬兩個水平上對物種組成進行統(tǒng)計分析并構建對應的豐度。本實驗共注釋到5 個門、14 個綱、29 個目、47 個科、65 個屬，選取豐度最高的20 個物種分類進行真菌菌群結(jié)構及豐度變化分析。

圖 4 門分類水平上的相對豐度Fig. 4 Relative abundance at the phylum level

由圖4可知，在門分類水平上，發(fā)酵及干燥過程中共注釋到3 個門的真核微生物，1 個未知分類地位的Fungi unclassified及1 個無法確認分類學信息的unidentified。3 個門類分別是子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）。其中子囊菌門在這6 組品中占絕對優(yōu)勢，在Fj_0 d、Fj_4 d、Fj_8 d、Fj_12 d、Gz_17 d及Gz_22 d中的豐度依次是89.12%、99.32%、99.74%、99.98%、99.88%和99.89%。其次是擔子菌門及接合菌門，但這兩個門類在6 組品中的相對豐度較低。

圖 5 屬分類水平上的相對豐度Fig. 5 Relative abundance at the genus level

由圖5 所示，在屬分類水平上，明確注釋到分類地位的有1 5 個屬，還有1 個無法確認分類學信息的unidentified及4 個未知分類地位（Ascomycota unclassified、Saccharomycetales unclassified、Hypocreales incertae sedis unclassified、Pleosporales unclassified）。在0 d時，真菌的多性最高，其中相對豐度最高的是曲霉屬（Aspergillus），達40.59%。其次是德巴利酵母屬（Debaryomyces）、散囊菌屬（Eurotium）和青霉屬（Penicillium），相對豐度分別為17.26%、9.02%、8.55%。在4 d時，手筑茯磚茶中散囊菌屬的相對豐度上升至97.27%，而其他屬相對豐度的總和已降至3%以下，并且在手筑茯磚茶發(fā)酵的中后期（8、12 d）及干燥階段（17、22 d）的品中，相對豐度最高的菌屬均為散囊菌屬，分別為97.94%、99.85%、99.51%及99.50%。

圖 6 屬分類水平上熱圖分析Fig. 6 Heatmap analysis at the genus level

3 討 論

茯磚茶生產(chǎn)過程中有多種微生物參與，但因以前的研究側(cè)重點在茶中的優(yōu)勢菌種，并且研究的方法和檢測技術受到限制，因?qū)ξ⑸锏亩嘈约捌渥饔脵C制研究較少。隨著高通量測序技術的出現(xiàn)及更新，使發(fā)酵茶領域的微生物多性研究取得了巨大的進展[27-29]，從而得到發(fā)酵茶中更加全面和準確的菌群結(jié)構信息。本實驗采用高通量測序技術對手筑茯磚茶生產(chǎn)過程中真菌多性及分類學概況進行了研究，在6 組品中共得到990 522 個有效Tags，并注釋到5 個門、14 個綱、29 個目、47 個科、65 個屬。與趙仁亮[15]及Li Qin[16]等的研究結(jié)果不同，根據(jù)其文獻中注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)茯磚茶成品中曲霉屬為優(yōu)勢菌屬，并且在屬的類別及數(shù)量上與本實驗結(jié)果存在較明顯的差異，推測差異的原因可能與加工工藝及生產(chǎn)環(huán)境相關。而與胡治遠[2]采用的傳統(tǒng)分離鑒定及18S rDNA測序技術和文宇杰[30]所采用的PCR-DGGE技術相比，Illumina MiSeq技術所檢測到的微生物種類及相對豐度信息更加全面、準確，為后續(xù)研究提供了更多的數(shù)據(jù)依據(jù)。

研究也發(fā)現(xiàn)，在手筑茯磚生產(chǎn)過程中，發(fā)酵過程中微生物主要來源于毛茶及茶梗本身帶入，也可能是生產(chǎn)環(huán)境中帶入，在恒溫控濕發(fā)酵過程中，散囊菌屬一開始就占據(jù)比較高的比例，盡管其他微生物也存在，但包裝后創(chuàng)造相對密封條件微生物之間相互拮抗、相互協(xié)調(diào)創(chuàng)造了必要環(huán)境[33-34]，微生物群屬也會發(fā)生相應變化，而緩慢升溫干燥水分減少為微生物“適者生存”提供了外部條件，這些相互影響因值得以后研究中進一步探索。

由于目前對冠突散囊菌具體特征屬性物質(zhì)的研究還不多，它是否屬于散囊菌屬也還存在一些爭議，而實驗結(jié)果中高表達豐度的散囊菌屬，其具體的種以及涉及的功能，還有待進一步研究分析。因后續(xù)實驗將利用蛋白組學、代謝組學等[35-37]技術對手筑茯磚茶中微生物間的相互作用、特征性物質(zhì)種類的鑒定及特殊風味物質(zhì)形成的機理進行進一步深入分析。