傳統大豆發酵食品中納豆芽孢桿菌的 分離及納豆發酵

劉彥敏，沈 璐，王 康，嚴金平，伊日布斯

（昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500）

納豆是大豆經枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發酵而成的一種傳統食品。1906年Swamula[1]首次從納豆中篩選到了枯草芽孢桿菌屬的新型菌株，將其命名為納豆芽孢桿菌（B. subtilis natto）。納豆芽孢桿菌可合成納豆激酶，生產以聚谷氨酸（poly-L-glutamic acid，γ-PGA）為成分的黏性物質，以及具有生物缺陷型特性，以上特點是其區別于其他枯草芽孢桿菌的主要性狀[2-3]。因其芽孢結構具有耐受各種環境迫的能力[4]，能在腸道中定植生長，促進機體對營養物質的分解與吸收。同時納豆芽孢桿菌發酵的納豆還具有溶解血栓、降血壓、預防骨質疏松、抗氧化和增強機體的免疫等功能[5]。

1987年Sumi等[6]首次從納豆中純化出納豆激酶，并在后續研究中證明了納豆激酶具有溶解血栓、降低血黏度、改善血液循環、軟化和增加血管彈性等作用。從納豆及納豆芽孢桿菌引起了前所未有的關注。國內外的科研工作者陸續從傳統的發酵豆制品中篩選到了產納豆激酶菌株。Jeong等[7]從韓國傳統豆醬（doenjang）中篩選到產γ-PGA、α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶并可發酵低鹽豆醬的菌株D2-2和D12-5。我國學者也從中國的傳統發酵豆制品中篩選到了高產納豆激酶、拉絲效果良好、具有光抗菌活性和熱穩定性的納豆發酵菌株[8-12]。董明盛等[13]從中國豆豉中篩選到有明顯纖溶活性的納豆芽孢桿菌株NK-5，試制的納豆在4 ℃貯存兩個月仍能保持70%納豆激酶活力。王成濤等[14]從中國的24 種豆制品中篩選到高產纖溶酶的菌株BN-6，纖溶酶活性達900 U/mL。

枯草芽孢桿菌廣泛分布于自然界的不同環境中，研究證明其16S rRNA基因序列不能明確區分其不同表型性狀的亞種和菌株，Qin Huibin[15]和Xu Dong[16]等利用內轉錄間隔區序列（internal transcribed spacer，ITS），對枯草芽孢桿菌種內的不同菌株進行了系統發育學分析。

目前，我國的納豆生產菌株依賴進口，工業菌株和生產工藝的開發滯后，再加上我國消費者對納豆感官的不適應等問題嚴重限制了我國納豆產業的發展。我國傳統大豆發酵食品歷史悠久，但對大豆發酵食品的發酵菌株和功能菌株的研究還較少。本研究以蛋白酶、納豆激酶、產γ-PGA性能和生物依賴特性為篩選指標，從傳統大豆發酵食品和稻草中分離獲得8 株具有典型納豆芽孢桿菌特性的枯草芽孢桿菌菌株，進行形態學和系統發育分析，進一步通過納豆發酵實驗獲得具有納豆激酶活性、感官效果良好的本地化納豆食品，以期獲得有良好的商業化前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆醬由河南省新鄉市家庭自制；豆豉由云南省騰沖市家庭自制；稻草 云南省玉溪市農家。

1.1.2 參考菌株

市售納豆發酵劑中純化的菌株B. subtilis natto NR（簡稱NR） 日本成瀨發酵化學研究所；市售納豆發酵劑中純化的菌株B. subtilis natto MG（簡稱MG） 日本宮城野納豆制作研究所；市售納豆發酵劑中純化的菌株B. subtilis natto KT（簡稱KT） 日本高橋保藏研究所；B. subtilis 168菌株（簡稱168，不能產納豆的枯草芽孢桿菌，作為納豆發酵的負對照菌株） 廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.3 培養基與試劑

NBP培養基：1%牛肉膏、1%大豆蛋白胨、0.5% NaCl、2%瓊脂，pH 7.0。

蛋白酶活性菌株篩選的培養基（脫脂奶培養基）：10%脫脂奶、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl、2%瓊脂，pH 7.2～7.4。

產細胞外黏性多糖菌株篩選的培養基（GSP培養基）：3%蔗糖、1.5%大豆蛋白胨、0.25% KH2PO4、0.17% Na2HPO4、0.05% NaCl、0.05% MgCl2g 7H2O、1.5%一水合谷氨酸鈉、100 μg/L生物、2%瓊脂。

