新老窖池黃水的差異性及靜置培養對其影響

張會敏，孟雅靜，王艷麗，李安軍，劉國英，袁志強，張 嚴，邢新會

（1.安徽省固態發酵工程技術研究中心，安徽 亳州 236820；2.清華大學化工系，北京 100084）

中國濃香型白酒發酵是重要的微生物發酵研究領域，老窖池窖泥豐富的菌群對提高白酒發酵質量具有重要作用。目前，很多研究著眼于不同窖齡的窖泥菌群組成差異[1-4]。已知，隨著窖齡增加，窖泥菌群豐度增加，窖泥逐漸老熟。窖泥的老熟本質上是窖泥菌群的老熟，窖泥菌群老熟過程中，受酒醅菌群的影響，即“萬年糟”的作用。Wang Xueshan等[5]發現酒醅中的厭氧菌主要來自窖泥，即酒醅菌群也受窖泥菌群的影響。窖泥菌群和酒醅菌群具有相互影響的關系，黃水對維系兩個固體菌群的相互關系具有重要作用。黃水又稱黃漿水，是白酒發酵過程中原材料經微生物分解代謝形成的游離水，其與各種有機物和微生物一起沉降于窖池底部。黃水被認為含有窖池發酵過程中馴化的所有微生物菌種[6]，一方面，黃水對窖泥的影響類似于降雨/灌溉對土壤的影響，黃水菌群隨黃水滲入窖泥，對窖泥菌群產生影響；另一方面，窖泥菌群中帶有鞭毛的厭氧菌隨黃水游弋到酒醅中影響酒醅菌群，如梭菌、瘤菌等。因黃水又被稱為“液體窖泥”，是“萬年糟”作用的執行者。

目前，黃水菌群的研究方法有傳統的純化培養方法、非培養的聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）方法和磷脂分析法[7-9]。韓永勝等[10]通過純培養方法發現，隨著窖齡增加，黃水的總酸、總酯等有機物含量和微生物數量有增加趨勢。王傳榮等[11]進一步通過純化培養方法發現黃水中的優勢菌群為乳酸菌、丁酸菌和己酸菌。李可等[7]通過純培養并構建克隆文庫的方法發現黃水中的優勢菌群為梭菌屬、乳酸菌屬和沙雷氏菌屬，并檢測到了甲烷菌的存在。Li Hui等[8]通過非培養的PCR-DGGE方法，發現黃水中的菌群組成主要有乳酸桿菌（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostridium）和沉積菌屬（Sedimentibacter）。外，醋酸桿菌屬（A c e t o b a c t e r）、蛋白桿菌屬（Proteiniphilum）、喜熱菌屬（Caloramator）和甲烷菌也在黃水中檢測到[8-9]。而目前傳統培養方法得到的結果為可以培養的菌屬，PCR-DGGE方法也不能給出菌屬的具體定量結果。因，基于自然界中未知菌/未培養菌占多數的情況[12]，需要相對更準確的免培養方法全面解析黃水中的菌群組成。已知Clostridium、Sedimentibacter、Proteiniphilum和Caloramator是老窖泥中常見的厭氧菌屬，而甲烷菌的存在被認為是濃香型窖泥老熟的標志[13]。 可知，黃水菌群中含有老窖泥中典型的厭氧菌。與黃水相比，窖泥給菌群提供了一個相對封閉、穩定、厭氧的生存環境。已知窖泥菌多數為厭氧菌[4]，因，黃水菌群中的厭氧菌有可能對窖泥菌群的老熟起重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤DNA提取試劑盒（D5625） 美國Omega Bio公司；AP-GX-50凝膠回收試劑盒 美國Axygen 公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

2018年10月，選取兩組窖齡不同而發酵工藝相同的新老窖池，發酵結束時抽取黃水本。取6 個新窖池（窖齡6 a）新鮮黃水本，標記為YN-1～YN-6；6 個老窖池（窖齡≥50 a）新鮮黃水本，標記為YO-1～YO-6。另外取3 個老窖池黃水本封閉靜置培養5 個月，標記為YO5-1～YO5-3；另外取3 個新窖池黃水本封閉靜置培養5 個月，標記為YN5-1～YN5-3。以上18 個黃水本用于提取基因組后高通量測序。

1.3.2 理化性質分析

采用紫外分光光度計法檢測銨態氮含量；采用酸堿中和法測定酸度；采用標準葡萄糖液反滴定法檢測淀粉和還原糖含量[14]；采用GB 11893ü 1989《水質 總磷的測定》鉬酸銨分光光度法檢測黃水中的總磷。

