產β-D-半乳糖苷酶馬克斯克魯維酵母的 分離鑒定及其產酶特性

鄭 義，張 健，曹永強，趙 笑，余志堅，陳 超，楊貞耐,,

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 北京工商大學，北京 100048；2.東君乳業（禹城）有限公司，山東 德州 253000）

β-D-半乳糖苷酶，俗稱乳糖酶，能夠催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖[1]；有些酶還具有良好的轉糖基活性，即能以乳糖為底物催化合成低聚糖[2]。β-D-半乳糖苷酶不僅可以用于降低乳中乳糖含量，生產低乳糖乳制品，并防止濃縮乳制品結晶，還可以用于生產低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）[3]。GOS是在乳糖分子的半乳糖基側以β-1,4糖苷鍵的形式連接了1～7 個半乳糖基形成的混合雜聚糖[4]。作為一種新型功能性益生元，GOS具有促進腸道雙歧桿菌增殖、改善礦物質元吸收、改善脂質代謝、預防和治療便秘等功能[5-7]。利用安全、高效的β-D-半乳糖苷酶，采用酶法合成GOS近年來受到了廣泛的關注[8]。

β-D-半乳糖苷酶可從植物、動物和微生物（細菌、霉菌或酵母）中獲得[9]。不同來源β-D-半乳糖苷酶的酶學性質差異很大[10]，其中，微生物源酵母產β-D-半乳糖苷酶活性較高。Chockchaisawasdee等[11]用乳酸克魯維酵母所產β-D-半乳糖苷酶處理乳糖，乳糖水解率高達92%；劇淑君[12]用馬克斯克魯維酵母β-D-半乳糖苷酶制備GOS，乳糖轉化率為30.1%。通常乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母等產生的β-D-半乳糖苷酶具有較強的水解活性[13]；米曲霉、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌等產生的β-D-半乳糖苷酶具有較強的轉糖基活性[14]。在安全性方面，通?？唆斁S酵母、黑曲霉等來源的酶比較安全[15]，來源于大腸桿菌的β-D-半乳糖苷酶易受到內毒污染[12]。微生物源性β-D-半乳糖苷酶具有良好的工業應用價值[1]；克魯維酵母的Maxilact系列是當前主要的商品β-D-半乳糖 苷酶[16]。由于來源于酵母的β-D-半乳糖苷酶的最適pH值偏弱酸性，因更適于生產低乳糖乳制品及GOS，并應用于預防乳糖不耐受癥及其他相關功能性食品的 研發[17]。但當前仍然缺乏優良的產β-D-半乳糖苷酶并具有良好的轉糖基活性的菌株。

藏靈菇是一種由乳酸菌、酵母、醋酸菌等微生物形成的共生體[18]。藏靈菇發酵產物具有β-D-半乳糖苷酶活性，能夠有效地水解乳糖，可用于治療乳糖不耐癥等多種代謝性疾病[19]。前期研究還發現藏靈菇能有效地將乳糖水解后轉化為低聚糖[20]。本研究擬從藏靈菇中分離高產β-D-半乳糖苷酶菌株，通過培養基和發酵條件優化，制備高活性的β-D-半乳糖苷酶，并明確其酶學特性及產酶條件，制備GOS，為其實際應用奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏靈菇取自西藏林芝牧戶發酵劑；鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside，ONPG）、鄰硝基苯酚（o-nitrophenol，ONP）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、乳糖、葡萄糖、磷酸氫鈉、磷酸氫鈉、十水合磷酸氫鈉、水合磷酸氫鈉、氯化鈉、碳酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鐵（均為分析純），蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏（生化 試劑） 中國醫藥集團有限公司；酵母抽提物（生化 試劑） 英國Oxoid公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PL203型電子天平 梅特利-托利多（上海）儀器有限公司；1-4/2-4 LSC型冷凍干燥機 北京五洲東方科技發展有限公司；CR21GIII型高速冷凍離心機、U-3900型紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；VORTEX-5型旋渦振蕩器 上海精科實業有限公司；BX53F型熒光顯微鏡 日本Olympus公司；MLS-3781L型自動滅菌鍋 日本Panasonic公司；THZ-D型電熱恒溫培養箱 上海一恒儀器科技有限公司；041BR101783型基礎電泳儀 美國Bio-Rad公司；DDBJ-350型便攜式電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；MLS-3750型高壓蒸汽滅 菌器 日本三洋公司；HPLC-20A高效液相色儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 高產β-半乳糖苷酶菌株的篩選、分離及鑒定