Taq Buffer、dNTP、Taq酶 北京全式金生物技術有限公司；尿激酶 上海源葉生物科技有限公司；纖維蛋白酶原、凝血酶（100 U/mL） 西格瑪奧德里奇 （上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

PH104A恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；4802UV/VIS紫外-可見光分光光度計 尤尼科儀器有限公司；G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 至微儀器有限公司；DM顯微鏡 徠卡儀器（德國）有限公司；RH basic 2磁力攪拌器 德國IKA公司；SSW-420-2S恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司；THZ-072HT控溫搖床 上海申能博彩生物科技有限公司；2720 Thermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Heraeus Fresco 17R臺式低溫高速離心機 美國賽默飛世爾科技 （中國）有限公司；干式恒溫器 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌的初篩

分別稱取2 g河南豆醬、騰沖豆豉和玉溪稻草（稻草剪切成1 cm長的片段）加入50 mL 0.09%的滅菌生理鹽水中，室溫攪拌10 min后，80 ℃金屬浴加熱20 min。冷卻至室溫，進行系列梯度稀釋，稀釋后取104、105、 106、107、108五個梯度分別涂布于NBP瓊脂培養基上，每個梯度做3 個平行。涂布的平板37 ℃培養48 h后，挑取平板上獨立的菌落于NBP液體培養基中培養備用。

1.3.2 納豆芽孢桿菌的復篩

表 1 復篩的評分標準Table 1 Grading criteria for rescreening

1.3.3 納豆芽孢桿菌的初步鑒定

1.3.3.1 菌株形態學觀察觀察并記錄菌落特征；對篩選菌株的活菌和芽孢進行染色，并在顯微鏡下觀察細胞結構[17]。

1.3.3.2 納豆芽孢桿菌的系統發育分析

提取所篩菌株的基因組D N A 作為P C R 模板。合 成1 6 S r R N A 和I T S 引 物[15]（由B i o s u n e 公 司 合成），引物序列如表2所示；PCR采用25 μL體系：10h PCR Buffer 2.2 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）2.5 μL；ddH2O 17.5 μL；上下游引物（10 μmol/L）分別為0.5 μL；DNA模板1 μL；Taq酶0.5 μL。16S rRNA的PCR設定程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，共30 個循環；ITS的PCR設定程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環；使用無菌的ddH2O作為性對照。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經純化回收后交由Biosune公司測序。使用NCBI數據庫的BLAST程序對測序的16S rRNA、ITS基因序列進行同源性比對，并用MEGA 7.0軟件通過Neighbor-Joining法構建系統發育樹[18]。

表 2 PCR擴增引物序列Table 2 Sequences of primers used for PCR amplification

1.3.4 分離菌株發酵的納豆粗酶液中納豆激酶活性分析

1.3.4.1 尿激酶標準曲線

參考Kim[19]和Astrup[20]等的方法，配制纖維蛋白平板。取2.5 mL纖維蛋白原（溶解于pH 7.4、0.1 mol/L 磷酸鹽鈉緩沖液）、0.1 mL凝血酶（100 U/mL）和7.4 mL 1 g/100 mL瓊脂糖溶液加入到直徑為9 cm的無菌平板中，小心振蕩，混勻，室溫放置30 min，打孔備用。分別取2 μL 200、400、600、800、1 000 U/mL的尿激酶，每個濃度做3 個平行，點于纖維蛋白平板的孔中，37 ℃溫育8 h后，用游標卡尺測量水解圈直徑，并計溶解圈的平均面積。以溶解圈面積（mm2）為橫坐標，尿激酶濃 度（U/mL）為縱坐標，繪制尿激酶標準曲線。

1.3.4.2 納豆粗酶液中的納豆激酶活性測定

使用MG、NR、TK、168、HN72、HN10、HN48、HN35、HN67、TC100、TC103、DC21作為發酵劑，制作納豆。稱取2 g制作的納豆加入6 mL滅菌生理鹽水中，4 ℃靜置提取24 h或30 ℃振蕩提取30 min，4 ℃、10 000h g離心10 min，取2 μL上清粗酶液點于纖維蛋白平板的孔內，每個品做3 個平行，37 ℃溫育8 h；用游標卡尺測量溶解圈直徑，并計出溶解圈的平均面積；根據尿激酶標準曲線計所獲菌株制作納豆粗酶液的納豆激酶活性。

