具抗氧化功能益生菌菌株篩選及其對丙烯酰胺 誘導腸上皮細胞氧化損傷的保護作用

李 桐，吳思琪，曹 鑫，宋靜頤，張紅星，謝遠紅，金君華

（食品質量與安全北京實驗室，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206）

丙烯酰胺具有多種生理毒性，可在淀粉類食物經高溫烹調時產生，目前被世界衛生組織國際癌癥研究機構認定為2A類致癌物[1]。丙烯酰胺可快速到達腸道，刺激腸上皮細胞產生過量的活性氧自由基，降低細胞內抗氧化酶的活性并破壞細胞膜的完整性，導致細胞內容物外泄，使細胞發生氧化損傷，最終可致腸上皮細胞凋亡或死亡，造成腸黏膜功能障礙[2]。

有報道顯示乳酸菌作為腸道益生菌，可直接在腸道發揮抗氧化作用，通過維持腸道氧化還原平衡狀態來維持腸道健康[3]，但是乳酸菌的不同菌種或不同菌株間的特性存在顯著差異。Amanatidou等[4]對19 株乳酸菌進行對比研究，結果顯示多數乳酸菌的無細胞提取液對羥自由基有不同程度的清除能力，表明不同乳酸菌間的功能活性存在顯著性差異。在單個菌株研究方面，Ahotupa等[5]的報道顯示鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillis rhamnosus GG，LGG）具有較強的清除超氧離子自由基的能力。Eun等[6]研究證實短乳桿菌也具有較強超氧離子自由基清除能力。因，篩選出抗氧化活性高且耐受能力強的菌株對于擴大具有我國自主知識產權的益生菌菌庫、增強發酵食品的功能性具有重要的意義。

目前國內外已有報道表明對丙烯酰胺導致的腸道上皮細胞損傷具有保護作用的活性物質主要是具有抗氧化活性的天然化合物，而乳酸菌是否具有該保護作用尚未見報道。廣西巴馬長壽村的居民平均壽命超過85 歲，經調查發現，發酵米粉是他們每日必食的食物。因，本研究對發酵米粉中的乳酸菌進行分離后通過體外抗氧化模型實驗進行篩選，檢測菌株清除1,1-苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的抗氧化能力，探討DPPH自由基清除能力強的菌株——植物乳桿菌GBE17、唾液乳桿菌GBE29對丙烯酰胺所致腸上皮Caco-2細胞氧化損傷的保護作用，并對其腸道迫環境耐受能力進行評價，以期獲得對丙烯酰胺誘導腸上皮細胞氧化損傷具有保護作用的潛在益生菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：植物乳桿菌GBE17、唾液乳桿菌GBE29 （表1）；參考菌株：鼠李糖乳酸桿菌（L G G，ATCC53103）由中國農業大學食品科學與營養工程學院提供；人結腸腺癌細胞系Caco-2 武漢普諾賽生命科技有限公司。

表 1 不同來源的乳酸菌Table 1 Lactobacillus strains isolated from different sources

細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；MEM細胞培養液、0.25%胰酶（含0.02% EDTA）、胎牛血清 美國Sigma公司；細胞培養瓶及培養板 美國Corning公司；青鏈霉混合液（100×）、甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Solarbio公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 美國HyClone公司；噻唑藍（methyl thiazol tetrazolium bromide，MTT）、非變性細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒 南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 菌液準備

將菌株以2%的接種量接種于MRS肉湯中，37 ℃恒溫培養12 h，并傳至3 代備用。將活化好的菌液，6 000h g、4 ℃離心10 min，收集上清液，經0.22 μm濾膜過濾所得濾液即為發酵上清液；菌體沉淀用無菌PBS（pH 7.4）洗滌3 次，重懸于PBS中，調整細菌的濃度約為1h 109CFU/mL，并用細胞破碎儀冰浴超聲進行破碎，400 W間歇4 s，破碎5 min后，12 000h g離心10 min，收集上清液即為無細胞提取物[2]。

1.3.2 DPPH自由基清除實驗

參照文獻[7]所述方法，略有改進，其中空白調零，蒸餾水-乙醇（1∶1，V/V）。反應時，2 mL待測液中加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，室溫下避光反應30 min。 3 500h g離心10 min，取上清液，用紫外-可見分光光度計在517 nm波長處測定吸光度。