1.3.1.1 培養基的制備

篩選培養基：乳糖10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母浸膏 10 g/L，NaCl 4 g/L，X-gal 0.035 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

活化培養基：蛋白胨10 g/L，酵母膏20 g/L，葡萄糖 40 g/L；裝液量1 mL/1.5 mL離心管，接種量2.0%（V/V）。

發酵培養基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L；裝液量30%，接種量2.0%（V/V），溫度30 ℃，搖床轉速150 r/min。

1.3.1.2 菌株初篩

將藏靈菇以10 g/100 mL接種于純牛乳中，在28 ℃恒溫箱中培養24 h，重復3 次。取第3次的發酵乳1 mL，加入9 mL無菌蒸餾水，均勻混和后進行梯度稀釋。分別移取200 μL不同梯度濃度菌液均勻涂布于篩選培基上，置于30 ℃恒溫箱中培養24～36 h。從篩選培養基上挑取帶有較深藍色水解圈的單菌落進行平板劃線，重復劃線3 次，得到純菌。將菌體轉接到種子培養基中，在30 ℃培養16 h，之后置于80 ℃甘油管冷凍保藏。

1.3.1.3 菌株復篩

將甘油管中菌體以2%接種量（V/V）接到裝有100 mL發酵培養基的三瓶中，30 ℃、100 r/min條件下發酵36 h。離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min）后，分別測定上清液和菌體沉淀物的水解酶活力，以確定所產酶為胞內酶或胞外酶，并進行高產酶菌株的篩選。

1.3.1.4 菌落及細胞形態觀察

取發酵后的菌液，稀釋后進行平板涂布，于30 ℃恒溫箱中培養36 h，觀察菌落形態。挑取一環甘油管保藏的菌種，進行鏡檢觀察。

1.3.1.5 菌株的鑒定

用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒對純化后的菌株進行DNA的提取。利用提取的總DNA對ITS保守序列進行PCR擴增獲得目的基因片段。采用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴增序列，PCR體系：2h Mix 25 μL、引物各l μL、模板DNA 2 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢驗后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

對影響馬克斯克魯維酵母菌ZX-5產β-D-半乳糖苷酶的主要因（培養基的碳源和氮源、發酵溫度、培養基初始pH值、搖瓶轉速）分別進行單因試驗。以酶活力為指標，選用發酵培養基，接種量2%，發酵36 h。將發酵培養基中的碳源（葡萄糖）分別以等量的乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖作為碳源進行替換；將發酵培養基中的氮源（蛋白胨）分別以等量的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、硫酸銨作為氮源進行替換；選取發酵溫度分別為20、25、30、35、40 ℃（其他發酵條件為pH 6.5，轉速 150 r/min）；調節培養基初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0（其他發酵條件為發酵溫度30 ℃，轉速150 r/min）；選取發酵轉速分別為0、50、100、150、200 r/min（其他發酵條件為發酵溫度30 ℃，pH 6.5）。

1.3.3 β-D-半乳糖苷酶活力測定方法

1.3.3.1 ONP標準曲線

稱取13.92 mg的ONP（精確到0.001 g）溶于10 mL水中，配制成10 mmol/L的標準溶液。取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL的上述溶液于1～6號試管中，分別添加2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL的水，定容到2.0 mL，配制成0、2、4、6、8、10 mmol/L的ONP標準液。用分光光度計測量產物在420 nm波長處的吸光度。

