阿爾茨海默病相關血液學標志物研究進展

陳小童，林 勇

（復旦大學附屬華山醫院檢驗醫學科，上海 200040）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種中樞神經系統退行性疾病，主要臨床表現為記憶、認知障礙以及后期的人格和行為改變等。據統計，AD在全球廣泛流行，截至2013年，全球約有4400萬人罹患癡呆，預計至2050年，患病人數將達到1.3億，其中50%～75%為AD患者[1]。

隨著研究的深入，學者們發現在AD早期即可出現細胞外淀粉樣β蛋白（amyloid betaprotein，Aβ）異常沉積、細胞內神經原纖維纏結以及腦組織的核酸氧化、線粒體損傷等[2]。這提示AD是一個連續發展的疾病，通過對其病理生理特征的監測或許有利于更加早期、全面地治療AD。2007年發布的國際工作組織（the International Working Group，IWG）-1診斷標準首次將生物標志物納入AD診斷標準[3]。2014年發布的IWG-2診斷標準將AD相關生物標志物進行了分類[4]。美國國立衰老研究所和美國阿爾茨海默病協會將生物標志物作為臨床前AD的診斷標準，并作為AD源性輕度認知障礙（mild cognitive impairment，MCI）以及AD源性癡呆的支持性證據[5]。由此可見，生物標志物在AD的進展中有重要的價值。

目前，主要通過磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發射型計算機斷層顯像（positron emission computed tomography，PET/CT）[6]以及腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）相關項目[7]等針對“大腦”的AD生物標志物進行檢測。此類方法存在價格高、創傷性大、技術要求高等缺點。事實上，AD的發生、發展并不局限于中樞神經系統，而是與全身各器官、組織、細胞代謝活動密切相關，是更加系統、復雜的過程。Aβ的異常沉積與AD的發生、發展息息相關，而Aβ的產生和清除過程由大腦和外周共同參與。有研究結果顯示，大腦中近60%的Aβ可運輸至外周被清除，而外周產生的Aβ也可進入大腦并參與AD的病理過程[8]。大腦與外周Aβ代謝的相互作用及動態變化提示或許可通過檢測外周血相關指標監測AD的發生、發展。血液學標志物的檢測相對簡便、易行，可彌補現有檢測方法的不足。為此，本文擬對AD相關血液學標志物的研究現狀進行分類闡述。

1 預測型AD血液學標志物

預測型AD血液學標志物可在AD無癥狀期表達，對AD的發生風險有一定預測價值。

淀粉樣蛋白的病理現象被認為是最早期的AD病理改變[5]，常預示著更高的患病風險。VERBERK等[9]建立Cox比例風險回歸模型后發現，血漿Aβ42/Aβ40比值越低，預示著臨床進展至MCI和AD階段的風險越高[風險比（hazard ratio，HR）為2.03，校正年齡和性別后的HR為1.67]，血漿Aβ42/Aβ40比值與CSF Aβ42水平密切相關，若將血漿Aβ42/Aβ40比值用于MCI和AD的診斷，可以減少50%以上用于檢測CSF Aβ42的腰椎穿刺。NAKAMURA等[10]采用免疫沉淀聯合質譜對日本國家老年醫學中心的121份血液樣本及澳大利亞老齡化影像學、生物標志物和生活方式研究的252份血液樣本進行淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）及Aβ檢測，結果顯示血漿APP669-711/Aβ1-42比值和Aβ1-40/Aβ1-42比值聯合檢測與PET/CT結果密切相關，以PET/CT結果作為反映腦Aβ沉積程度的標準，分別制作2項指標聯合檢測的受試者工作特征曲線，其曲線下面積均＞90%，準確性為90%，提示血漿APP669-711/Aβ1-42比值和Aβ1-40/Aβ1-42比值聯合檢測可在一定程度上反映腦Aβ的沉積情況。由此可見，與血漿Aβ42相關的聯合檢測結果可作為AD的預測指標，但尚無充分證據表明單獨檢測血漿游離Aβ42和Aβ40水平與AD的發生、發展過程有關。除血液Aβ水平有變化外，Aβ的二級結構也會隨AD的發展而發生變化。NABERS等[11]采用免疫-紅外線探測儀，通過Aβ抗體“捕獲”Aβ，以酰胺Ⅰ帶作為目標條帶，經紅外線照射后產生最大吸收峰，設1642 cm-1為閾值，β-折疊將使峰值移向＜1642 cm-1一側。他們采用巢式病例對照研究方法，以2000—2002年收集的血液樣本作為基線，測量其酰胺Ⅰ帶吸收峰值，在長達8年的隨訪后，統計暴露的AD患者與非AD對照者的吸收峰值，發現AD患者的吸收峰值顯著低于非AD對照者，該法的陽性似然比為7.9，提示該法可用于早期篩查AD高風險人群。