1.3.3 16S rDNA序列分析

將篩選出抗氧化性強的菌株進一步做16S rDNA序列分析。采用細菌基因組提取試劑盒說明書方法提取試驗菌株基因組D N A。以試驗菌株D N A 為模板，根據細菌的16S rDNA序列設計引物。上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR擴增體系及反應條件參見文獻[7]，引物和擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和測序。將PCR產物測序結果與GenBank中已知16S rDNA序列進行同源性比較，從GenBank中選擇近緣菌株的16S rDNA基因序列，用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹。

1.3.4 細胞培養

Caco-2細胞以MEM完全培養液（含20%胎牛血清和1%青鏈霉雙抗溶液）于37 ℃、5% CO2的飽和濕度環境中靜置培養，每2 d換液一次。

1.3.5 Caco-2細胞氧化損傷模型的建立

參照文獻[8]，采用MTT法確定構建氧化損傷模型所需丙烯酰胺濃度，具體操作如下：將處于對數生長期的Caco-2用胰蛋白酶消化成單層細胞，制成單個細胞懸液，以2h 104個/mL的細胞密度接種于96 孔板中培養，待細胞貼壁后開始實驗。PBS清洗3 次，向每孔加入1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L的丙烯酰胺100 μL，處理24 h。吸取培養液，PBS清洗3 次后，每孔加入20 μL終質量濃度為0.5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h，終止培養，吸去孔內MTT，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃低速振蕩10 min，在490 nm波長處測量各孔OD值，并計IC50，確定丙烯酰胺的最佳誘導濃度。細胞存活率計公式如下：

1.3.6 試驗細胞分組

待細胞貼壁鋪滿板底80%以上，胰酶消化，取對數生長期增殖活躍的細胞隨機分組。試驗細胞分組如表2、3所示。治療組中，除空白對照外，各處理組均用含9.8 mmol/L丙烯酰胺的MEM基礎培養基作用24 h，棄上清液，PBS清洗細胞3 次，孵育4 h。干預組中，各處理組先用丙烯酰胺與細胞預處理4 h后，3 500h g離心10 min收集上清液，經0.22 μm濾膜過濾后所得的濾液孵育細胞24 h。

表 2 治療組細胞分組處理方式Table 2 Experimental grouping for therapeutic effect evaluation

表 3 干預組細胞分組處理方式Table 3 Experimental grouping for preventive effect evaluation

1.3.7 乳酸菌對氧化損傷的細胞形態學的影響

參照文獻[9]，將處于對數生長期的Caco-2細胞用胰酶消化收集，制成105個/mL的細胞懸液，接種于12 孔板，常規培養待細胞貼壁后按表2模型的方法分組處理后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照，比較空白對照組、氧化損傷組、干預組及上清組細胞形態的不同。

1.3.8 測定指標

收集各組細胞培養上清液。每孔用無菌PBS迅速洗滌3 次，均加入150 μL非變性細胞裂解液，充分混勻，冰浴30 min。12 000h g離心5 min，收集上清液即為細胞裂解液。細胞培養上清液與細胞裂解液按試劑盒說明書步驟測定SOD、CAT、GSH和LDH活性，以及胞內總蛋白含量。

調pH值：用0.1 mol/L鹽酸溶液將MRS肉湯的pH值調為3.0、2.5，以pH 6.5的MRS肉湯作為對照組。

調膽鹽濃度：將配制好的MRS肉湯按質量分數0.05%、0.1%加入膽鹽。

平板計數：將活化好的植物乳桿菌GBE17和唾液乳桿菌GBE29三代菌液在4 ℃、5 000h g離心10 min，菌體分別用pH值為3.0、2.5及膽鹽質量分數為0.05%、0.1%的MRS肉湯洗滌1 次后，重懸于對應pH值和膽鹽濃度的等體積MRS肉湯中，37 ℃培養。取培養時間為0、1、2、3、4 h進行梯度稀釋，選取合適的梯度進行平板計數。

1.4 數據統計分析

實驗數據采用f s表示，組間均數比較采用SPSS 16.0統計軟件，單因方差分析并用LSD法進行多重比較，采用GraphPad Prism 6與MEGA 6.0作圖。差異顯著，P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的DPPH自由基清除能力

