乳酸菌抑制N-亞硝胺形成的機理探究及應用效果

李秀明，劉靜靜，閆利娟，楊 華，王 洋，馬儷珍,

（1.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384；2.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384；3.天津農學院水產學院，天津 300384）

N-亞硝胺具有致癌、致畸、致突變性，對人體健康有極大危害。它主要由氮氧化物和仲胺反應生成，含有大量前體物，如含亞硝酸鹽和胺類物質的食品極易生成N-亞硝胺，且pH值、溫度等均是影響其生成的重要 因[1]。在腌肉制品加工中，為了同時起到發色、抑菌、抗氧化、提高風味的作用[2]，按照國家標準，亞硝酸鹽的最大添加量為0.15 g/kg[3]，在加工、貯藏過程中，肉中蛋白質的降解產物[4]可為N-亞硝胺的生成提供前體物，加熱溫度和時間的影響亦極大地促進N-亞硝胺的生成[5]，所以腌肉制品中會有N-亞硝胺形成的潛在危險。因如何降低產品中N-亞硝胺的含量對于食品安全控制方面具有重要的意義。

乳酸菌在傳統發酵食品中應用廣泛（如酸奶、酸菜、發酵香腸等），有提高產品風味和營養的作用[6]。目前學者利用乳酸菌抑制N-亞硝胺多針對發酵食品，如在食品制作時接種活菌發酵，作用于N-亞硝胺前體物，降解亞硝酸鹽[7-9]和抑制胺類物質形成[10-11]；也有學者從一些產品中分離篩選出能夠降解亞硝酸鹽[12-14]和生物胺[15]的乳酸菌研究其作用機理，結果表明為酸度、亞硝酸鹽還原酶、生物胺氧化酶的作用，或降低在食品加工過程中生成N-亞硝胺，這可能是乳酸菌產酸降低pH值抑制腐敗菌生長，從而間接抑制了易生成N-亞硝胺的物質形成[16-17]，也有學者提出是由于微生物對N-亞硝胺具有吸附或降解的作用[18]；肖亞慶等[19]研究發現戊糖乳桿菌中位于細胞壁最外層的表層蛋白具有降解N-甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）和N-乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）的效果，也可能是由于乳酸菌分泌了可降解N-亞硝胺的酶[20]。但以上研究多為在發酵溫度（如37 ℃）下探究乳酸菌對N-亞硝胺的降解機理，對于無發酵工藝的產品加工中則不太適用，如紅腸等。

經前期研究（數據未發表），將腌制好的肉餡在真空攪拌機中加入輔料的同時接種PRO-MIX5乳酸菌發酵劑（木糖葡萄球菌清酒乳桿菌類植物乳桿菌），灌裝后首先經過12 h的發酵過程，再按照紅腸的加工工藝進行干燥、蒸煮、烘、煙熏等，實驗結果表明接種某些乳酸菌發酵后確實能夠減少紅腸中N-亞硝胺的形成，降低亞硝酸鹽的殘留量，提高產品的安全性，但發酵會延長產品的加工周期，對加工設備和環境衛生要求更高，且經發酵后紅腸產品有微酸味，消費者不易接受。針對以上問題，本研究提出假設，能否在體外培養這種特殊乳酸菌菌株，探究其抑制N-亞硝胺形成的機理，提取其中有效抑制N-亞硝胺的物質，然后直接添加到類似紅腸、培根等沒有發酵環節的肉制品中，不經過發酵即可降低產品中N-亞硝胺含量，提高其食用安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉 天津市康寧肉制品有限公司；PRO-MIX5 意大利薩科公司。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

豬瘦肉與水以1∶2比例勻漿，經4 次沸水浴加熱10 min、勻漿后于121 ℃高壓滅菌20 min，在所得液體中加入4%葡萄糖，得到肉培養基，用于初步探索過程中培養PRO-MIX5乳酸菌使用。

1.3.2 PRO-MIX5乳酸菌培養物處理方式

PRO-MIX5乳酸菌培養物4 ℃、5 000h g離心15 min，棄掉上清液得到菌體；用25 mmol/L、pH 6的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）4 ℃、5 000h g離心15 min，沖洗菌體2 次；添加終質量濃度為1 mg/mL的溶菌酶在30 ℃作用2 h，再用超聲波細胞破碎儀以200 W的功率，超聲2 s、停2 s共進行5 min[21]。上述溶液在4 ℃、10 000h g離心10 min。

