熱預處理對藍蛤酶解及酶解液呈味特性的影響

李學鵬，劉晏瑋，謝曉霞，朱文慧，勵建榮,，張玉玉，李婷婷，于建洋，牟偉麗

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；2.北京工商大學食品學院，北京 100048；3.大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600；4.榮成泰祥食品股份有限公司，山東 榮成 264300；5.蓬萊京魯漁業有限公司，山東 煙臺 265600）

藍蛤（Aloididae aloidi）又名“海沙子”、“小白蛤”、“納米蛤蜊”等，是我國沿海的一種低值海洋貝類[1]。由于個體小、出肉率低，藍蛤資源并未得到充分利用，通常被用作對蝦活餌料或以鮮食為主。藍蛤營養豐富、鮮美可口，除含有豐富的優質蛋白和均衡的氨基酸外，還具有核苷酸、有機酸、牛磺酸等多種呈味物質和生理活性物質。與其他貝類相比，藍蛤中丙氨酸含量居于貝類之首，具有保健功能的十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和十碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量也遠高于貽貝和牡蠣[2]，因是開發天然功能性海鮮調味料的理想原料。

蛋白質酶解技術具有條件溫和、無有害物質產生和能提高營養、功能和免疫特性的優點[3-4]。近年來，利用酶解技術進行貝類蛋白資源的開發受到了廣泛關注。采用蛋白酶水解蛋白質，釋放出多肽、游離氨基酸、核苷酸等多種呈味物質，可以達到提高低值貝類附加值、增強貝類風味特性的目的。加熱作為一種底物預處理方式可以解決目前傳統酶解存在的時間長、效率低、風味不足等問題[5]。酶解前對蛋白質進行熱預處理可以導致蛋白質變性，伴隨著蛋白質構象的改變暴露出可能隱藏的酶切位點，使得蛋白質更易被酶解，提高酶解效率[6]。同時，加熱處理通常伴隨著美拉德反應、脂質氧化等熱反應的發生，往往使許多風味前體物質發生降解并相互反應形成多種揮發性化合物，影響呈味物質的含量[7]。Pan Adan等[8]研究發現，蓮子蛋白酶解前60 ℃熱處理60 min可加速酶解過程，Kong Haocun等[9]發現熱預處理可以提高高濃度顆粒狀玉米淀粉的酶促水解作用，Calkin等[10]發現加熱溫度和時間對風味特征具有重要的影響。水產品蛋白質酶解前通常也會進行適當的加熱處理，主要原因是水解過程耗時較長，熱預處理可以防止酶解液發生腐敗。劉海梅等[11]在牡蠣酶解前進行了30 min的沸水浴熱處理，王珊珊等[12]在太平洋鱈魚排酶解前采用121 ℃進行了高溫熱處理。但目前，不同熱預處理溫度和時間對水產類蛋白質的酶解特性以及對酶解物呈味物質的影響仍鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活藍蛤，購于錦州市林西街水產市場。

復合蛋白酶（1.5 AU/g）、中性蛋白酶（0.8 AU/g）、 堿性蛋白酶（2.4 AU/g）、風味蛋白酶（500 LAPU/g）（均為食品級） 諾維信（中國）生物技術有限公司；木瓜蛋白酶 安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉標準滴定液 天津市光復精細化工研究所；甲醛 遼寧泉瑞試劑有限公司；甲醇（色純） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；核苷酸標準品（5’-鳥苷酸（5’-AMP）、5’-肌苷酸（5’-GMP）、5’-腺苷酸（5’-IMP）） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷氨酸試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

TH2-82A水浴恒溫振蕩器 常州金壇良友儀器有限公司；MJ-BL25B3攪拌機 廣東佛山美的有限公司；Biofuge?Stratos臺式高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司； FE20-FiveEasy Plus pH計 梅特勒-托利多儀器有限 公司；1260高效液相色儀 美國Agilent公司；TS-5000Z系列智能味覺分析系統 日本Insent公司；CR-400色差儀 柯尼卡美能達公司。