1.3.5 納豆發酵工藝及感官評價

參考奚銳華等[21]優化的納豆生產工藝。納豆的制作流程設計如下：

1.3.5.1 納豆發酵方法及要點

1）制備種子發酵液：活化2 代的菌株接種于NBP液體培養基中，37 ℃、170 r/min培養16 h；2）挑選大豆：挑選粒度小而均勻的大豆；3）清洗：用自來水清洗大豆表面的沙土、塵埃和有機物；4）浸泡：20 ℃自來水浸泡16 h（對浸泡前、后的10 粒大豆質量為2.3 倍為準，稱質量并記錄）；5）蒸煮：稱取25 g浸泡后的大豆裝入滅菌容器中（蓋有可透氣的濾膜）；121 ℃（0.1 MPa）蒸煮30 min；6）接種與發酵：活化好的種子液濃度調到1h 104CFU/mL后接種，39 ℃發酵18 h至大豆表面布滿致密白色粉末狀物質；7）后熟：4 ℃后熟24 h。

1.3.5.2 感官評價

采用4 個指標的5 分制進行評分（表3）。由10 人組成感官評價小組，采取盲評模式，去掉1 個最高分和1 個最低分，實驗設計者不參與評分，取8 個得分的平均值。其中納豆的拉絲評分是將納豆均勻攪拌2 min后，觀測黏液的量，然后用筷子挑起，以10 cm為一單位，從中間挑起，垂直拉絲10 cm為單位，再從拉起10 cm中挑起，依次重復進行，直至拉斷。

表 3 感官評價標準Table 3 Criteria for sensory evaluation

1.4 數據統計分析

每組實驗重復3 次，利用Microsoft Office Excel 2010對實驗所得數據進行處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌的篩選

表 4 8 株菌株的篩選結果Table 4 Screening results of 8 strains

2.2 分離菌株的鑒定

2.2.1 分離菌株的形態學特征

圖 1 8 株所獲菌株的形態學觀察結果Fig. 1 Morphological observations of 8 selected strains

如圖1所示，菌落表面呈乳白色或微黃色，濕潤，不透明，扁平有褶皺，菌落形態呈近圓形。革蘭氏陽性，細胞呈短桿狀，單個或鏈狀排列。在高溫、低溫、干燥、光線和化學藥物存的等不穩定的條件下產生芽孢。具有枯草芽孢桿菌的形態學特征[17]。

2.2.2 分離菌株的系統發育分析

表 5 16S rRNA序列分析Table 5 Analysis of 16S rRNA sequences

使用NCBI數據庫的BLAST程序進行序列比對[22]的結果表明所獲8 株分離菌株的16S rRNA基因序列與枯草芽孢桿菌的不同菌株顯示最高的相似性均為100% （表5）。雖然與納豆芽孢桿菌為同一物種，但是這些同源性較高的菌株中沒有檢索到納豆芽孢桿菌。

圖 2 分離菌株與商業菌株及已知納豆芽孢桿菌的ITS系統發育分析Fig. 2 Phylogenetic tree of isolated strains, commercial strains and known strains of B. subtilis natto

2.3 分離菌株納豆粗酶液中的納豆激酶活性

根據Kim等[19]方法，使用纖維蛋白平板法測定納豆粗酶液中的納豆激酶活性。不同濃度尿激酶和不同菌株發酵的納豆粗酶液在纖維蛋白平板上反應后都可見不同大小的溶解圈。尿激酶標準曲線為 y=8.103 4x909.02（R2=0.995 4），根據標準曲線計所獲菌株發酵的納豆粗酶液的納豆激酶活性。結果顯示，所有品中，納豆粗酶液中納豆激酶活性最高的菌株是市售納豆芽孢桿菌株MG和KT，活性分別為 731 U/mL和898 U/mL；本研究從騰沖家庭自制豆豉中篩選到的2 株納豆芽孢桿菌TC100和TC103的納豆粗酶液中納豆激酶活性最強，分別為550 U/mL和519 U/mL；從玉溪稻草中篩選到的納豆芽孢桿菌DC21發酵的納豆粗酶液納豆激酶活性為483 U/mL；從河南豆醬中篩選到發酵納豆粗酶液中納豆激酶活性較高的菌株是HN67和HN72，活性分別為299 U/mL和231 U/mL；除HN10、HN48、HN35，其他菌株發酵的納豆粗酶液的納豆激酶活性都高于市售納豆芽孢桿菌株NR。HN10和HN48獲得的納豆粗酶液的溶解圈面積較小，超出標準曲線的有效范圍，但肉眼能明顯觀測到它們的溶解圈（圖3）。

