間充質干細胞向髓核分化研究進展

牛永濤，謝 林，席志鵬，鄧蓉蓉

1.南京中醫藥大學第三臨床醫學院研究生院，南京 230038 2.江蘇省中西醫結合醫院骨科，南京 230038

椎間盤退行性變為下腰痛的重要原因之一[1］。非手術或手術治療均不能徹底治愈椎間盤退行性變，且有復發的可能[2-3］。間充質干細胞（MSCs）具有體外擴增及分化成正常組織的潛能，在一定的誘導條件下可以向成骨、成軟骨、成脂及髓核細胞分化，且具有免疫原性低和免疫調節性的特點[4-7］，一直是組織修復研究的熱點。近年來，誘導MSCs向髓核分化，用于修復椎間盤退行性變備受關注，并且在體內及體外實驗證實具有可行性[8-10］。本文回顧分析近年MSCs向髓核分化的相關研究，從常用髓核細胞鑒定表型及MSCs向髓核分化的誘導方式等方面展開分析，現綜述如下。

1 常用髓核細胞鑒定表型

目前無特異性細胞表型可以確定髓核細胞。Lee等[11］的研究顯示，Ⅱ型膠原蛋白（COLⅡ）、蛋白多糖、SOX-9是髓核細胞與軟骨細胞共同具有的基因表型，鑒定髓核細胞主要參考這3種基因的表達差異。近年來，有學者試圖通過比較軟骨細胞與髓核細胞基因表達差異，尋找髓核細胞較為特異性的基因來區別兩者，用以鑒定髓核細胞。Liu等[12］從6例接受腰椎融合術治療的患者體內取出椎間盤組織，并成功分離出正常髓核細胞并培養。KRT18和KRT19為人類脊索特異性標志物，常作為鑒定髓核細胞的陽性標志物[13-14］。KRT19可作為髓核細胞鑒定的特有基因用于描述髓核細胞的特征[15-16］。PAX1與FOXF1作為鑒定髓核細胞新的陽性表型在MSCs向髓核分化研究中廣泛應用，PAX1參與胚胎期調節椎間盤生成，FOXF1與椎間盤細胞生長、增殖有關，SHH信號軸激活PAX1、FOXF1的基因表達[17］。在一項髓核細胞與軟骨細胞的比較研究中，發現髓核細胞中KRT18、KRT19、PAX1及FOXF1的含量遠多于軟骨細胞[18］。

2 MSCs向髓核分化方式

2.1 生長因子

細胞的生長因子在組織工程中發揮著重要作用，通過自分泌、旁分泌及內分泌促進MSCs向髓核分化。其中轉化生長因子-β（TGF-β）家族廣泛存在于組織細胞中，具有調節細胞生長、分化、凋亡及細胞外基質合成的作用。TGF-β家族在修復椎間盤退行性變中發揮著重要作用，研究表明，TGF-β具有促進MSCs向髓核分化的作用，修復發生退行性變的椎間盤，延緩椎間盤退行性變進程，降低髓核細胞的凋亡率[19］。Tao等[20］的實驗研究中，骨髓MSCs被包封于葡聚糖/明膠水凝膠中的控釋給藥系統，以TGF-β3納米粒為載體移植至發生退行性變的椎間盤，實驗結果表明，TGF-β3具有誘導MSCs向髓核分化的作用，可幫助修復發生退行性變的椎間盤。骨形態發生蛋白（BMP）聯合TGF-β1可促進MSCs增殖及糖胺聚糖（GAG）、蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9、KRT19的表達增加[21］。此外，胰島素樣生長因子、表皮生長因子、血小板衍生生長因子等都具有促進MSCs分化的能力。椎間盤內具有多種生長因子，這些生長因子參與細胞的增殖及分化，在椎間盤退行性變的修復中發揮重要作用，正是這些生長因子的存在，使得MSCs移植修復發生退行性變的椎間盤成為可能。但是生長因子誘導MSCs向髓核分化修復發生退行性變的椎間盤確切機制尚不清楚，有待進一步研究。

2.2 共培養

MSCs與髓核細胞共培養可促進MSCs向髓核分化，有助于修復發生退行性變的椎間盤。Ouyang等[22］將人MSCs及人髓核細胞按1∶1共培養后，COLⅡ、蛋白多糖及GAG的表達增加。Arkesteijn等[23］將MSCs與髓核細胞共培養在海藻酸鈉微球中，GAG的表達增加，在髓核細胞附近觀察到蛋白多糖的沉積。Strassburg等[24］比較了MSCs分別與發生退行性變的髓核細胞及正常髓核細胞共培養，認為與發生退行性變的髓核細胞共培養更利于MSCs向髓核分化，蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9表達較正常髓核共培養顯著增加，同時增加了軟骨源性形態發生蛋白1（CDMP-1）、TGF-β1、胰島素樣生長因子1（IGF-1）和結締組織生長因子（CTGF）基因的表達。Lehmann等[25］把MSCs與正常髓核細胞共培養后，發現TGF-β1表達升高并參與細胞間通信。MSCs與髓核細胞相互作用，促進了MSCs的表達譜向髓核細胞基因型轉化，可能是髓核細胞分泌的細胞因子刺激了MSCs向髓核細胞的分化，同時，MSCs可能對發生退行性變的髓核細胞具有營養作用。