1.3 方法

將吐沙干凈后的新鮮藍蛤開殼、取肉并打漿，獲得的藍蛤肉勻漿品放入蒸煮袋中并置于40 ℃冰箱備用，在每次實驗之前用流水解凍適量的藍蛤肉勻漿品。

1.3.1.1 單酶酶解實驗

1.3.1.2 雙酶復配酶解實驗

1.3.2 水解度的測定

式中：總氮含量采用GB 5009.5ü 2016《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法[14]測定；氨基酸態氮含量采用GB 5009.235ü 2016《食品中氨基酸態氮的測定》[15]測定。

1.3.3 TCA-可溶性肽含量的測定

參照朱均旺等[16]的方法并作適當修改。取5 mL酶解液，加入等體積質量分數15%的三氯乙酸溶液，靜置30 min，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，采用雙縮脲法，在540 nm波長處測定吸光度。根據標準曲線 y＝0.045 9x0.000 3，R2＝0.999 8，得出可溶性肽的含量。

1.3.4 電子舌測定分析

取酶解液30 mL加蒸餾水稀釋至90 mL，倒入電子舌專用杯中，等待溫度恢復至室溫時開始電子舌測試。每個品設置測4 次，為保證結果的穩定性，刪除第1次，取后3 次的測量結果進行分析。測試前需對電子舌進行自檢、校準和診斷等步驟，保證數據的穩定性和可靠性。

1.3.5 5’-呈味核苷酸的測定

1.3.6 谷氨酸的測定

采用紫外比色法和南京建成生物工程研究所的谷氨酸試劑盒進行測定。

1.3.7 酶解液色澤測定

將體積相等的酶解液裝入9 cmh 13 cm的蒸煮袋中，使用色差計分別測定L*、a*、b*值，每個品測定6 次，結果取其平均值。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同種類蛋白酶對藍蛤水解度、酶解液可溶性肽質量濃度及滋味特性的影響

圖 1 不同種類蛋白酶對藍蛤水解度、可溶性肽質量濃度的影響Fig. 1 Effects of different proteases on the degree of hydrolysis and soluble peptide concentration of A. aloidi hydrolysates

由圖1可知，不同種類蛋白酶對藍蛤蛋白的酶解效果不同，不同蛋白酶解液的水解度和可溶性肽含量從高到低依次是堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶。這種差異主要是由蛋白酶酶切位點的特異性引起的。堿性蛋白酶主要作用于亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸等多種氨基酸的肽鍵[17]。木瓜蛋白酶是一種內肽酶，屬巰基蛋白酶，作用位點廣泛，其水解程度高于兼具內切酶和外切酶的復合蛋白酶。風味蛋白酶的水解度最低，可能由于它是外切蛋白酶，只能作用于肽鏈末端肽鍵，將氨基端的氨基酸水解為游離氨基酸。

從圖2可以看出，苦味、鮮味、豐富性的味覺值較高，是影響酶解液的主要味覺指標。各酶解液的鮮味差異不大。酶解液的苦味主要來自于疏水性氨基酸和苦味肽，肽的疏水性是影響苦味強度的重要因[18]。堿性蛋白酶水解液苦味值最高，為10.53。這可能是因為酶切位點的不同，堿性蛋白酶水解蛋白質后容易釋放出含有疏水性氨基酸（亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸）的多肽鏈，獲得的酶解液表現為較強的苦味。風味蛋白酶的苦味最弱，主要原因是風味蛋白酶為外切酶，可以切斷苦味肽末端的疏水性氨基酸降低苦味，這與都榮強等[17]的研究結果相同。其他3 種蛋白酶的苦味值高于風味蛋白酶，主要是因為這3 種蛋白酶為內切蛋白酶，較易生成苦味強度不同的苦味肽。豐富性可以反映酶解液口感飽滿、協調程度，豐富性的強弱主要與水解液中可溶性肽、多肽、游離氨基酸、各呈味物質的含量等密切 相關[19]。堿性蛋白酶解液豐富性最強。雖然風味蛋白酶解液的水解度和可溶性肽含量最低，但豐富性適中，可能是因各呈味物質之間協同、配比合適，整體增強了酶解液在口腔中的醇厚感。

