面向規模化應用的竹蓀多糖液態深層 發酵工藝優化

馮 杰，馮 娜，劉艷芳，唐慶九，周 帥，劉 方，張勁松，楊 焱

（農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，上海市農業科學院食用菌研究所，上海 201403）

竹蓀又名竹笙、竹參，在真菌分類學上隸屬于真菌界（Eumycotina）、擔子菌亞門（Basidiomycotina）、腹菌綱（Gasteromycetes）、鬼筆目（Phallales）、鬼筆科（Phallaceae）、竹蓀屬（Dictyophora）[1-2]。竹蓀具有一定的防腐作用，具有較高的營養保健價值，被人們譽為“真菌皇后”，是一種集營養、保健、理療于一身的綠色食品。竹蓀子實體中富含蛋白質、氨基酸、多糖、維生、微量元等，具有抗腫瘤、抗菌、抗血栓、降血脂、增強人體免疫力等生物活性。

竹蓀多糖是竹蓀中的主要生物活性成分之一，目前關于竹蓀多糖結構的研究，多數還都只是停留在竹蓀多糖組成上，對其分子結構及構象的研究報道較少，有研究者做過竹蓀多糖鏈的一級結構研究[3]。趙凱等[4]研究了竹蓀多糖提取物，得到的竹蓀多糖化學結構主要是β-甘露糖；而連賓等[5]從竹蓀中提取的多糖化學結構為半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖雜多糖。王家堂等[6]所用的方法則與上述有所不同，其采用衍生化后通過氣相分析、紅外圖分析和核磁共振分析方法證明出：竹蓀多糖以葡萄糖為主，并同時含有半乳糖和甘露糖，為均一的多糖組分，分子構型為β型，且竹蓀多糖也是以β-(1,3)-D-葡聚糖為主鏈，帶有(1,6)葡萄糖支鏈的化學結構。

竹蓀子實體人工栽培周期長且容易污染雜菌，受病蟲害侵蝕，耗費人力多、場地大，栽培環境受海拔與溫度影響十分明顯，生產規模受到一定限制[7-8]。 而深層發酵技術是較為先進的技術，其特點是發酵周期短、勞動生產率高、勞動強度低、占地面積少等[9]。采用深層發酵技術直接生產竹蓀營養菌絲體，可以克服上述不足，不僅可將獲得的菌絲體作為液體菌種或食品添加劑，還可從中提取生理活性物質，這為竹蓀生產及深加工開創了新路[10-11]。

目前國內外關于深層發酵竹蓀菌絲體及發酵液多糖的研究報道較少，較多為對其抗氧化性能與抗菌性的檢測，或是對其氨基酸含量的分析與自由基清除能力的檢驗[12-13]。國內外也有少量研究者對竹蓀的深層發酵進行研究，但其主要側重點是如何獲取更高的生物量[14-15]。只有少部分研究者關注竹蓀的功效成分多糖，但往往都僅局限于小試的搖瓶實驗，屬于基礎研究階段，并且其生物量和活性產物多糖得率比較低，生產成本高，其工藝需進一步提升，若要達到規模化和產業化的生產竹蓀多糖還需進行大量的研究[16-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

供試菌株Dictyophora indusiata ZS03，由中國微生物菌種保藏管理委員會農業微生物中心上海食用菌分中心提供。

1.1.2 培養基

斜面和平板培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基）購自美國BD公司，按照39 g溶于1 000 mL蒸餾水的比例配制，121 ℃滅菌20 min 后備用。

種子培養基：葡萄糖30 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸氫鉀2 g/L，硫酸鎂2 g/L，121 ℃條件下滅菌30 min后備用。

發酵基礎培養基：葡萄糖30 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸氫鉀2 g/L，硫酸鎂2 g/L，121 ℃條件下滅菌30 min后備用。

1.2 儀器與設備

ZWY-2102雙層恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；BIOTECH-5BGZ-50JS 5 L和50 L發 酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；Synergy HT多功能酶標儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 培養條件

菌株活化：將配制好的平板培養基于121 ℃條件下滅菌20 min后倒入9 cm平板冷卻備用。在無菌條件下挑取冷凍管保藏菌種于平板培養基中，在26 ℃恒溫箱中培養，待菌絲長滿平板后備用。

種子液培養：將平板活化后的菌株取3 塊約0.2 cm2大小的菌塊接種于裝有100 mL液體種子培養基的250 mL三瓶中，在搖床上于26 ℃、150 r/min培養7 d得種子液。

發酵罐培養：將制備好的液體菌種分別轉接至5、30 L和50 L發酵罐中進行培養，發酵罐裝液量為總體積的70%，接種量10%（V/V），攪拌轉速100 r/min，培養溫度26 ℃，通氣比1.0 L/（Lg min），培養至144 h 結束發酵。

1.3.2 指標測定

菌絲體干質量的測定：取發酵液50 mL，15 000h g離心20 min后棄上清液，沉淀的菌絲體用去離子水洗滌 3 次，收集菌絲體后放在60 ℃的烘箱中烘干至質量恒定，精確稱質量[18]，以g/L計。每組實驗設定3 個平行，測定平均值。