隨著研究的深入，學者們發現在AD進程中，大腦的代謝活動會產生與之相關的變化。因此，近年來有許多研究利用代謝組學探索與AD相關的血液學生物標志物。VARMA等[12]同時檢測了大腦與外周血的同一組代謝物，結果發現有4種鞘脂類代謝物在血液中的水平越高，未來AD的發病風險越大。

2 進展型AD血液學標志物

進展型AD血液學標志物在AD病程進展（包括MCI和AD階段）中的表達有明顯差異。

Aβ的生成與β-分泌酶（beta amyloid cleavage enzyme，BACE）相關。BACE 1介導了APP的第1次剪切，是Aβ生成的限速酶。有研究結果顯示，與健康對照組比較，MCI組和AD組血漿BACE 1活性分別增加了53.2%和68.9%，且能反映MCI轉變為“可能為AD”的可能性[13]。

氧化應激與AD的病理過程息息相關，氧化應激相關的氧化產物或能作為AD的生物標志物。異前列腺素（isoprostane，IsoP）是反映體內氧化應激和脂質過氧化反應的可靠的生物標志物之一。PE?A-BAUTISTA等[14]對血漿中18種IsoP進行分析，結果顯示AD組有6種IsoP明顯高于正常對照組（P＜0.01）。載脂蛋白（apolipoprotein，apo）一直以來都被認為在AD病理過程中扮演著重要角色，如apo E基因與晚發型AD關系密切[7]，apo J可作為分子伴侶調控氧化損傷[15]。有研究結果顯示，MCI組和AD組血漿apo J水平明顯高于健康對照組（P＜0.001、P＜0.05），但與認知量表評分高低無關[16]。與氧化應激相關的血液抗氧化酶在AD進程中也發生了變化，如超氧化岐化酶、谷胱甘肽過氧化物酶[17]，且人體總抗氧化力呈下降趨勢。PERROTTE等[16]的研究結果顯示，血漿總抗氧化力與臨床認知量表評分有關，提示總抗氧化力與認知衰退程度有一定關系。

另外，神經炎癥在AD進程中也扮演著重要的角色。淀粉樣蛋白瀑布假說（amyloid cascade hypothesis，ACH）認為Aβ的異常沉積可激活中樞神經系統中特有的免疫細胞，如小膠質細胞、星形膠質細胞等，繼而釋放多種炎性介質，參與神經炎性斑塊的形成[18]。HENEKA等[19]的研究結果顯示，炎癥反應可能在神經炎性斑塊形成之前就已發生，這一過程可促進Aβ沉積、tau蛋白聚集等AD病理過程。因此，檢測相關炎癥介質水平或許可在一定程度上反映AD的病情進展情況。FORLENZA等[20]的研究結果顯示，AD組和MCI組血清白細胞介素（interleukin，IL）1β水平明顯高于正常對照組（P=0.03）。