圖 2 不同種類蛋白酶解液的主要味覺值雷達圖Fig. 2 Radar plot of main taste values of hydrolysates produced by different proteases

2.2 雙酶組合酶解對藍蛤水解度、酶解液可溶性肽質量濃度及滋味特性的影響

圖 3 2 種蛋白酶組合酶解對藍蛤水解度、可溶性肽質量濃度的影響Fig. 3 Effects of combinations of two proteases on the hydrolysis degree and soluble peptide concentration of A. aloidi hydrolysates

由圖3可知，采用組合酶解的方式可以提高藍蛤水解度和酶解液可溶性肽含量，即水解度達到39%，可溶性肽質量濃度達到21 mg/mL以上。這是因為采用內切酶與外切酶共同作用的方式，可以切斷肽鏈內部和末端肽鍵，提高蛋白質水解效率。采用組合酶解的方式，可以實現資源的最大化利用，實用性強。但不同的蛋白原料種類、組成及含量的差異，組合酶解后效果也不盡相同。以藍蛤蛋白為原料，堿性蛋白酶與風味蛋白酶組合酶解水解度最大，可溶性肽含量最多。而木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶與風味蛋白酶組合時，水解程度差異不顯著。可能是蛋白酶的作用方式和酶切位點的有限性造成的。研究表明，酶解產物組成的差異會使得酶解液呈現不同風味 特征[20]。采用電子舌分析組合酶解后酶解液的呈味特性可以發現（圖4），中性蛋白酶與風味蛋白酶組合使用，苦味值最低，豐富性高于木瓜蛋白酶、復合蛋白酶與風味蛋白酶組合，可能與釋放的可溶性肽含量有關。

圖 4 2 種蛋白酶組合酶解液主要味覺值雷達圖Fig. 4 Radar plot of main taste values of hydrolysates produced by combinations of two proteases

綜合水解度、可溶性肽、味覺值的苦味、豐富性指標，選擇質量比2∶1的中性蛋白酶與風味蛋白酶組合為后續實驗的蛋白酶。

2.3 熱預處理溫度對藍蛤酶解特性及呈味物質的影響

2.3.1 熱預處理溫度對藍蛤水解度、酶解液可溶性肽質量濃度的影響

圖 5 熱預處理溫度對藍蛤水解度、可溶性肽質量濃度的影響Fig. 5 Effects of different heating temperatures on the degree of hydrolysis and soluble peptide concentration of A. aloidi hydrolysates

由圖5可知，隨著預處理溫度的升高，水解度、可溶性肽均呈現出逐漸下降后略有上升的變化規律。這可能與內源酶的活力、蛋白質的變性程度有關。對照組水解度最大，主要原因可能是藍蛤肌肉與消化腺內含有豐富的酶類，內源酶與外加蛋白酶協同發揮作用，促進了蛋白質的水解。何思蓮[21]的研究也證明了內源酶對蛋白質的水解有貢獻作用。隨著預處理溫度的升高，水解度逐漸下降，時內源酶逐漸失去作用同時蛋白質發生變性，變性程度不同，蛋白質被水解的程度不同。王博[22]發現菲律賓蛤仔消化腺內源酶的最適溫度為40 ℃，隨溫度升高酶活力下降。李媛等[23]通過測定熱處理后魚蛋白DSC曲線發現，溫度80 ℃時魚蛋白已完全變性。圖5顯示，90 ℃和100 ℃的預處理后，藍蛤肉水解度基本不變。這表明時可能已達到蛋白質完全變性的程度，完全變性的蛋白質會發生高度凝集從而不利于酶解。但當采用121 ℃處理時，水解度和可溶性肽含量均增加，可能原因是高溫高壓處理使藍蛤的蛋白質結構變得松散，有利于蛋白酶作用于肽鍵，促進了酶解。