KH2PO4（0.02 mol/L），柱流速0.1 mL/min，檢測波長208 nm，柱箱溫度30 ℃。

1.3.3 DNA提取與Illumina高通量測序

1.3.4 測序數據處理與統計學分析

首先將原始序列優化得到用于后續分析的優質序列。即：去掉長度小于150 bp或者大于300 bp、模糊堿基數大于1、同聚堿基數目大于8、引物錯配大于1 bp的序列（QIIME，v1.8.0）；雙向拼接（FLASH軟件v1.2.7）序列，剔除嵌合體（USEARCH，v5.2.236）序列。UCLUST聚類（97%相似度）優質序列得到各可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），認定各OTU中豐度最高的序列為其代表序列。在80%可信度水平，使用Silva數據庫（Release132）注釋各代表序列即為代表OTU的注釋結果，并形成OTU列表。去除OTU列表中序列數目少于總測序量0.001%的OTU。然后將OTU列表進行100 次抽平，取平均，對取平均后的序列數進行四舍五入取整，得到新的OTU列表。對抽平取后的OTU列表，使用Qiime軟件（v1.8.0）計其Shannon指數、Chao 1指數等微生物群落多性指數。使用Qiime軟件，對Weighted UniFrac距離矩陣分別進行UPGMA聚類分析，并使用R軟件（R3.3.2）進行可視化。黃水本理化因子之間的差異顯著性分析通過SPSS（24.0）方差分析（ANOVA）實現。黃水理化因子與其菌群組成之間的冗余分析（redundancy analysis，RDA）通過Canoco 5實現。

2 結果與分析

2.1 黃水本的理化性質

新老窖池的新鮮黃水相比較，兩者的淀粉、還原糖、丙酸、乳酸、乙醇含量不具有顯著性差異，說明新老窖池發酵糧食（淀粉）產生乙醇的主體過程無差異。如表1所示，與新窖池的新鮮黃水相比，老窖池的新鮮黃水中，丁酸、己酸、戊酸、乙酸、銨態氮的值偏高，而酸度略低。說明：1）與新窖池相比，老窖池發酵過程中代謝形成的各種酸等風味物質較豐富，可能與老窖池發酵過程中己酸菌與甲烷菌之間存在良性的氫傳遞，更容易促進己酸和丁酸等風味物質的合成有關[15]； 2）老窖池發酵過程中，銨態氮含量比較高，可能與老窖池中降解氨基酸的菌含量比較高有關，比如胺桿菌屬（Aminobacterium）；3）老窖池的新鮮黃水酸度略低，一方面與其中銨態氮含量較高有關，另一方面與乳酸含量略低（盡管兩者不具有顯著性差異）有關，因為幾種有機酸中，乳酸的含量最大，且其pKa值最小，其對酸度的貢獻最大。

表 1 4 組黃水樣本的理化性質Table 1 Physicochemical properties of 4 groups of HS samples

新老窖池黃水經過5 個月的封閉靜置培養后，丙酸、乳酸值無顯著變化，淀粉、還原糖、酸度值不同程度地降低，而銨態氮有所增加。說明靜置培養過程黃水中的菌群生長消耗了其中的淀粉、還原糖，同時生成了銨態氮（降解氨基酸的菌），如Aminobacterium[16-18]。最終黃水酸度有所下降。新老窖池黃水培養后的不同之處在于：老窖池黃水經培養后，己酸和戊酸的值顯著降低；新窖池黃水培養后乙醇含量顯著降低，丁酸和乙酸的值顯著增加。目前已知，在窖泥中存在以乙醇[19-20]和乳酸[21]為前體生成丁酸/己酸的菌種。新窖池黃水經過封閉靜置培養后，乙醇減少，同時丁酸和乙酸增加，很可能與其中存在以乙醇為前體的丁酸/己酸菌的代謝功能有關。相比較而言，老窖池黃水中的丁酸/己酸菌在封閉靜置培養期間似乎并不活躍。