總糖的測定：將烘干后的竹蓀菌絲體研磨成粉末，稱取100 mg加入100 mL蒸餾水，沸水浴提取3 h。冷卻后定容至100 mL，將溶液15 000h g離心15 min后取上清液備用[10]。取稀釋一定倍數的上清液品1 mL到試管中（設3 個重復），加入5%苯酚（重蒸苯酚）0.5 mL，混勻，再加入2.5 mL濃硫酸，振蕩，沸水浴中加熱15 min后在冷水下迅速冷卻，用酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度，根據標準曲線計出總糖含量[11]，總糖含量以占干菌絲質量分數計（%）。

還原糖的測定：將總糖測定時制備的上清液稀釋一定倍數，取稀釋后的品液2 mL到試管中（設3 個重復），加入3 mL 3,5-硝基水楊酸試劑，混勻，沸水浴中加熱5 min，流動水冷卻后用蒸餾水定容至25 mL，搖勻后用酶標儀在520 nm波長處檢測吸光度，根據標準曲線計出還原糖含量[20]，還原糖含量以占干菌絲質量分數計（%）。

1.3.3 工藝優化

1.3.3.1 竹蓀多糖發酵培養基中碳源和氮源種類的篩選

碳源的篩選：在供試基礎液體培養基中分別添加 30 g/L葡萄糖、30 g/L蔗糖和30 g/L麥芽糖為碳源。基礎培養基選用酵母粉1.5 g/L、磷酸氫鉀2 g/L、硫酸鎂2 g/L，研究不同碳源對竹蓀胞內多糖發酵的影響。各實驗設3 個重復。

氮源的篩選：在供試基礎液體培養基中分別添加1.5 g/L酵母粉、1.5 g/L玉米粉和1.5 g/L黃豆粉為氮源。基礎培養基選用葡萄糖30 g/L、磷酸氫鉀2 g/L、硫酸鎂2 g/L，研究不同氮源對竹蓀胞內多糖發酵的影響。各實驗設3 個重復。

根據上述培養基中碳源和氮源種類篩選結果，選擇最佳碳源中的葡萄糖和氮源中的酵母粉用量2 個因，分別考察每種因在4 個水平下的竹蓀胞內多糖得率，因與水平設計如表1所示。

表 1 竹蓀多糖培養基中碳源和氮源單因素篩選Table 1 Levels of carbon and nitrogen sources used in one-factor-at-a-time design

1.3.3.3 Box-Behnken法優化竹蓀多糖發酵培養基設計

表 2 Box-Behnken法優化竹蓀多糖發酵培養基的因素與水平Table 2 Codes and levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.4 數據與圖像處理

數據采用Excel 2013軟件進行處理，應用Origin 8.5軟件進行繪圖，應用DPS v7.05軟件進行顯著性分析，利用Design Expert V8.0.6軟件對數據進行回歸分析。

2 結果與分析

2.1 竹蓀多糖發酵培養基中碳源和氮源種類的篩選

圖 1 發酵培養基中碳源和氮源種類對竹蓀菌絲體和胞內多糖發酵的影響Fig. 1 Effects of carbon and nitrogen sources on mycelial biomass and polysaccharide production by D. indusiata

由圖1可以看出，碳源種類對竹蓀菌絲體液態深層發酵菌絲體和胞內多糖得率有明顯影響，其影響由高到低依次為葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，差異極顯 著（P＜0.01）。實驗結果表明葡萄糖是最適合菌絲體生長產生胞內多糖的碳源。在不同種類的氮源實驗中，竹蓀菌絲體干質量由高到低的氮源依次為酵母粉、黃豆粉和玉米粉（P＜0.01），竹蓀胞內多糖得率由高到低的氮源依次為酵母粉、玉米粉和黃豆粉（P＜0.01）。實驗結果表明酵母粉是最適合菌絲體生長產生胞內多糖的氮源。

2.2 竹蓀多糖發酵培養基中碳源和氮源用量的單因優化

圖 2 發酵培養基中葡萄糖（A）和酵母粉（B）用量對竹蓀菌絲體和 胞內多糖發酵的影響Fig. 2 Effects of glucose (A) and yeast power (B) concentration on mycelial biomass and polysaccharide of D. indusiata

如圖2A所示，葡萄糖用量由15 g/L增加到60 g/L時，竹蓀菌絲體干質量和胞內多糖得率有大幅度提升。葡萄糖用量為30 g/L時，竹蓀菌絲體干質量和胞內多糖得率最高，分別為9.72 g/L和0.89 g/L，葡萄糖用量繼續增加時，其菌絲體干質量和胞內多糖得率反而有小幅度減少。分析原因可能是過高的葡萄糖用量會抑制竹蓀菌絲體的生長，進而影響胞內多糖的合成，因，合適的葡萄糖用量對竹蓀胞內多糖的合成影響較大。從單因試驗結果可知，30 g/L是竹蓀菌絲體液體發酵胞內多糖最佳葡萄糖用量。