1.3.3 NDMA模擬體系制備

參考Kuniyuki等[22]的方法，并稍作修改，使反應體系中NaNO2和DMAg HCl終濃度分別為20 mmol/L和10 mmol/L，且以上試劑均用濃度為25 mmoL/L、pH 6的PBS配制，將該體系于80 ℃水浴鍋中反應1 h后，加入6 mol/L NaOH溶液調節pH值至13終止亞硝化反應，置于冰浴中迅速冷卻后加入5 mL氯甲烷，充分振蕩1 min，使氯甲烷與品充分混勻，在4 ℃、10 000h g離心5 min，吸取底部氯甲烷層的清亮部分過0.45 μm濾膜后轉入氣相色儀的小瓶中待上機。

1.3.4 實驗設計

圖 1 實驗設計方案Fig. 1 Schematic illustration for the experimental design

為了分析PRO-MIX5乳酸菌培養物對N-亞硝胺的抑制機理，分別在降解亞硝酸鹽和抑制NDMA形成兩個方面進行逐步篩選，實驗設計總體方案見圖1所示。

1.3.4.1 發酵代謝產物對亞硝酸鹽的降解作用

由于PRO-MIX5是在紅腸中應用篩選得到能夠抑制 N-亞硝胺形成的優勢乳酸菌發酵劑，且在發酵第12小時效果最佳，為盡量保持在體外制作時所得產物一致，實驗以PRO-MIX5商業發酵劑為研究對象，接種在1.3.1節制得的液態肉培養基中，發酵12 h（35 ℃）得到混合發酵液，經4 ℃、5 000h g離心15 min獲得發酵上清液，即為該商業發酵劑的代謝產物。為了解這種混合發酵液和發酵上清液的作用濃度、作用溫度和作用時間是否可以清除模擬體系中的亞硝酸鹽，設計了2 個實驗。

實驗方案1的作用溫度模擬肉的腌制溫度，設定為4 ℃，在50 mL離心管中分別加入混合發酵液和發酵上清液1.5、3、6 mL，以終質量濃度為0.15 mg/mL加入NaNO2標準溶液，添加蒸餾水至30 mL，混合發酵液和發酵上清液的作用時間均為0、8、16 h，在規定時間立即測定體系中的亞硝酸鹽含量。

實驗方案2中，為進一步驗證發酵上清液，即代謝產物的作用，將發酵上清液的添加濃度提高，取20 mL發酵上清液于50 mL離心管中，以終質量濃度為0.15 mg/mL加入NaNO2標準溶液，添加蒸餾水至30 mL，分別置于4 ℃（模擬腌制溫度）和35 ℃（模擬發酵溫度）環境中作用，在作用的第0、8、21、32小時立即取測定體系中的亞硝酸鹽含量。

1.3.4.2 乳酸菌胞內酶釋放后對亞硝酸鹽的降解作用

按照表1的前處理方式得到4 組混合液，對菌體進行溶菌酶作用和細胞破碎處理，使其釋放出胞內酶后所得液體分別為混合發酵液、沉淀與水混合物、沉淀與PBS混合物、乳酸組發酵液，各取20 mL于50 mL離心管中，以終質量濃度為0.1 mg/mL加入NaNO2標準溶液，添加蒸餾水至30 mL，置于30 ℃反應，分別測定第0、1、2小時反應體系中亞硝酸鹽的殘留量。

表 1 PRO-MIX5發酵劑降解亞硝酸鹽混合液的實驗方案Table 1 Preparation of nitrite inhibitors from the fermentation broth of PRO-MIX5

1.3.4.3 混合發酵液和沉淀與水混合物對NDMA形成的影響

在生成NDMA的模擬體系中加入混合發酵液和沉淀與水混合物各5 mL于總體積為20 mL的NDMA模擬體系中，30 ℃保溫反應2 h后，80 ℃加熱1 h，空白對照組（CK組）則直接加熱反應，測定NDMA的生成量。