1.3.3.2 酶活力測定方法

以50 mmol/L pH 6.5的PBS為溶劑配制質量濃度為1 mg/mL的ONPG溶液。取2 mL上述溶液于試管中，在35 ℃的環境下預熱10 min后，加入1 mL稀釋后的β-D-半乳糖苷酶液，于35 ℃反應15 min，然后加入2.5 mL 0.15 mol/L的Na2CO3溶液終止反應，靜置5 min，用分光光度計測量產物在420 nm波長處的吸光度。

β-D-半乳糖苷酶活定義：在35 ℃條件下，1 min催化ONPG反應生成1 μmol ONP的酶量定義為一個標準酶活力單位。

1.3.4 粗酶液的制備

冷凍的菌株解凍后，接種到活化培養基中，接種量2%，35 ℃恒溫培養16 h，重復3 代。后接種于發酵培養基中，接種量2%，150 r/min，30 ℃恒溫培養36 h。取30 mL充分搖勻后的菌液裝于離心管中，在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，倒掉上清液。用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2 次，離心后倒掉上清液，再加入30 mL PBS，充分振蕩后，使用超聲波細胞破碎儀進行細胞破碎，得到粗酶液。

1.3.5 β-D-半乳糖苷酶的提純

1.3.5.1 硫酸銨分級沉淀

在冰水浴中放置9 個分別裝有10 mL粗酶液的燒杯，在磁力攪拌條件下緩慢加入研磨過的(NH4)2SO4粉末，分別添加至不同飽和度（20%～90%），旋渦攪拌20 min，然后在4 ℃靜置30 min，離心（4 ℃，8 000 r/min，15 min），取上清液測定酶活力[21]。空白組只添加各飽和度的PBS。以上清液中水解酶活對(NH4)2SO4的飽和度作圖，得到硫酸銨分級沉淀的曲線，確定(NH4)2SO4分級沉淀的飽和度。

1.3.5.2 透析脫鹽處理

將硫酸銨分級沉淀后酶液裝入透析袋中，進行透析操作。透析緩沖液為濃度50 mmol/L的PBS。在4 ℃的環境中透析，平均每4 h換一次透析液，透析1～2 d，用電導率儀測定緩沖液的電導率，直至電導率不變時脫鹽完成。

1.3.5.3 DEAE-Sepharose離子交換柱層析

DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱用濃度 50 mmol/L，pH 6.5的PBS沖洗平衡4 個柱體積后，將透析后得到的酶液溶解在PBS中，上10 mL。先用PBS洗脫，流速為1.0 mL/min，換用不同濃度的NaCl緩沖液進行濃度梯度沖洗，濃度分別為0.3、0.5、0.9 mol/L。分別收集每一個的洗脫液，然后檢測酶活性。經透析、冷凍干燥得到純化酶。

1.3.6 酶學性質研究

1.3.6.1 酶反應的最適溫度

取6 支試管，分別加入2 mL ONPG溶液，再添加1 mL稀釋后的純化酶液，分別置于25、30、35、40、45、50 ℃的水浴鍋中反應15 min，測定其相對酶活力。

1.3.6.2 酶反應的最適pH值和pH值穩定性

取6 支試管分別加入稀釋后的純化酶液1 mL，用pH值分別為4、5、6、7、8、9的PBS配制ONPG溶液，測定其相對酶活。

1.3.6.3 金屬離子對酶活的影響

用50 mmol/L pH值為6.5的PBS制備濃度為10 mmol/L 的含有不同金屬離子化合物（CuCl2、CaCl2、MgCl2、MnSO4、FeCl3、ZnCl2、FeCl2）的溶液，然后以溶液配制質量濃度為1 mg/mL的ONPG溶液，測定含不同金屬離子溶液中β-D-半乳糖苷酶的相對酶活變化。