由表4可知，不同試驗菌株的DPPH自由基清除能力之間具有差異，同一株菌不同組分的清除能力也具有顯著區別，發酵上清液的抗氧化能力均比無細胞提取物強，表明本研究試驗菌株中具有DPPH自由基清除能力的活性物質主要為胞外代謝產物，分布在發酵上清液中，這與黃玉軍等[10]的實驗結果一致。為了排除培養基質對實驗結果的影響，本研究也對MRS培養基的DPPH自由基清除率進行測定，表明其不具有顯著的抗氧化性，這與劉天祎等[11]實驗中發現培養基中的營養物質對清除率影響很小的結果一致。

菌株發酵上清液清除率測定結果顯示：植物乳桿菌GBE17（89.44%）、唾液乳桿菌GBE29（79.24%）＞植物乳桿菌N1大（36.53%）；而在破碎細胞的抗氧化能力上，植物乳桿菌GBE17（82.54%）＞植物乳桿菌N1大（30.34%）＞唾液乳桿菌GBE29（17.15%）。由推斷，發酵上清液與破碎細胞的抗氧化能力者之間不存在直接相關性，在同一菌屬下的不同菌株在抗氧化的能力上也存在顯著性的差異，乳酸菌抗氧化能力的強弱與其所在菌屬無相關性。

本研究中植物乳桿菌GBE17（89.44%）和唾液乳桿菌GBE29（79.24%）的DPPH自由基清除能力均顯著高于其他18 株菌。劉少敏[12]研究利用相同的檢測方法，發現鼠李糖乳桿菌ATCC53103發酵上清液中的DPPH自由基清除率為53.21%，可見本試驗菌株具有較好的清除DPPH自由基能力。

表 4 試驗菌株DPPH自由基清除率測定結果Table 4 DPPH radical scavenging activity of Lactobacillus %

2.2 16S rDNA序列分析

菌株GBE17和GBE29擴增后得到1 600 bp左右的DNA序列。將結果在NCBI數據庫中比對并構建系統發育樹，見圖1、2。由系統發育樹可知，菌株GBE17與L. plantarum strain KAI9（KM485570.1），GBE29與 L. salivarius strain L5（KP317678.1）有最接近的親緣關系，相似度達到99%。

圖 1 基于16S rDNA序列的GBE17系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of strain GBE17 based on 16S rDNA sequence

圖 2 基于16S rDNA序列的GBE29系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain GBE29 based on 16S rDNA sequence

2.3 模擬腸道的耐受性評價

由圖3可知，3 株菌在pH 6.5的條件下，經過4 h的培養，菌落數均有顯著增加，存活數均高于109CFU/mL，可見該pH值條件適合乳酸菌的生長。在低pH值和高膽鹽濃度的培養條件下，經過4 h，3 株菌的存活數均高于107CFU/mL，可見試驗菌株仍能夠耐受一定的液酸度和膽鹽濃度，在腸道內存活并定植，發揮良好的益生功能。

圖 3 試驗菌株對不同pH值和膽鹽的耐受性Fig. 3 Acid and bile salt tolerance of Lactobacillus

2.4 植物乳桿菌GBE17和唾液乳桿菌GBE29對丙烯酰胺誘導Caco-2細胞損傷的保護作用

2.4.1 丙烯酰胺濃度對Caco-2存活率的影響

采用濃度為0.0（空白對照組）、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L丙烯酰胺處理Caco-2細胞24 h，構建氧化損傷細胞模型，結果如圖4所示。

圖 4 丙烯酰胺對Caco-2的氧化損傷Fig. 4 Acrylamide induced oxidative damage in Caco-2 cells

由圖4可知，1.25 mmol/L丙烯酰胺處理24 h可刺激細胞的增殖，這與陸惠萍[17]和沈洋[18]的研究結果一致，可能與低濃度的丙烯酰胺刺激細胞生長的信號通路有關。2.5、5.0、10.0 mmol/L及20.0 mmol/L的丙烯酰胺均可對Caco-2細胞造成不同程度的損傷，表現在Caco-2存活率降低，且存活率與丙烯酰胺呈劑量相關性變化。經計可得，丙烯酰胺對Caco-2細胞的半致死劑量約為9.80 mmol/L，因本實驗選取9.80 mmol/L丙烯酰胺作為最佳誘導濃度，構建Caco-2氧化損傷模型，時細胞存活率為50%。