2.2 黃水原核微生物群落的α多性

通過Illumina MiSeq高通量測序，得到673 738 條平均長度為207 bp的優質序列，平均30 182～53 152 條/本。對所有本10 次抽平（subsample）取平均四舍五入后，得到序列26 931～26 981 條/本，進行后續分析。OTU聚類（97%相似度）得到4 886 個OTU，平均77～580 個/本。每個本的測序覆蓋率大于99%，說明測序數目足夠，測序序列可以代表其菌群組成。得到注釋（門、綱、目、科、屬）的序列大于99.9%，無法得到注釋的序列僅12 條序列，說明對窖泥中大量的未培養菌也充分實現了系統分類。如表2所示，新老窖池的新鮮黃水相比較，兩者微生物群落的OTU數目、Shannon指數和Chao 1指數都不具有顯著性差異，經過封閉靜置培養5 個月后，3 個微生物群落參數值均顯著升高，說明靜置培養后黃水中的菌群豐度和多性增加。

表 2 4 組黃水樣本的細菌群落豐度和多樣性參數Table 2 Bacterial community richness and diversity indices of 4 groups of HS samples

2.3 黃水原核微生物群落的β多性

圖 1 4 組黃水樣本中15 個優勢門的相對豐度Fig. 1 Relative abundances of the 15 dominant phyla in 4 groups of HS samples

對OTU注釋，總共得到35 個門，其中32 個細菌門，3 個古菌門。在門的水平上，在新老窖池新鮮黃水中，厚壁菌門（Firmicutes）為絕對優勢菌門，分別占新老窖池新鮮黃水本的98.46%和95.72%。將相對豐度超過0.1%的門定義為優勢菌門（圖1）。除Firmicutes外，其余4 個優勢菌門在新老窖池新鮮黃水中的相對豐度依次為：變形菌門（Proteobacteria，1.0%和2.0%）、放線菌（Actinobacteria，0.11%和1.0%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，0.1%和0.36%）和綠彎菌門（Chloroflexi，0.03%和0.45%）。Firmicutes在黃水中的絕對優勢情況也存在于窖泥中[1-2]，但在黃水中占的比例更大。

經過封閉靜置培養5 個月后，新老窖池的黃水中的菌群組成發生變化。新老窖池黃水中Firmicutes的相對豐度分別下降為63.14%和79.59%；Proteobacteria在兩者中的豐度分別大幅上升至20.86%和12.88%；Bacteroidetes則分別上升至6.21%和1.74%；Actinobacteria分別上升至0.63%和2.79%；Chloroflexi分別上升至1.32%和0.47%。外，經過靜置培養后，互養菌門（Synergistetes）在老窖池黃水中的相對豐度上升幅度很大（由0.06%變為2.11%），而在新窖池黃水中變化幅度相對較小（由0.02%變為0.46%）。通過靜置培養，黃水菌群與窖泥菌群中的組成更接近了，比如Firmicutes與窖泥中的菌群組成更接近。

圖 2 4 組黃水樣本中8 個優勢屬的相對豐度Fig. 2 Relative abundances of the 8 dominant genera in 4 groups of HS

圖 3 18 個黃水樣本菌群Weighted Unifrac Distance聚類圖Fig. 3 Cluster analysis of the 18 HS samples based on Weighted Unifrac Distance

對O T U 注釋，共得到6 6 4 個屬，注釋度為97.81%，其余序列只能不同程度地注釋到門、綱、目、科等級別。注釋度之所以如高，因為黃水本中的屬種非常集中，Lactobacillus占絕對優勢。除Lactobacillus，黃水本中相對豐度超過1%的優勢菌屬還有：不動桿菌屬（Acinetobacter）、雙歧黃色高溫菌屬（Thermoflavimicrobium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、產己酸菌屬（Caproiciproducens）和Aminobacterium（圖2）。

圖 4 4 組黃水樣本中8 個優勢菌屬的相對豐度 Fig. 4 Relative abundance of the 8 dominant genera in 4 groups of HS samples

深入分析黃水中優勢菌屬在封閉靜置培養前后的變化（圖4）可知，經過封閉靜置培養后，新老窖池黃水本中的絕對優勢菌屬Lactobacillus的相對豐度分別降低至52.5%和68.55%。推測很可能與封閉靜置培養條件下的缺氧環境不利于兼性厭氧菌Lactobacillus的增殖有一定關系。外，黃水中的其余7 個優勢菌屬的相對豐度都顯著性增加。