2.3.2 熱預處理溫度對藍蛤酶解液主要鮮味物質含量的影響

表 1 熱預處理溫度對藍蛤酶解液中主要鮮味物質含量的影響Table1 Effects of different heating temperatures on the concentrations of main umami compounds of hydrolysates

游離氨基酸的存在可以賦予酶解液不同的滋味感受，帶來豐富的口感。谷氨酸是最重要的呈鮮味氨基酸，其含量影響鮮味的程度。由表1可知，對照組中谷氨酸含量最高，達到69.64 mg/100 g。隨著預處理溫度的升高，谷氨酸含量逐漸下降，90 ℃和100 ℃兩個處理組之間無顯著性變化，121 ℃處理時又略有上升。這與水解度的趨勢一致。因為游離氨基酸的含量與蛋白質的水解有關，蛋白質的水解會釋放出游離氨基酸，水解程度越大，釋放出游離氨基酸越多。外，加熱還會使谷氨酸發生不同程度的降解，參與生成揮發性化合物的過程。

核苷酸類物質是一類呈味活性物質，它不僅可以與某些氨基酸類物質協同增鮮，同時對總體風味的提升有重要作用。核苷酸類物質的含量主要與原料的種類、新鮮程度、捕撈季節和ATP的降解途徑有關。GMP主要來源于RNA的破壞程度，AMP、IMP是貝類死后ATP分解產生的相關產物。對魚貝類等水產品的研究發現，ATP的分解有兩種途徑[24]，第1種途徑：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，第2種途徑：ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx，一般認為貝類等水產品不生成IMP。但是有研究證明波紋巴菲蛤[25]、冰藏牡蠣中都含有IMP。劉亞等[26]研究證明，馬氏珠母貝同時存在兩種降解途徑。表1中，不加熱處理下同時檢測出了IMP和AMP，且AMP的含量顯著高于IMP，因推論出藍蛤體內ATP的降解可能主要以第2種途徑為主，第1種途徑為輔。比較3 種核苷酸，AMP的含量均高于其他2 種核苷酸。這與張倩等[27]研究四蛤蜊和菲律賓蛤仔中呈味核苷酸的結果相一致。外，不同熱預處理溫度對核苷酸類物質的影響不同。隨著預處理溫度的升高，5’-GMP的含量逐漸增加。主要的原因可能是隨著溫度的升高，RNA更容易被破壞，有利于5’-GMP的釋放[28]。 Dermiki等[29]研究表明5’-GMP在70 ℃的加熱條件下比20 ℃條件下提取的含量多。隨著預處理溫度的升高， 5’-IMP和5’-AMP的含量逐漸減少，90 ℃時預處理后未檢測到5’-IMP。這2 種核苷酸熱穩定性較差且受熱易降解，它們的降解與損失可能與風味化合物的合成有關。尤其是5’-IMP極易損失，它也會在蒸煮過程中轉化為肌苷和次黃嘌呤[30]。121 ℃處理后5’-AMP有所增加，可能是高壓的作用更利于該核苷酸的溶出。

2.3.3 熱預處理溫度對藍蛤酶解液主要呈味特性的影響

圖 6 不同熱預處理溫度下酶解液的主要呈味特性雷達圖Fig. 6 Radar plots of main taste values of hydrolysates produced at different heating temperatures

采用電子舌評價酶解液整體滋味，經前期分析處理，提取出了苦味值、鮮味值和豐富性3 個主要呈味特性作為有效評價指標進行分析。從圖6可以看出，隨著預處理溫度的升高，鮮味逐漸下降后略有上升，對照組鮮味值最大，達8.3。121 ℃熱處理組鮮味值高于90 ℃和100 ℃處理組。這與核苷酸、谷氨酸的變化趨勢基本一致。核苷酸類物質可以與谷氨酸起到協同增鮮的作用，如5’-GMP和谷氨酸鈉混合使用其鮮味程度最高可達到單獨使用谷氨酸鈉的30 倍[31]。Maga[32]研究發現當谷氨酸與肌苷酸1∶1混合時，其味覺鮮度比單獨使用谷氨酸增強了7 倍。Bellisle[33]證明了其協同作用的產生是由于它們與受體蛋白相互結合后，空間構型發生改變而引起的。豐富性與鮮味變化相一致，主要的原因是酶解液口味濃厚或寡淡主要與多種呈味物質關系密切。