2.4.2 試驗菌株對氧化損傷的細胞形態學的影響

圖 5 分組處理后Caco-2細胞形態圖（×400）Fig. 5 Morphology of Caco-2 cells subjected to different treatments (× 400)

由圖5可見，正常的Caco-2細胞貼壁生長，細胞形態呈鋪路石狀，無接觸抑制，密度均勻。經9.80 mmol/L丙烯酰胺作用24 h后，部分細胞漂浮，細胞出現皺縮、變圓或橢圓形，折光率增強，細胞成團或簇狀分布[17]，表明細胞受到嚴重不可逆的損傷。植物乳桿菌GBE17上清組和干預組對Caco-2細胞造成的損傷程度較模型組明顯減小，細胞形態更為正常，大部分細胞貼壁，皺縮程度減輕，密度均勻。由可知，植物乳桿菌GBE17上清組和干預組均可保護細胞膜的完整性，減輕丙烯酰胺所致Caco-2細胞的氧化損傷。

值得注意的是，形態學方法無法觀察到乳酸菌上清組與干預組以及各菌株之間的顯著差異，且乳酸菌完整菌體組因乳酸菌菌體的干擾，無法觀察到Caco-2細胞，因具有一定的局限性。為了進一步探究不同乳酸菌及其發酵產物對Caco-2細胞抗氧化損傷的干預及保護作用，對細胞培養上清液、細胞裂解液中的抗氧化物酶和抗氧化物質進行測定。

2.4.3 細胞培養上清液及細胞裂解液的抗氧化活性

細胞在凋亡或者壞死過程中細胞膜的結構會遭到破壞，致使胞漿內的LDH釋放到培養液中，胞外LDH水平在一定程度上能反映出細胞受損程度，因而常作為判斷細胞氧化損傷程度的重要參數[16]。抗氧化防御系統中的SOD可清除超氧離子自由基，使之發生歧化反應，生成氧化活性較低的H2O2和H2O，是細胞防御氧化應激最主要的作用。CAT是防止氧化酶氧化失活的一種重要酶類，也可同其他氧化酶將H2O2還原成H2O，減少機體的損傷。GSH是一種低分子自由基清除劑，是谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GPX）、谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathione S-transferase，GST）2 種酶的底物，為這2 種酶分解氫過氧化物所必需[19]。通過以上指標的測定，可以很好地反映出對細胞氧化損傷的保護作用。

針對胞外上清液中LDH測定結果（表5）顯示，氧化損傷組中Caco-2上清液LDH活性（12.22 U/L）顯著高于空白對照組（1.11 U/L），表明9.80 mmol/L的丙烯酰胺對Caco-2細胞造成了損傷，破壞了細胞膜結構，胞內LDH釋放到上清液中，模型建立成功；VC陽性對照組、乳酸菌治療組（除去GBE29上清組）及干預組均顯著低于氧化損傷組，表明乳酸菌可以保護丙烯酰胺所致的Caco-2細胞氧化損傷。

表 5 細胞上清液的抗氧化活性Table 5 Antioxidant capability of cell culture supernatants

針對Caco-2胞外上清液的SOD、CAT測定結果 （表5）顯示，乳酸菌治療組活細胞組＞乳酸菌干預組＞ 乳酸菌治療組上清組，這些處理組的SOD、CAT活性不僅顯著高于模型損傷組（0.55、0.05 U/mL），還顯著高于陽性對照組（1.04、0.14 U/mL）及空白處理組（1.88、3.03 U/mL）。其中，乳酸菌治療組中GBE17及GBE29活細胞的SOD活性分別高達9.62 U/mL和8.77 U/mL， CAT活性分別高達4.14 U/mL和4.67 U/mL。對于同一株菌而言，乳酸菌治療組中，各菌株活細胞的SOD、CAT水平顯著高于各對應菌株的上清液組，可能因為活細胞結構完整，其胞內包含了一整套抗氧化酶系統，其抗氧化作用高于胞外分泌物。對于不同菌株而言，SOD水平的高低不能反映CAT水平的高低，如乳酸菌干預組中，GBE17的SOD水平顯著低于GBE29，但CAT水平卻高于GBE29。因細胞內自身的抗氧化酶系統的內源性調節是個極為復雜的過程[18]，不同的抗氧化酶發揮其抗氧化作用的方式和清除能力也不同，所以者水平的高低之間無必然聯系。