2.3 低氧

椎間盤內是一個特殊的低氧環境，髓核細胞在特殊低氧環境下具有正常繁殖及更新的能力，有學者根據這一特性，在模擬的低氧環境下誘導MSCs向髓核分化。Hudson等[26］報道了MSCs在低氧（5%O2）和常氧下向髓核分化的實驗結果，低氧條件促進MSCs向髓核分化，GAG及膠原蛋白表達增加。Stoyanov等[27］的研究顯示，在低氧條件及TGF-5作用下，COLⅡ、蛋白多糖、KRT19及GAG表達增加，認為在低氧條件及TGF-5作用下更有利于MSCs向髓核分化。Feng等[28］在研究低氧和支架構筑對兔MSCs向髓核分化的影響時發現，在低氧三維支架中，COLⅡ、蛋白多糖、SOX-9及GAG表達增加，同時低氧誘導因子-1α（HIF-1α）增加，認為MSCs低氧三維支架可用于椎間盤內移植，修復發生退行性變的椎間盤。Cui等[29］采用低氧聯合含有 TGF-β1的三維支架誘導MSCs向髓核分化，發現在低氧（2%O2）條件下，COLⅡ、蛋白多糖、SOX-9和HIF-1α表達增加，認為含TGF-β1的靜電紡絲納米纖維支架支持MSCs在低氧下向髓核分化，是髓核再生的一種較為合適的選擇。Ni等[30］在低氧誘導胚胎源性干細胞向髓核細胞分化的研究中發現，低氧可促進MSCs增殖及向髓核分化，表現為髓核細胞標志物COLⅡ、蛋白多糖、SOX-9及HIF-1α表達增加。體外低氧條件模擬了椎間盤的低氧環境，在低氧微環境中，MSCs可向髓核表型分化，并且HIF-1α表達增加，進一步證明低氧環境促進MSCs向髓核細胞分化的可行性。

2.4 三維支架

支架材料可以為MSCs提供三維的生長環境，避免了單層細胞培養的弊端，使細胞間形成適宜的空間分布和良好的聯系，提供特殊的生長和分化信號，維持細胞的定向分化并維持表型。Vaudreuil等[9］采用MSCs光聚合生物凝膠支架修復椎間盤退行性變，MRI示髓核的基質改善，組織學檢查示 凝膠組細胞增多，椎間盤退行性變減輕。Thorpe等[31］將MSCs及水凝膠一起注射到退行性變的椎間盤，注射后水凝膠與周圍髓核組織結合，促進了MSCs向髓核分化，可以恢復腰椎的力學功能。Smith等[32］將MSCs接種于三維互穿網絡水凝膠的體外研究發現，蛋白多糖、COLⅡ和GAG表達增加。Naqvi等[33］比較藻酸鹽和殼聚糖水凝膠中骨髓MSCs向髓核分化差異，結果顯示，殼聚糖水凝膠可調節GAG和膠原的表達；與殼聚糖相比，海藻酸鈉能更好地支持MSCs中GAG和COLⅡ表達。陳春等[34］介紹了采用明膠微支架裝載MSCs移植治療犬退行性變椎間盤比單純MSCs移植療效更佳。三維支架可對MSCs起保護和支持作用，相當于細胞外基質，三維支架結構可容納更多的細胞，使細胞有更多的接觸機會，增加了細胞間的信號傳遞。同時，利用三維支架作為載體，與MSCs一起注射移植，為微創治療椎間盤退行性變提供了方便。但如何讓三維支架具有良好的生物可降解性，并且在組織形成過程中逐步降解而不影響正常組織生長及功能，仍是目前亟待解決的問題。

2.5 其他

有學者給予MSCs一定的應力，促進MSCs向髓核分化。Gan等[35］發現，給予MSCs較低壓縮負荷（5%）時，MSCs向髓核分化被促進，蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9及GAG表達增加。Luo等[36］模擬微重力誘導MSCs向髓核分化，結果顯示，微重力下蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9的表達增加，MSCs向髓核分化得到促進。Yan等[37］將不同濃度丹酚酸b聯合MSCs移植入新西蘭家兔椎間盤內，發現8周后蛋白多糖、COLⅡ的表達增加，結果提示丹酚酸b（1～10 mg/L）聯合MSCs移植修復椎間盤退行性變較單純MSCs移植更有效。還有部分學者將MSCs應用于臨床，如Henriksson等[38］將MSCs移植入4位志愿者退行性變的椎間盤中，發現COLⅡ及SOX-9表達增加，表明MSCs向髓核分化。

3 結語和展望

應用組織工程修復退行性變椎間盤已成為目前研究熱點，各種方式誘導MSCs向髓核分化在一定程度上取得了效果。使退行性變的椎間盤再生是未來修復椎間盤退行性變的理想手段。但由于椎間盤特有的生物力學性能及生理環境，目前大部分研究尚停留在實驗階段，還不能應用于臨床。另外，目前也沒有確切有效的鑒定髓核細胞的方法，不能形成統一有效的鑒定標準，在髓核細胞鑒定方面尚有不足。由于大部分誘導MSCs向髓核分化的研究僅有縱向比較，少有橫向的各種誘導方式之間的比較，故各種誘導方式之間差別目前尚不清楚，亦沒有形成一套安全、有效、穩定的誘導方案。后續研究可考慮對各種誘導方案通過體內外實驗進行橫向比較，總結篩選出一套安全、合理、有效的方案，通過臨床試驗取得臨床資料，再次總結優化，最終在臨床推廣。