分析酶解液的苦味值可知，對照組不加熱處理的苦味重，隨著預處理溫度的升高，苦味逐漸下降。這與蛋白質水解程度有關，對照組蛋白質水解程度大，生成低分子質量苦味肽和疏水性氨基酸的可能性就越大，酶解液中精氨酸、賴氨酸以及苯丙氨酸等游離氨基酸的存在都會導致較重的苦味。但并非水解度的大小與苦味的強弱呈正比關系。肽的苦味也與肽鏈的長度有關。90 ℃和100 ℃處理苦味值增大甚至高于對照組，可能的原因是條件下水解獲得了分子質量適中的高苦味肽。 據報道[34]，分子質量在1.9～3.3 kDa之間的肽段比更大或更小的肽段具有更突出的苦味。

2.3.4 熱預處理溫度對藍蛤酶解液色澤的影響

表 2 熱預處理溫度對藍蛤酶解液色澤的影響Table 2 Effects of different heating temperatures on the color of hydrolysates

色澤對酶解液的感官接受度具有重要的作用，它影響酶解產物的應用范圍。傳統酶解工藝中，通常會采用活性炭、白土等對酶解液進行脫色處理，但通常會造成營養物質的損失。由表2可知，酶解液總體呈現偏黃綠色，這是由蛋白酶決定的。隨著預處理溫度的升高，L*值逐漸增加，亮度逐漸增大，在不加熱和50 ℃熱預處理條件下，酶解液的色澤較暗，出現肉眼可見的棕褐色。70 ℃以上無顯著性變化，時品色澤明亮、澄清透明。貝類肌肉組織中含有與代謝有關的蛋白或酶，如色蛋白、白蛋白和磷酸果糖激酶、醛縮酶等，酶解液顏色的變化可能與這些代謝酶類有關[35]。鄭惠娜等[36]對導致文蛤肌肉水溶性提取物的褐變物質進行研究分析，推測出這些物質可能是一些對熱敏感的酶類物質。

通過分析不同熱預處理溫度下藍蛤酶解液的酶解特性和呈味物質含量可知，隨著預處理溫度的升高，水解度、可溶性肽、呈味物質的含量均呈現下降后略有上升的趨勢，但酶解液的整體滋味和色澤是影響感官接受度的重要指標。因綜合考慮，70 ℃為較佳的熱預處理溫度，時酶解液鮮味、豐富度適中，苦味最低，色澤明亮。

2.4 熱預處理時間對藍蛤酶解特性及其呈味物質的影響

2.4.1 熱預處理時間對藍蛤水解度、酶解液可溶性肽質量濃度的影響

由圖7可知，隨著預處理時間的延長，水解度逐漸下降，但熱處理20 min后水解度基本保持不變。分析原因可能與蛋白質的變性、聚集有關。采用70 ℃的熱預處理溫度已使藍蛤體內的內源酶滅活，不能發揮作用，隨著時間的延長，蛋白質變性、聚集程度增大，預處理20 min后蛋白質處于不可逆聚合狀態，已達到深度變性，各次級鍵被破壞，蛋白質結構混亂，酶切位點被包埋，不利于蛋白酶的酶解。繼續延長時間，水解度保持不變。可溶性肽含量的變化隨時間的延長先下降后逐漸上升，處理時間在15 min之內可溶性肽含量逐漸下降，主要是隨著水解程度的下降，可溶性肽的得率降低，處理時間超過15 min后可溶性肽含量又逐漸上升，主要原因可能是在水解度不變的情況下，熱預處理時間的延長，使得大分子蛋白質持續降解，有利于可溶性肽的積累。