1.3.7 β-D-半乳糖苷酶產低聚糖的特性

將3.0 g乳糖溶于4.5 mL pH 6.0的PBS中（乳糖終質量分數為60%），置于35 ℃保溫30 min。取一定量來源于菌株ZX-5所產的β-D-半乳糖苷酶溶于5 mL緩沖液中，輕搖混合均勻，從中取0.5 mL酶液加入乳糖溶液，制成5.0 mL的終反應體系，酶的終濃度為1.0 U/mL。在35 ℃條件下進行反應，分別于0、4、8、12、20、30、40、50 h從中取100 μL，迅速置于沸水浴10 min終止酶反應。冷卻后稀釋10 倍，再過0.45 μm的濾膜除去雜質，采用高效液相色法測定其中各種產物的產量。每個品、每個時間點重復3 次。

1.4 數據分析

實驗數據均采用3 次平行實驗取平均值，采用SPSS軟件進行方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 產β-D-半乳糖苷酶菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株初篩

圖 1 從藏靈菇中分離得到具有藍色水解圈的菌落Fig. 1 Bacterial colonies with blue hydrolysis circles isolated from Tibet kefir

X-gal可以在β-D-半乳糖苷酶的催化下生成藍色產物，是β-D-半乳糖苷酶的顯色底物，且藍色越深， β-D-半乳糖苷酶的活力越高[19]。如圖1所示，使用以乳糖為唯一碳源、添加X-gal的篩選培養基平板，從藏靈菇中分離得到大量的呈現藍色水解圈的菌落。選擇水解圈較大、顏色較深的菌落用于產β-D-半乳糖苷酶菌株的復篩。

2.1.2 菌種復篩

挑取上述所得呈現藍色水解圈較大的菌落接種于發酵培養基，經搖瓶發酵培養，對發酵液離心所得菌體進行破壁處理，進一步離心，經酶活測定，酶活力主要集中在上清液中，即所產β-D-半乳糖苷酶為胞內酶。挑選酶活力最高的菌落，命名為ZX-5。

2.1.3 菌落及細胞形態觀察

圖 2 ZX-5菌落及細胞形態觀察Fig. 2 Colony morphology and microscopic graph of ZX-5

將ZX-5在培養基平板中培養后，對其所形成的菌落進行觀察，如圖2a所示，菌落為乳白色，大而厚，濕潤，表面光滑不透明，黏稠。鏡檢觀察的結果如圖2b所示，根據細胞形態，初步確定該菌株為酵母。

2.1.4 菌株的鑒定

圖 3 菌株ZX-5 ITS序列系統進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on ITS sequences of ZX-5

ITS序列分析具有技術簡單、結果準確、重復性好等優點，近年來廣泛應用于真菌菌株的鑒定，是一種重要分子標記[22]。以引物ITS1、ITS4擴增序列，結果顯示擴增產物長度為726 bp。通過BLAST搜索相關序列，將測序結果與GenBank中已知序列進行比較分析，發現其序列與 K. marxianus CCT7735（CP009307.1）相似度為100%；選取與ZX-5 ITS序列相似度高的15 株菌株構建系統進化樹（圖3）。根據序列分析結合形態學觀察，可以確定ZX-5為馬克斯克魯維酵母。

2.2 ONP標準曲線

2.3 產β-D-半乳糖苷酶的單因試驗

2.3.1 碳源、氮源對產酶的影響

圖 4 碳源（a）、氮源（b）對菌株ZX-5發酵產酶的影響Fig. 4 Effects of carbon (a) and nitrogen (b) sources on β-D-galactosidase activity of ZX-5

碳源、氮源是酵母產酶所需的主要營養物質和能量來源[23]。如圖4所示，不同碳源、氮源對菌株產酶活性存在著顯著性的差異。以半乳糖、葡萄糖、果糖為碳源的水解酶活力比以乳糖和蔗糖的高，其中以半乳糖為碳源時菌株所產酶活力最高，這可能與半乳糖、葡萄糖和果糖作為單糖易于被菌體直接吸收利用有關；以胰蛋白胨為氮源的水解酶活力最高，以硫酸銨為氮源的水解酶活力最低，其原因可能是蛋白胨類有機氮源降解后形成的小分子肽類物質易于被微生物直接利用[23]，而使用無機氮源時，氮源利用率低，菌體生長緩慢，產生的水解酶活力偏低。