2.4 分離菌株的納豆發酵及感官評價

根據奚銳華等[21]的納豆生產工藝進行優化，并制定納豆的感官評價方法。所獲8 株菌株均能成功發酵納豆（圖4），經過感官評價（表6），結果顯示HN48、TC100菌株試制的納豆的感官評價分數最高，均為19 分，和市售納豆納豆芽孢桿菌菌株（MG、KT、NR）發酵的納豆（感官評分20 分）感官差異較小，發酵的納豆有納豆香味、合成黏液多，拉絲長（30～40 cm），口感滑潤。

圖 4 納豆發酵樣品Fig. 4 Photographs of natto samples

表 6 試制納豆的感官評分結果Table 6 Sensory evaluation of natto samples

3 討 論

本研究根據納豆芽孢桿菌具有產蛋白酶、γ-PGA、納豆激酶和生物缺陷4 個篩選指標[2-3]，從河南豆醬、騰沖豆豉和玉溪稻草品中的326 株產芽孢菌株中篩選到8 株：HN72、HN10、HN48、HN35、HN67、TC100、TC103、DC21。傳統的大豆發酵食品經原料和環境中微生物自然發酵而制成[23]，目前已有很多關于從傳統發酵豆豉中篩選得到納豆芽孢桿菌的 報道[6-7,10-11,24-25]。這些報道中大部分是根據納豆芽孢桿菌的一種或兩種特性，尤其是納豆激酶特性[26]為篩選指標，容易導致篩選到的產納豆激酶菌株不能生產納豆或納豆生產效果不佳的問題。目前關于傳統豆醬和稻草中篩選獲得納豆芽孢桿菌的研究不多[25,27]，本研究根據納豆芽孢桿菌特性的4 個篩選指標，從不同地區的傳統發酵豆制品和稻草中的產芽孢菌株中篩選到8 株具有納豆芽孢桿菌特征的菌株，并都能用于生產納豆。

根據分離菌株的形態特征和ITS序列分析鑒定了所獲8 個菌株為枯草芽孢桿菌的納豆芽孢桿菌亞種 （B. subtilis natto）?？莶菅挎邨U菌種內16S rRNA基因序列相對保守，通常很難用于區分物種內的不同表型性狀的菌株[28]。Qin Huibin等[15]利用ITS序列，對枯草芽孢桿菌種內的不同菌株進行了系統發育學分析[15]。本研究采用ITS序列分析分離菌株與枯草芽孢桿菌種群內的系統發育關系，將采用16S rRNA不能區分的種內關系有效區分出來[15,29]，結果顯示所篩菌株均是納豆芽孢桿菌。最近也有研究指出IS4Bsu1和IS256Bsu1是納豆芽孢桿菌特有的基因序列，可以根據IS4Bsu1和IS256Bsu1基因序列的有無鑒定納豆芽孢桿菌[30]。還有研究提出對16S rRNA和5 個其他功能基因（rpoB、purH、gyrA、groEL、polC）序列的多性進行分析，可以作為確定納豆芽孢桿菌分類地位的一種方法[28]，Kubo等[24]根據該方法從日本稻草中篩選獲得能發酵黑大豆的納豆芽孢桿菌Miyagi-4100。

本研究篩選的納豆芽孢桿菌都具有產納豆激酶和發酵大豆生產納豆的能力，根據其大豆發酵產物中納豆激酶活性，來源于云南省騰沖市家庭自制豆豉的TC100和TC103菌株的納豆激酶活性最高，分別為550 U/mL和519 U/mL。而來源于河南省新鄉市家庭自制豆醬的HN48和云南省騰沖市家庭自制豆豉的TC100菌株，發酵大豆所得納豆的感官評價最高，評價分數均是19 分。納豆激酶是一種微生物來源的蛋白酶，因具有纖維蛋白溶解活性而有別于其他蛋白酶，最初從傳統的日本大豆發酵食品納豆中被提取和純化[5]。1990年Sumi等[31]首先建立了標準纖維蛋白平板技術測定納豆的納豆激酶活性。目前已經有很多關于芽孢桿菌屬微生物能產多種纖維蛋白溶解酶的報道。而在這些酶中納豆激酶因其在體內體外均能發揮纖維蛋白溶解活性而被大眾廣泛關注[3,32]。近年來，納豆的保健功效受到越來越多研究人員及消費者的重視，世界各國對其功能因子的研究方興未艾[33]。納豆的保健功效與其發酵菌株的產酶能力尤其是納豆激酶活性密切相關。同時作為食品，納豆的外觀、拉絲、氣味和口感也是影響其商品價值的重要因，其中γ-PGA產量越高，黏液就越多，拉絲效果和口感也就越好[34]。本研究篩選得到的8 株菌株中TC100菌株是高產納豆激酶的納豆芽孢桿菌，有望作為納豆生產的候選菌株。