1.3.4.4 不同處理方式的菌體對NDMA形成的影響

將在添加10 μg/mL NaNO2的MRS培養基擴增培養的PRO-MIX5菌體分別以活菌（離心MRS培養基得到菌體，用PBS沖洗菌體2 次）和死菌（將沖洗后的菌體于100 ℃水浴加熱15 min）的狀態，以濕質量的0.1 g加入20 mL形成NDMA的模擬體系中，且篩選不同的作用方式：加入模擬體系后直接80 ℃加熱反應1 h；在30 ℃保溫作用2 h后，再80 ℃加熱反應1 h，同時做空白對照。

1.3.4.5 菌體不同組分對NDMA形成的影響

用MRS肉湯培養基擴增培養PRO-MIX5后離心得到菌體，用PBS沖洗菌體兩次后，用菌體與PBS質量比1∶4稀釋，將菌體破碎后，離心得到的上清液為胞內酶粗提液[23]，沉淀為菌體碎片。分別將上清液、沉淀、混合體（上清液沉淀）加入總體積20 mL的NDMA模擬體系中反應，同時設置空白對照組，測定NDMA最終的形成量。

1.3.4.6 對乳酸菌培養方式、菌體碎片添加量的篩選

分別使用4 種MRS液體培養基：不添加誘導劑；添加10 μg/mL NaNO2；添加0.04 μg/mL NAS；添加 10 μg/mL NaNO20.04 μg/mL NAS，擴增培養PROMIX5，經1.3.4.5節相同方法處理得到菌體碎片，按照濕質量分別以0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%的比例加入形成NDMA的模擬體系中反應，同時做空白對照，最終得到不同培養方式以及添加量對NDMA形成的影響。

1.3.4.7 PRO-MIX5菌體碎片在紅腸和培根中的應用效果

使用相對較低的添加量將菌體碎片分別以0.05%、0.25%、0.5%的比例（濕質量）應用于紅腸和培根的制作中，同時設置空白對照組，即不添加菌體碎片，分別測定4 組產品中9 種N-亞硝胺含量。

1.3.5 指標測定方法

1.3.5.1 亞硝酸鹽的測定

參照李秀明等[24]的毛細管電泳法測定亞硝酸鹽殘留量。

1.3.5.2 N-亞硝胺的測定

參照GB 5009.26ü 2016《食品中N-亞硝胺類化合物的測定》[25]對品中的N-亞硝胺進行提取、萃取凈化、濃縮后過膜。氣相色條件：進量1 μL；進口溫度250 ℃；柱箱升溫梯度為50 ℃保持4 min，10 ℃/min速率升至180 ℃保持2 min，20 ℃/min 升至220 ℃，保持10 min，后運行以235 ℃保持2 min；氮磷檢測器溫度330 ℃；氫氣流速2 mL/min，空氣流速60 mL/min，載氣（N2）流速6 mL/min。將過膜 后的品用該氣相色條件測定9 種N-亞硝胺，同時進行分析定量。

1.3.5.3 pH值的測定

參照GB 5009.237ü 2016《食品pH值的測定》[26]的方法進行測定。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 在肉培養基中培養PRO-MIX5

2.1.1 發酵代謝產物對亞硝酸鹽的降解作用

在肉制品加工中常添加亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽是形成致癌物N-亞硝胺的前體物。乳酸菌代謝產物常存在于發酵上清液中，其中含有大量乳酸、乳酸菌、過氧化氫等物質[27]。如圖2所示，隨著作用時間的延長和添加濃度的增加，發酵上清液和混合發酵液均不能顯著降解體系中的亞硝酸鹽含量。

圖 2 發酵上清液和混合發酵液添加量對模擬體系中亞硝酸鹽的降解作用Fig. 2 Effects of fermentation supernatant and fermentation broth on degradation of nitrite in simulated system

如圖3所示，在4 ℃和35 ℃條件下添加發酵上清液的模擬體系中亞硝酸鹽含量隨著反應時間的延長均未顯著降低，可知隨著發酵上清液添加量的增加、反應溫度的提高和反應時間的延長，菌體發酵的代謝產物依然沒有顯著降解亞硝酸鹽的效果，綜上結果說明在發酵時能夠起到降解亞硝酸鹽的物質并不存在于乳酸菌的發酵代謝產物中。