3 支持診斷型AD血液學標志物

支持診斷型AD血液學標志物在AD患者與非AD者或正常對照者之間表達有明顯差異。

Aβ相關指標在AD預測及進展監測中發揮了重要作用，而Aβ相關基因，如APP、早老素（presenilin，PS）基因突變在AD診斷，尤其是在家族性AD的診斷上已被廣泛認同。淀粉樣蛋白瀑布假說認為AD的產生在于Aβ過量生成及清除減少[21]，而Aβ是由APP經BACE和γ-分泌酶水解后產生的，因此APP基因突變成為淀粉樣蛋白瀑布假說成立的有力證據之一，如APP基因的β分泌酶剪切位點突變（APPKM670/671NL突變）可促進Aβ產生，E693G位點突變使Aβ從寡聚體向原纖維轉變，有利于Aβ沉積、E682K位點突變，加快AD進程等。然而，并非所有的APP基因突變都會致病，如APP基因A673T突變可減少Aβ的生成[21]。PS蛋白是組成γ-分泌酶催化亞基的蛋白復合物，可介導APP的膜內切割，產生Aβ。PS基因突變常表現為PS蛋白功能缺失，使γ-分泌酶失去活性，Aβ生成減少[22]。然而，這并不能將其定性為有益突變。有研究結果顯示，PS基因突變產生的效應與淀粉樣蛋白瀑布假說相一致[23]。

Tau蛋白是微管相關蛋白。在生理狀態下，tau蛋白不折疊且幾乎無聚集傾向。正常成人每個tau蛋白分子中約有2個位點磷酸化，而AD患者每個tau蛋白分子中平均有8個位點磷酸化[24]，tau蛋白的過度磷酸化可改變tau與其他蛋白的正常相互作用，使其脫離微管，促進tau蛋白的聚集，導致突觸功能異常。MIELKE等[25]的研究結果顯示，AD組血漿總tau蛋白和磷酸化tau181蛋白水平均明顯高于認知正常組（P＜0.01）。有Meta分析結果顯示，AD組CSF總tau蛋白及磷酸化tau蛋白水平分別是正常對照組的2.54倍和1.88倍，且磷酸化tau蛋白診斷AD的特異性高于總tau蛋白[26]。

CORSI等[27]對外周血中炎性介質、內皮細胞功能與AD及認知衰退的關系進行了研究，結果顯示，AD組血漿IL-8（P=0.01）、γ干擾素（interferon gamma，IFN-γ）（P=0.026）、人單核細胞趨化蛋白-1（P=0.05）及血管內皮生長因子（P=0.049）水平均高于正常對照組，P-選擇素（P＜0.0001）和L-選擇素（P=0.0002）均低于正常對照組，且認知損傷最嚴重的AD患者P-選擇素和L-選擇素水平最低。在植物血凝素的刺激下，外周血單個核細胞分泌的IFN-γ等細胞因子水平和血清細胞因子水平異常也可能與AD發病相關[28]。此外，AD患者血清中的其他炎癥因子，如IL-10、IL-1β和IL-17等也明顯高于正常對照組[29]。分化簇（cluster of differentiation，CD）40是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，目前應用較多的是將其作為與淋巴細胞功能相關的表面抗原。有研究結果顯示，在AD患者的大腦皮質、神經炎性斑塊及反應性小膠質細胞聚集中，CD40的反應原性明顯增強[30]。MOCALI等[31]的研究結果顯示，晚發型AD患者血漿可溶性CD40明顯高于正常對照組（P＜0.001），且該水平的差異與apo E表達無關。該研究結果在一定程度上為晚發型AD的診斷提供了新的依據。然而，目前尚未在AD患者或MCI患者CSF中發現可溶性CD40[32]，其內在機制有待進一步研究。

AD患者免疫和炎癥系統的系統性改變部分是由于其外周血CD3+淋巴細胞水平降低所致。TRAMUTOLA等[33]利用蛋白質組學方法研究了AD患者和非癡呆患者血液中3-硝基酪氨酸的蛋白質組，鑒定了10種蛋白質，結果顯示AD患者CD3+T細胞中3-硝基酪氨酸水平顯著高于非癡呆患者（P＜0.05）。還有研究結果顯示，與正常對照者比較，AD患者外周血單個核細胞內微小RNA（microRNA，miRNA）-34a升高（P＜0.05），miRNA-34c在AD患者單個核細胞內（P＜0.05）及血漿中（P＜0.01）均明顯升高[34]。