2.3.2 發酵溫度、初始pH值、搖床轉速對產酶的影響

如圖5a所示，溫度能影響細胞內相關生物酶的催化效率，從而間接影響菌體的生長及代謝產物的產率[24]。培養溫度為30 ℃時，馬克斯克魯維酵母產β-D-半乳糖苷酶的水解酶活力達到最大值；低于30 ℃時，酶活力與溫度呈正相關，即菌株產酶隨著培養溫度的升高而增加；高于30 ℃時，隨著溫度升高可能會對酵母代謝產生不利的影響，從而使菌株產酶呈現下降趨勢。該菌的最適發酵溫度與文獻報道的K. marxianus Z-5較為相似[25]。由，選擇30 ℃為適宜的發酵溫度。

圖5b顯示了不同初始pH值的培養基對菌株ZX-5產酶的影響。在較低或者較高pH值環境下發酵，菌株的水解酶活力普遍較低；而在偏中性的pH值環境，菌株水解酶活力相對較高。當pH值小于6.5時，菌株產水解酶活力與pH值呈正相關，在pH 6.5時酶活力達到最大值；當pH值大于6.5時，菌株產水解酶活力與pH值呈負相關。由，選擇培養基初始pH 6.5進一步研究。

圖 5 發酵溫度（a）、培養基初始pH值（b）、搖床轉速（c） 對菌株ZX-5發酵產酶的影響Fig. 5 Effects of temperature (a), initial medium pH (b) and shaking speed (c) on β-D-galactosidase activity of ZX-5

發酵產酶效率很大程度上受培養基中溶解氧速度的影響。當培養基中氧含量過低時，培養基稠度較高；培養基中氧含量過高時，產物的積累效率會大大降低[26]。由圖5c可以看出，轉速在0～100 r/min范圍內，β-D-半乳糖苷酶的水解酶活力隨著搖床轉速的增加而升高，當轉速達到100 r/min時，水解酶活力達到值。而后隨轉速增加，水解酶活力呈下降趨勢。由，選擇100 r/min為適宜的搖床轉速。

2.4 β-D-半乳糖苷酶的提純

2.4.1 硫酸銨分級沉淀

由圖6可知，當粗酶液中添加的硫酸銨的飽和度在0%～50%范圍時，上清液中酶活力變化不大；隨著硫酸銨的飽和度逐漸增大，尤其當飽和度達60%以上時，上清液中殘余酶活大幅度下降；當飽和度達到80%時，上清液中酶活力已很低，這表明大部分的酶已經沉淀下來。因，在用硫酸銨分級沉淀提取酶時，可以先在硫酸銨飽和度30%時沉淀去除一部分雜質蛋白，然后繼續添加硫酸銨，使飽和度達到80%，收集所得的沉淀于50 mmol/L PBS中保存。

圖 6 硫酸銨沉淀上清液中β-D-半乳糖苷酶活力變化曲線Fig. 6 Enzymatic activity of β-D-galactosidase in supernatants after precipitation with various degrees of (NH4)2SO4 saturation

2.4.2 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析

圖 7 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換色譜分離純化β-D-半乳糖苷酶Fig. 7 Purification of β-D-galactosidase on DEAE-Sepharose Fast Flow

2.4.3 溫度對β-D-半乳糖苷酶活性的影響

溫度的高低對酶的催化活性和酶的穩定性具有明顯影響[27]。由圖8a可知，當溫度低于35 ℃時，水解酶活力與溫度呈正相關，35 ℃時，酶活力達到最大值。繼續升高溫度，酶活力呈現下降趨勢。如圖8b所示，在20～40 ℃范圍內處理酶液30 min后，酶活力仍保留在80%以上，可見菌株ZX-5的β-D-半乳糖苷酶在低于40 ℃時穩定性較好；當溫度高于50 ℃時處理30 min后，β-D-半乳糖苷酶的殘余酶活力約為40%，酶活力損失比較大；當溫度60 ℃時處理30 min，殘余酶活力不足20%。據文獻報道，乳酸克魯維酵母產酶在溫度超過35 ℃后失活較快，60 ℃保溫15 min，酶即失活90%[28]。這也與本實驗所得的結論相接近。