圖 3 溫度對模擬體系中亞硝酸鹽的降解作用Fig. 3 Effect of temperatures on degradation of nitrite in simulated system

2.1.2 乳酸菌胞內酶釋放后對亞硝酸鹽的降解作用

張馨月等[21]報道，LCR6013中降解亞硝酸鹽主要為亞硝酸鹽還原酶的作用，且該酶屬于胞內酶，主要存在于細胞同質間隙，對亞硝酸鹽降解作用顯著，其次為細胞質酶和細胞碎片。按照1.3.4.2節的實驗方法制備乳酸菌發酵液，其中在培養基中添加亞硝酸鹽的目的是作為誘導劑促進降解亞硝酸鹽的物質產生，且其添加量對降解效果相關性較大[28]。按照表1的方法步驟對乳酸菌發酵液處理后進行實驗，結果如圖4所示。實驗結果表明，由PRO-MIX5制得的混合發酵液、沉淀與水混合物、沉淀與PBS混合物、乳酸組發酵液隨著反應時間的延長，均能對亞硝酸鹽起到降解作用（P＜0.05），且不同處理方式對亞硝酸鹽降解率由大到小順序依次為：沉淀與水混合物＞混合發酵液＞乳酸組發酵液＞沉淀與PBS混合物，其中混合發酵液和沉淀與水混合物處理方式在保溫反應過程中對亞硝酸鹽降解率具體如表2所示，說明將細胞破碎釋放出胞內酶后，對亞硝酸鹽降解作用顯著，但沉淀與水混合物降解效果優于混合發酵液是由于胞內酶釋放后不穩定[29]，且可能受到上清液中代謝產物如過氧化氫的作用影響了其活性，而用水取代發酵上清液后破碎菌體則能較好地使胞內酶和菌體碎片發揮作用，在保溫2 h時對亞硝酸鹽的降解率可達53.49%，相反，用 0.01 mol/L、pH 7.4的PBS并不能更好地維持亞硝酸鹽還原酶的穩定性，反而使酶活性大大下降，結果與文獻[21]結果不一致，可能是由于菌種的不同，對PBS的pH值和濃度的耐受性也不同。

圖 4 PRO-MIX5胞內酶釋放后對亞硝酸鹽的作用情況 Fig. 4 Effect of PRO-MIX5 on nitrite degradation after release of intracellular enzymes

表 2 混合發酵液和沉淀與水混合物在保溫反應過程中 對亞硝酸鹽的降解率Table 2 Degradation percentages of nitrite by fermentation broth and mixture of precipitate and water at constant reaction temperature

2.1.3 混合發酵液和沉淀與水混合物對NDMA形成的影響

目前國標中僅規定肉制品中NDMA殘留量不能超過3 μg/kg[30]，因以形成NDMA的模擬體系對微生物抑制劑的制作進一步篩選。如表3所示，混合發酵液和沉淀與水混合物均極大地促進了NDMA的形成，這可能是由于本步驟采用的是肉培養基，且經過接菌發酵后，蛋白質降解使體系中含有級胺類物質，為N-亞硝胺的形成提供了大量的前體物[31]。混合發酵液對NDMA形成的促進能力顯著高于沉淀與水混合物（P＜0.05），且其促進能力幾乎為沉淀與水混合物的2 倍（表3）。由于沉淀與水混合物已離心除去上清液，由說明該發酵劑的代謝產物中可能存在著能夠促進NDMA形成的物質，因而所制備的發酵液沉淀中可能存在能夠抑制NDMA形成的物質，且該物質可能存在于菌體中。

表 3 混合發酵液和沉淀與水混合物對NDMA形成的影響Table 3 Effects of fermentation broth and mixture of precipitate and water on the formation of NDMA