針對Caco-2胞外上清液的非酶抗氧化物質GSH測定結果（表5）顯示，乳酸菌治療組中GBE17和GBE29的活細胞組顯著高于氧化損傷組（1.35、1.14 μmol/L）。 上清組中，GBE29的GSH水平雖然小于氧化損傷組，但差異不顯著，不具有統計學意義（P＞0.05）。乳酸菌干預組中GBE17和GBE29的GSH水平（2.54、2.23 μmol/L）顯著高于氧化損傷組（1.35 μmol/L）。同時研究發現，在乳酸菌治療組中，GBE17上清組的SOD、CAT和GSH水平高于GBE29，LDH水平低于GBE29，這與GBE17的體外DPPH自由基清除率高于GBE29相吻合，提示體外DPPH自由基清除率可能反映體內的抗氧化酶和抗氧化物質水平，關于其具體的關系需要進一步地探討。

為了檢測胞內抗氧化物質和酶活的變化，對各處理組中細胞裂解液進行測定。針對細胞裂解液中的SOD測定結果（表6）顯示，GBE17和GBE29治療組及預防組均顯著高于氧化損傷組。針對CAT測定結果顯示，雖然GBE17、GBE29完整菌體組和GBE29上清組的水平低于氧化損傷組，但差異不顯著，不具有統計學意義 （P＞0.05）。結果表明，當細胞受到氧化損傷時，GBE17和GBE29能夠通過提高胞內抗氧化酶SOD活性，減輕丙烯酰胺造成的細胞氧化損傷。

表 6 細胞裂解液的抗氧化活性Table 6 Antioxidant capability of cell lysates

針對非酶抗氧化物質GSH測定結果發現，GBE17、GBE29完整菌體組和GBE29上清組均顯著低于氧化損傷組（P＜0.05）。已有研究表明，當受到酸、冷迫時，細胞通過消耗少量的GSH抵御迫[20-21]，因推斷當細胞受到氧化迫時，GSH同以“自殺式”消耗方式發揮其在迫條件下的保護作用，關于GSH在氧化迫條件下發揮其作用方式的具體機制還需更深入地研究[15,22-23]。研究發現，因菌株具有菌種特異性，其抗氧化物質存在的部位不同、清除自由基的活性成分不同[24-25]，對于丙烯酰胺誘導的Caco-2細胞氧化損傷的治療與預防效果也大不相同，因不能判斷何種方式對細胞的保護效果最佳。

綜上所述，當細胞受到丙烯酰胺誘導的氧化損傷時，GBE17的治療組與干預組和GBE29的干預組均可降低LDH的釋放，提高細胞內外抗氧化酶SOD、CAT活性。可能通過消耗部分非酶抗氧化物質GSH保護氧化損傷的細胞，體外DPPH自由基清除率結果可能反映出體內的抗氧化酶和抗氧化物質水平。

3 結 論

本研究通過測定不同乳酸菌的無細胞發酵上清液及細胞內容物的DPPH自由基清除率，篩選出2 株抗氧化能力強的菌株，為植物乳桿菌GBE17和唾液乳桿菌GBE29，其自由基清除能力遠高于ATCC標準菌株。細胞形態觀察及細胞內外的抗氧化物活性測定結果表明，丙烯酰胺可以導致腸上皮細胞的氧化損傷，GBE17的治療組與干預組和GBE29的干預組均可降低LDH的釋放，提高細胞內外抗氧化酶SOD、CAT活性。同時兩株乳桿菌在pH 3.0和膽鹽質量分數0.1%的環境下處理4 h，存活數均高于107CFU/mL，綜上所述，植物乳桿菌GBE17和唾液乳桿菌GBE29對丙烯酰胺引起的細胞氧化損傷具有明顯的抑制作用，能夠改善丙烯酰胺導致的腸道損傷。本研究結果為預防和緩解丙烯酰胺致毒提供了新的思路和方法，同時為開發功能性乳酸菌提供一定的科學依據。