圖 8 溫度對β-D-半乳糖苷酶活性（a）及熱穩定性（b）的影響Fig. 8 Effect of temperatures on β-D-galactosidase activity (a) and thermal stability (b)

2.4.4 pH值對β-D-半乳糖苷酶活性的影響

圖 9 pH值對β-D-半乳糖苷酶活性的影響Fig. 9 Effect of pH value on β-D-galactosidase activity

pH值能影響酶的分子構象、酶和底物的解離狀態以及酶活力的穩定性[29]。如圖9所示，馬克斯克魯維酵母ZX-5產的β-D-半乳糖苷酶的最適pH值為6.0。該酶在pH 5.0～7.0的范圍內，其相對酶活力在90%以上，酶活性比較穩定，而在較強酸性（pH 4.0）或者堿性（pH 9.0）環境中，其酶活力損失很大。該酶與已報道菌株LW106的β-D-半乳糖苷酶最適pH值較為相似[30]，而與Katrolia等[31]研究的基因重組菌株的酶最適pH 5.5有所差別。

2.4.5 金屬離子對β-D-半乳糖苷酶活性的影響

金屬離子能夠影響酶活性，可以激活或抑制酶的活性位點[32]。由圖10可知，金屬離子Ca2、Mg2、Fe2能輕微抑制β-D-半乳糖苷酶水解活性，而Cu2、Fe3、 Zn2對酶活性的抑制作用較大，其中Cu2對酶活性抑制作用最大，可使酶活力下降至20%左右；Mn2對酶活性具有一定的激活作用。據報道，某些金屬離子如Cu2能與酶分子中游離的羧基結合，生成不溶性的鹽類物質，改變酶的結構，從而抑制其催化活性；而Mn2能激活酶的活性位點，對酶的最佳活性構象起到穩定作用，金屬離子構成輔酶，促進酶的催化活性[12]。

圖 10 金屬離子對β-D-半乳糖苷酶活性的影響Fig. 10 Effect of various metal ions on β-D-galactosidase activity

2.5 β-D-半乳糖苷酶作用下低聚糖的生物合成

圖 11 乳糖水解率和低聚糖產率變化曲線Fig. 11 Lactose hydrolysis rate and oligosaccharide production rate with the microbial β-D-galactosidase

基于酶法利用乳糖合成低聚糖被認為是大量生產低聚糖的唯一有效方法[2]。如圖11所示，在35 ℃、乳糖質量濃度60 g/100 mL、酶濃度1.0 U/mL條件下酶促反應過程中乳糖水解及低聚糖合成的情況。在乳糖作為唯一底物的情況下，酶催化反應形成的低聚糖主要為低聚半乳三糖和低聚半乳四糖，同時還有部分葡萄糖和半乳糖生成。隨著酶反應的進行，乳糖不斷被水解。到40 h左右，總低聚糖質量濃度為208.19 g/L，產率達到34.70%。后低聚糖的產率下降，這可能是在反應液中乳糖質量濃度降低的情況下，其中部分低聚糖被β-D-半乳糖苷酶分解的結果。反應至50 h時的乳糖水解率達到68.34%。邢肖肖等[33]用乳酸克魯維酵母β-D-半乳糖苷酶合成GOS，產率為18.9%；Kim等[34]采用部分純化的黑曲霉β-D-半乳糖苷酶合成GOS，產率為20%；Splechtna等[35]利用長雙歧桿菌產生的β-D-半乳糖苷酶合成GOS，產率為32.5%。因，ZX-5菌株β-D-半乳糖苷酶的GOS產率與已報道的相比較好，具有潛在的應用價值。

3 結 論