2.2 PRO-MIX5培養

2.2.1 不同處理方式的菌體對NDMA形成的影響

表 4 處理方式對NDMA形成的影響Table 4 Effects of treatment on NDMA formation

如表4所示，4 種作用方式均不同程度地促進NDMA形成，但促進效果遠低于2.1.3節的結果，其中活菌在模擬體系中保溫2 h，NDMA形成量明顯高于其他3 組，且添加活菌直接亞硝化反應組中NDMA形成量也高于死菌組，說明在活菌保溫2 h的過程中以及在80 ℃中反應，活菌可能產生了一些能夠促進NDMA形成的物質。而死菌在模擬體系中保溫2 h對NDMA促進效果幾乎一致，且促進率較低，對比活菌結果，推測菌體中可能含有抑制 N-亞硝胺形成的物質，且該物質不是一種活性蛋白酶，具有一定耐熱性。

2.2.2 菌體不同組分對NDMA形成的影響

表 5 PRO-MIX5菌體經破碎后不同位置的產物對NDMA形成的影響Table 5 Effect of broken cells versus supernatant of PRO-MIX5 on the formation of NDMA

如表5所示，沉淀組，即添加PRO-MIX5的菌體碎片（包含細胞壁碎片、細胞膜碎片、細胞器、包涵體等物質）對NDMA的形成具有顯著的抑制效果，可能是由于菌體碎片對N-亞硝胺具有一定的吸附作用[18,32]，但其具體機理仍需進一步深入研究；上清液和混合體則促進了NDMA形成，其中混合體組促進效果顯著大于上清液，說明沉淀物菌體碎片的存在可能會增加上清液對NDMA形成的促進作用，其具體相互作用的機理亟待研究。

2.2.3 對乳酸菌培養方式、菌體碎片添加量的篩選

如表6所示，使用添加0.04 μg/mL NAS的MRS培養基擴增培養PRO-MIX5，得到的菌體碎片對NDMA形成的抑制效果最佳，隨著添加量的變化，對NDMA的抑制效果較為穩定，且在篩選的幾個添加量范圍內添加量越低，NDMA的形成量越低，可使用添加量范圍較廣，以作為為本實驗篩選出的抑制NDMA形成效果較好的抑制物質，進一步應用于實際產品的加工中。

表 6 不同培養方式所制得的菌體碎片以及不同添加量 對NDMA形成的影響Table 6 Effect of addition of NaNO2 and/or NAS at different levels to MRS medium on the formation of NDMA μg/mL

2.3 PRO-MIX5菌體碎片在紅腸和培根中的應用效果

表 7 PRO-MIX5菌體碎片對9 種N-亞硝胺形成的影響Table 7 Effects of addition of PRO-MIX5 debris on the formation of nine N-nitrosamines μg/kg

根據表7，相比CK組，在紅腸中添加0.05%和0.5%的菌體碎片能夠顯著降低產品中NDMA的形成，抑制率分別為53.03%和63.52%，其中以0.05%添加量對9 種N-亞硝胺總形成量的抑制效果最佳，抑制率可達到41.04%、0.25%和0.5%添加量對9 種N-亞硝胺總形成量抑制率分別為16.13%和13.48%。在培根中添加0.05%的菌體碎片抑制N-亞硝胺的效果相對較好，對NDMA形成的抑制率為27.58%，對9 種N-亞硝胺形成總量的抑制率為13.83%，而0.25%和0.5%添加量無顯著抑制效果。說明所制得的菌體碎片不僅能夠抑制產品中N-亞硝胺的形成，且在較低添加量下就能起到抑制作用，應用效果良好。

3 結 論

PRO-MIX5的菌體碎片具有抑制N-亞硝胺形成的效果，且使用添加0.04 μg/mL NAS的MRS肉湯培養基培養PRO-MIX5，經過4 ℃、5 000h g離心15 min得到菌體，用25 mmol/L，pH 6的PBS沖洗菌體2 次，再以該PBS以1∶4的比例稀釋，添加終質量濃度為1 mg/mL的溶菌酶作用后，超聲波破碎5 min，經4 ℃、10 000h g離心10 min得到的沉淀（菌體碎片）為能夠有效抑制N-亞硝胺形成的物質；以添加量均為0.05%應用于紅腸和培根的加工中，對9 種N-亞硝胺形成的總量抑制效果相對較好，阻斷率分別為41.04%和13.83%，研究結果對肉制品安全控制方面具有重要意義。