此外，氧化應激相關指標、外泌體及細胞外miRNA也與AD相關。丙二醛是常用的膜脂過氧化指標。有研究結果顯示，AD患者血漿丙二醛水平變化顯著[35]。FIANDACA等[36]的研究結果顯示，AD組血漿中源自神經元外泌體的P-S396-tau、P-T181-tau和Aβ1-42水平顯著高于認知正常組（P＜0.0001）。HARA等[37]的研究結果顯示，AD組血清has-miRNA-501-3p下調，但腦中has-miRNA-501-3p水平上調，相應的細胞實驗結果顯示，過表達has-miRNA-501-3p的細胞可下調128種基因位點的表達，而這些基因與DNA復制和細胞周期相關，提示血清hasmiRNA-501-3p可能與AD患者大腦中細胞損傷和凋亡相關。另外，AD患者血清外泌體miRNA-135a、miRNA-384表達顯著升高，miRNA-193b表達明顯下調[38]。由此可見，miRNA有望被用于診斷AD。

4 結論

AD在全球范圍內已引起廣泛關注，越來越多的研究結果表明在AD進程中，中樞與外周的聯系密切，如小膠質細胞作為中樞神經系統最重要的免疫細胞之一，參與Aβ的清除及突觸功能的發揮[39]，免疫相關的基因及通路的表達在AD患者大腦及外周中均有變化[40]。有研究結果顯示，外周的炎癥刺激可誘導大腦急性的“免疫訓練”及“免疫耐受”，在AD小鼠模型中，免疫訓練可加劇大腦Aβ沉積，而免疫耐受則可減輕Aβ沉積，表明外周的刺激可影響大腦的免疫記憶，繼而影響AD的病理過程[41]。介導外周炎癥和大腦之間溝通的“橋梁”包括血腦屏障的損傷、細胞因子和炎癥介質的信號傳遞、腦內皮細胞、小膠質細胞等。這種密切聯系為AD相關血液學生物標志物的研究打下了基礎，為其在臨床上的應用提供了可能。

目前，用于衡量AD血液學標志物的依據主要包括：（1）是否與PET/CT或CSF中相關標志物的變化相關，借此反映大腦Aβ的沉積情況或tau蛋白的磷酸化情況；（2）是否在AD無癥狀期、MCI和AD期進程中變化顯著，以提示生物標志物與AD有一定的相關性。但以上依據尚有一定的局限性：首先，目前PET/CT或CSF指標的變化能否較準確地反映AD進展還有待商榷，如臨床分期與大腦中Aβ的沉積情況并不完全相符；其次，目前常見的晚發型AD與年齡密切相關，而許多疾病也與年齡相關，因此需充分考慮年齡因素并排除其他疾病因素干擾；再次，目前主要運用的檢測方法為免疫分析法和分子生物學檢測方法，檢測結果重復性較差，假陽性率、假陰性率較高，原因可能為分析前樣本采集、運送、提取等方式不同[42]，分析方法不一致[43]，血腦屏障損傷與AD相關[44]但無法量化，受AD有關危險因素及其他疾病的影響[45]，血液本身的復雜性導致分析結果出現差異[46-47]。除了規范的實驗操作及選擇適當的檢測方法可在一定程度上減少額外的變異外，所選的生物標志物種類、數量及分析方法也可影響研究結果，因此目前出現了許多組學研究，如蛋白質組學[48]、基因組學[49]、脂質組學[50]等，試圖更加全面地反映AD誘導的相關生物標志物的變化。

總之，AD是全世界面臨的共同難題，因而在科研上也需要無國界的通力合作，克服難題，共同尋找理想的生物標志物。理想的血液學標志物將以其獨特的優勢在AD的篩查和診斷中得到推廣和應用。