如圖2B所示，當酵母粉用量為4.5 g/L時，竹蓀菌絲體干質量和胞內多糖得率最高，分別為9.95 g/L和 0.88 g/L。當酵母粉用量增加至6.0 g/L時，其多糖得率開始降低。這可能是由于高用量的酵母粉對菌絲體的生長產生了抑制作用。根據單因試驗結果，4.5 g/L是竹蓀菌絲體液態深層發酵胞內多糖最佳酵母粉用量。

2.3 Box-Behnken法優化竹蓀多糖的發酵培養基組成

2.3.1 模型建立和顯著性檢驗

表 3 Box-Behnken法優化竹蓀多糖的發酵培養基組成Table 3 Box-Behnken design with experimental results

利用Design Expert V8.0.6軟件對數據進行次多元回歸擬合，得到竹蓀菌絲體液態深層發酵胞內多糖得率（Y）對編碼自變量之間的次多項回歸方程為：

方差分析檢驗多項式方程對試驗數據擬合的顯著性，如表4所示。次方程模型的F值為12.59，表明該模型顯著，可以有效擬合試驗數據，該模型F值由于噪音因影響發生的P值小于0.01。從表4可以看出，X1、X3、X4、X1X4、X3X4、X12、X22、X32和X42是顯著項。整個模型的擬合度R2為0.926 4，表明該次方程模型可以解釋和預測92.64%的變量響應，在本研究中可以很好地擬合試驗數據。

表 4 Box-Behnken法優化竹蓀多糖的發酵培養基組成方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model

2.3.2 驗證實驗

2.3.2.1 搖瓶驗證實驗

表 5 Box-Behnken法優化竹蓀多糖的發酵培養基組成搖瓶 實驗驗證結果Table 5 Results of confirmation using shake flask experiments

2.3.2.2 發酵罐驗證實驗

為更好地將上述響應面的優化結果應用于實際生產，對響應面模型得出的最佳條件結合發酵罐的最佳控制條件（本研究團隊前期研究基礎）分別在5、30 L和50 L規模發酵罐中進行逐步擴大實驗。由圖3A可知，在5 L發酵罐上，竹蓀菌絲體在0～48 h增加較少，之后進入對數期，大幅度增加，在第144小時達到最大值16.11 g/L；胞內多糖在穩定期合成較少，進入對數期后穩定增多，在第144小時達到最大值1.43 g/L。由圖3B可知，在30 L發酵罐上，竹蓀菌絲體在0～24 h增加較少，之后進入對數期，大幅度增加，在第144小時達到最大值12.10 g/L；胞內多糖在穩定期合成較少，進入對數期后穩定增多，在第144小時達到最大值1.28 g/L。由圖3C可知，在50 L發酵罐上，竹蓀菌絲體在0～24 h增加較少，之后進入對數期，大幅度增加，在第144小時達到最大值13.69 g/L；胞內多糖在穩定期合成較少，進入對數期后穩定增多，在第144小時達到最大值1.26 g/L。綜合圖3分析可知，在不同發酵規模下，竹蓀菌絲體的生長較為一致，隨著菌絲體生長進入對數期后，胞內多糖的合成也進入快速增長階段，當菌絲體生長進入穩定期后，胞內多糖的合成也基本達到最大值。在發酵罐控制條件一致時，不同發酵規模下的竹蓀菌絲體生長基本一致，胞內多糖的含量也很穩定，因，本研究獲得的發酵條件可以考慮進一步繼續放大以應用于工業化生產。

圖 3 在5 L（A）、30 L（B）和50 L（C）發酵罐中優化培養基條件下竹蓀多糖發酵過程曲線Fig. 3 Time-course curves of mycelial biomass and polysaccharide production by D. indusiata using the optimized medium in 5 L (A), 30 L (B) and 50 L (C) fermentors

2.4 不同發酵規模下竹蓀多糖的發酵參數比較

為更好地比較不同發酵規模下竹蓀胞內多糖的發酵結果，將實驗數據進一步整理，得到5、30 L和50 L發酵罐條件下竹蓀菌絲體液態深層發酵過程參數，如表6所示。結合Box-Behnken法優化結果，竹蓀菌絲體液態深層發酵過程參數比對照組有顯著提高。5、30 L和50 L發酵罐驗證實驗中的菌絲體干質量、菌絲體對葡萄糖得率、胞內多糖得率、胞內多糖質量分數、胞內多糖生產強度和胞內多糖對葡萄糖得率均優于對照組結果，且在不同規模下的發酵結果也很穩定，沒有較大的波動，可見優化后的培養條件有助于提高竹蓀菌絲體中的胞內多糖，且隨著發酵規模的逐步擴大結果也很穩定。

表 6 在不同規模發酵罐中優化培養基條件下竹蓀多糖發酵參數比較Table 6 Comparison of fermentation parameters for production of D. indusiata polysaccharides using the optimized medium in 5-, 30- and 50-L fermentors

3 討 論