圖 7 熱預處理時間對藍蛤酶解液水解度和可溶性肽質量濃度的影響Fig. 7 Effects of different heating times on the degree of hydrolysis and soluble peptide concentration of A. aloidi hydrolysates

2.4.2 熱預處理時間對藍蛤酶解液主要鮮味物質含量的影響

表 3 熱預處理時間對藍蛤酶解液主要鮮味物質含量的影響Table3 Effects of different heating times on the concentration of main umami compounds of hydrolysates

從表3可以看出，長時間的熱處理不利于風味核苷酸的積累，隨著熱處理時間延長其含量逐漸下降，20 min后差異不顯著。熱處理時間的長短影響各核苷酸的含量變化，其增加或較少的原因與熱預處理溫度下的原因分析相一致。合理控制熱處理時間對降低核苷酸損失是一種有效的方式。隨著熱預處理時間的延長，谷氨酸的含量呈現下降的趨勢。谷氨酸含量的多少取決于其形成和降解量的比率[37]。蛋白質水解會釋放出游離谷氨酸，但是長時間受熱可能會使谷氨酸發生分子內脫水生成焦性谷氨酸，鮮味下降甚至消失[38]。

2.4.3 熱預處理時間對藍蛤酶解液主要呈味特性的影響

分析不同時間熱預處理后酶解液的苦、鮮味、豐富性可知（圖8），隨著熱預處理時間的延長，鮮味總體降低，這主要與核苷酸、谷氨酸等呈鮮味物質的減少有關。酶解液的豐富性先減少，20 min后又增加，這可能主要與可溶性肽含量在20 min后逐漸增加有關。寡肽類物質與其他呈味物質的相乘作用可以增加品整體的柔和度、濃厚感、持久性。苦味值的下降主要與生成苦味氨基酸和苦味肽的含量相關。

圖 8 不同熱預處理時間下酶解液的主要呈味特性雷達圖Fig. 8 Radar plots of main taste values of hydrolysates produced with different thermal pretreatment times

2.4.4 熱預處理時間對藍蛤酶解液色澤的影響

表 4 熱預處理時間對藍蛤酶解液色澤的影響Table 4 Effect of different heating pretreatment times on the color of hydrolysates

由表4可以看出，隨著熱預處理時間的延長，酶解液L*值逐漸增大，熱預處理10 min后與5 min時有顯著差別，時色澤明亮。可能是導致顏色變化的熱敏性酶類物質在10 min處理后已失去活性，不能發揮作用。

綜合分析熱預處理時間對藍蛤水解度、可溶性肽、核苷酸、谷氨酸、整體滋味、顏色等各指標，確定藍蛤熱處理的較佳時間為10 min。

3 結 論

采用不同種類蛋白酶酶解藍蛤蛋白，酶解液的水解度、可溶性肽含量及整體滋味存在較大差異，采用雙酶組合酶解的方式可以有效提高水解度和可溶性肽含量，達到充分利用藍蛤蛋白資源的目的。在中性蛋白酶與風味蛋白酶質量比2∶1的條件下，獲得的酶解液可溶性肽含量較高，鮮味濃郁、口感醇厚、苦味最弱。隨著預處理溫度的升高，水解度、可溶性肽和風味核苷酸含量逐漸下降，但121 ℃熱處理后均略有增加；鮮味和豐富性逐漸下降后略有上升，苦味先下降后上升；亮度隨著預處理溫度的升高而增加。隨著熱預處理時間的延長，酶解液水解度、可溶性肽含量、呈味核苷酸及谷氨酸含量均呈下降趨勢，鮮味和苦味均顯著降低，豐富性先減少后增加。加熱預處理一定程度上可以改善藍蛤酶解液的整體風味和色澤，在藍蛤酶解前，采用70 ℃加熱10 min的熱預處理方式，可以獲得呈味特性較好的酶解液。