射干中異黃酮提取工藝的研究

劉晶 劉偉

為鳶尾科植物射干Belamcandachinensis（L.）DC. 的干燥根莖。射干味苦、性寒，是經常使用的中藥之一。其中鳶尾苷、野鳶尾苷等異黃酮是射干中的主要活性成分。射干中的異黃酮類化合物具有抗炎、抗腫瘤、殺菌消毒、清除自由基等作用，因而建立最優的提取方法最大限度的將射干中的異黃酮類化合物提取出來是具有重要意義的。可以應用高效液相色譜法（HPLC）對射干中的兩種異黃酮進行研究并測定其含量，因此本實驗采用HPLC法從更換實驗變量方面對射干中有效成分異黃酮的提取進行探索，從而得到最佳的提取條件。

一、實驗部分

1、儀器

高效液相色譜儀（Agilent1100， Agilent Technologies， Germany），G1315B二極管陣列檢測器，G1311A四元泵，G1312A在線真空脫氣機，Rheodyne7225i定量進樣閥，安捷倫色譜工作站。

RE-3000旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）;WK-1000A高速藥物粉碎機（青州市精誠機械有限公司）;SK3300LH超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

2、 試劑與藥材

樣品提取所用的試劑（甲醇、乙醇、乙酸乙酯）為分析純試劑（煙臺市雙雙化工有限公司）;分析型液相檢測所用甲醇試劑為色譜純（Tedia company， INC， USA），所用的水是娃哈哈純凈水;實驗用水是自蒸的一次水。射干藥材購于聊城利民大藥店。

3、色譜條件

色譜柱：Spherigel C18柱（200 mm×4.6 mm I.D.， 5 μm）;流動相：乙腈-水（19：81， v/v）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：266 nm;柱溫：室溫;進樣量：20 μL。

二、 射干異黃酮提取工藝流程

等質量的射干粉末，分別加入等體積的試劑（如甲醇，乙醇，重蒸水等），采用不同的提取方法進行提取（超聲、冷浸、回流），比較其中一個變量因素時，其它各條件均保持一致。提取液依次經過濾、濃縮、定容后，利用高效液相色譜儀測定鳶尾苷、野鳶尾苷等異黃酮的提取率。

三、 結果與討論

1、 高效液相色譜條件的優化

本實驗在應用高效液相色譜儀分析射干粗提物時，先后嘗試了不同比例的甲醇-水（如40：60、36：44等）、乙腈-水（16：84、19：81、22：78等）作為流動相，實驗結果表明當采用甲醇-水體系作為流動相時，由于熱力學和可壓縮性因素的影響，各色譜峰峰形變寬，且保留時間較長;由于乙腈洗脫能力和溶解能力都較強，當選擇乙睛-水=19：81作為流動相，檢測波長為266 nm，流速為1.0 mL/min時，射干中異黃酮類化合物基本實現基線分離。

2、 不同提取方法對射干異黃酮提取率的影響

為考察不同提取方法對于射干異黃酮提取效率的影響，使用70%乙醇作為提取溶劑，分別采用冷浸提取24 h、超聲提取30 min、加熱回流提取1 h。提取液經0.45μm濾膜過濾后，經HPLC檢測。可以發現，相同的提取溶劑和時間，不同的提取方法對提取效率有顯著的影響。由峰面積的大小可以確定加熱回流時2種異黃酮的提取效率最高，冷浸的提取效率次之，超聲的提取效率最低，所以最佳的提取方法是回流。

3、不同提取溶劑對射干中異黃酮提取率的影響

為選擇合適的提取溶劑，考察不同提取溶劑對射干中異黃酮提取效率的影響。分別加入無水乙醇、水、無水甲醇作為提取溶劑，加熱回流提取1.0 h，提取液經0.45μm濾膜過濾后，經HPLC檢測。可以發現，相同的提取時間和方法，不同的提取溶劑對提取效率也有影響。由峰面積的大小可以確定提取射干中化學成分的最佳溶劑為無水甲醇，其次為乙醇，再次為水。但是因為甲醇有毒，所以采用乙醇效果更好些。

4、不同濃度提取溶劑對射干中異黃酮提取率的影響

為了選擇合適的乙醇提取濃度，考察不同濃度的乙醇對射干中異黃酮提取效率的影響。分別采用無水乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇為溶劑加熱回流提取1.0 h，提取液經0.45μm濾膜過濾后，用HPLC進行分析。不難發現，相同的提取方法、提取時間和提取溶劑，不同濃度的提取溶劑對提取效率也有影響。根據峰面積的大小可以確定提取射干中異黃酮的最佳乙醇濃度為70%。

5、不同提取時間對射干中異黃酮提取率的影響

為考察提取時間對射干異黃酮提取率的影響，使用70%乙醇作為提取溶劑，分別加熱回流0.5 h、1 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，提取液經0.45μm濾膜過濾后，經HPLC檢測。根據峰面積的大小發現，當提取時間為1.0 h和1.5 h時，射干中異黃酮提取率最大，此后隨著時間的延長，異黃酮提取率反而有下降的趨勢。從節約時間的角度考慮，選擇每次1 h作為最佳的提取時間。

6、不同提取次數對射干中異黃酮提取率的影響

為考察提取次數對提取率的影響，使用70%乙醇作為提取溶劑，分別將加熱回流提取，每次1.0 h，提取液經0.45μm濾膜過濾后，經HPLC檢測。檢測后發現，相同的提取方法、提取時間和提取溶劑，隨著回流次數的不同，提取的效率有很大的差異。通過峰面積的大小可知，第一次提取時即可提出大部分的異黃酮，第二次與第三次的提取量相當，但遠遠小于第一次，從節約性的角度考慮，因此加熱回流提取兩次即可。

綜上所述，本實驗通過考察影響射干中異黃酮提取率的提取方法、提取溶劑、不同濃度的提取溶劑、不同提取時間、不同提取次數，確定了射干中異黃酮的最優提取工藝：70%的乙醇作為提取溶劑，加熱回流提取2次，每次的提取時間為1 h。

（作者單位：252000 山東省聊城市農藥檢定所;252000 山東省聊城水務水質檢測有限公司）