除上述提到的Caproiciproducens和Aminobacterium，窖泥中還存在很多功能菌[1,3]， 如棒狀桿菌（Caldicoprobacter）[31]、貪銅菌屬（Cupriavidus）[32]、 甲烷囊菌屬（M e t h a n o c u l l e u s）[2]、瘤梭菌（Ruminiclostridium）[33]、Sedimentibacter[2]和互營單胞菌屬（Syntrophomonas）[2]，其對窖泥的老熟具有很重要的作用。圖5為這些菌屬在4 組黃水中的相對豐度。經過封閉靜置培養后，6 株菌在新老窖池黃水中的相對豐度都有不同程度的升高。與新窖池黃水相比，老窖池黃水經過封閉靜置培養Methanoculleus、Sedimentibacter、Syntrophomonas的相對豐度增加更多。說明黃水中含有大量促進窖泥老熟的菌種，且黃水可以提供這些菌種在厭氧條件下生長所需要的營養物質。

圖 5 6 個窖泥中的優勢菌屬在4 組黃水樣本中的相對豐度Fig. 5 Relative abundance of 6 PM-dominant genera in 4 groups of HS samples

2.4 黃水本理化性質與菌群之間的RDA

圖 6 黃水的理化因子與其菌群之間的RDAFig. 6 Redundancy analysis of the physicochemical factors and HS prokaryotic communities

如圖6所示，2 個主成分的總解釋度為87.49%，但是兩個坐標軸上的解釋度相差懸殊，主要集中在RDA1（86.16%）。以橫軸為分界點，封閉靜置培養前的新鮮黃水本集中在左側，靜置培養后的黃水本散布在右側。由也可得知，與窖池的窖齡相比，是否靜置培養對黃水本的菌群組成影響更大，與圖3結論一致。圖6中還原糖、淀粉、酸度和乙醇與新鮮黃水本菌群呈強烈正相關，銨態氮與靜置培養黃水呈正相關，表明新鮮黃水中還原糖、淀粉、酸度和乙醇的值偏高，靜置培養后的黃水銨態氮升高。使用互動向前選擇程序驗收11 個理化因子，發現參數還原糖的解釋度最高65%（P＜0.01）。外，其余理化指標的貢獻率都不具有顯著性，指標（解釋度）分別為：己酸（6.2%）、乳酸（5.9%）、銨態氮（2.7%）、乙酸（2.2%）、丁酸（1.7%）、酸度（1.4%）、淀粉（1.2%）、乙醇（0.9%）、戊酸（0.3%）、丙酸（0.2%）。

3 討 論

新老窖池新鮮黃水中淀粉、還原糖、丙酸、乳酸、乙醇的含量不具有顯著性差異。與新窖池相比，老窖池新鮮黃水中，即老窖池酒醅發酵過程中產生的丁酸、己酸、戊酸、乙酸等風味物質含量較豐富，同時產生的銨態氮的含量較高。己酸是生成濃香型白酒特色風味物質己酸乙酯的前體物質，與“窖池越老，酒質越好”的結論一致。銨態氮是菌群生長的氮源，老窖池黃水中銨態氮含量高與老窖池中菌群含量更豐富有關系。

本研究通過高通量測序分析黃水中的原核菌群組成，證明靜置培養有利于窖泥老熟菌屬的增加，尤其是老黃水中，窖泥老熟菌屬的增加更明顯，比如Aminobacterium相對豐度從0.47%升到1.97%，已知優質老窖泥中Aminobacterium相對豐度顯著高于新窖泥[4]。Methanoculleus相對豐度從接近于0%上升到0.24%，已知新窖泥中的Methanoculleus相對豐度為0.16%，25 a窖齡窖泥中的相對豐度上升到1.56%[2]。靜置培養后的老黃水中Methanoculleus的相對豐度盡管沒有達到老窖泥中的豐度，但說明黃水中天然有促進窖泥老熟的菌種存在，為將來通過自然培養黃水改良窖泥提供了一種思路。而考慮到黃水環境與窖泥環境的差異，需要進一步摸索適宜黃水中窖泥老熟菌種生存繁殖的條件。實現對黃水的自然培養并應用于促進窖泥老熟的養護，不但有利于促進窖泥老熟，對黃水的處理也有重要意義。因為黃水的化學需氧量值很高，排放會遠超過國家允許的廢水排放指標[34]。目前，有研究直接將黃水蒸餾制成低度黃 水酒[35]，但只是將黃水中的乙醇進行回收利用；有研究通過超臨界CO2萃取技術從黃水中提取風味物質[36]，但成本太高。外，柴玉強等[37]提出將黃水進行次發酵再蒸餾酒的方法。本研究嘗試了直接靜置厭氧培養黃水的方法，可能解決黃水的處理問題，將黃水變廢為寶，用于窖泥改良，將來還需要對黃水作為“液體窖泥”的培養條件進行進一步研究。