納爾遜海灣病毒μNS蛋白與σNS蛋白的表達分析

董晗，鄭國峰，張軍，李永剛

（1.中國醫科大學附屬第四醫院 呼吸內科，遼寧 沈陽 110005；2.錦州醫科大學 病原微生物教研室，遼寧 錦州 121000）

納爾遜海灣病毒（nelson bay virus,NBV）是呼腸孤病毒科中的一種雙鏈核糖核酸（dsRNA）病毒，包含10 個分節段dsRNA。根據RNA 的大小，將其分為大（L1～L3）、中（M1～M3）及小（S1～S4）3 組。μNS 蛋白由M3 基因組區段編碼，σNS 蛋白由S3 基因組區段編碼，這2 種蛋白在病毒增殖過程中發揮重要作用。本研究利用免疫熒光及共聚焦的方法研究NBV 病毒μNS 和σNS 蛋白的表達及兩者的相互作用，深入研究病毒增殖機制及感染機制。

1 材料與方法

1.1 材料

BSR 細胞購于美國ATCC 細胞 庫，DMEM 培養基、opti-MEM 培養基、山羊抗兔-488、山羊抗鼠-594、 轉染試劑Lipofectmine 2000、HRP 羊 抗兔抗體、HRP 羊抗鼠抗體、Alexa594 羊抗鼠抗體及Alexa488 羊抗兔抗體均購于美國Invitrogen 公司，PMSF 購于北京索萊寶生物科技有限公司，μNS 多克隆抗體（兔制備）由錦州醫科大學病原微生物教研室自制[1]，pCAG-M3、pCAG-S3 及NBV 病毒[本研究采用的毒株是2007年從印度尼西亞巴厘島返回日本的呼吸道感染患者身上分離出的NBV 病毒株，該病毒株被命名 為Miyazaki-Bali/2007（MB）[2-3]]，σNS 多克隆抗體（鼠制備）由日本大阪大學微生物病研究所病毒免疫研究室小林剛教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及病毒感染 將BSR 細胞培養于含8%胎牛血清的高糖DMEM 培養基中，細胞達到所需數量時，將BSR 細胞以3×106個/板的密度接種在6 cm 細胞培養板上做質粒轉染。將BSR 細胞培養于含8%胎牛血清的高糖DMEM 培養基中，細胞達到所需數量時，接種于帶有細胞爬片的24 孔板內，次日用NBV 病毒感染，24 h 后進行免疫熒光檢測。

1.2.2 質粒轉染 將10μg pCAG-M3 及pCAG-S3 分別轉染或共同轉染至細胞。質粒與200μl Opti-MEM培養基混合5 min，將25μl 轉染試劑與200μl Opti-MEM 培養基混合5 min，再將稀釋好的質粒及轉染試劑混合，室溫孵育20 min 后，添加到細胞培養基中。細胞在37℃下條件溫育4～6 h，更換血清培養基，繼續37℃溫育24～48 h 后做免疫熒光檢測。

1.2.3 免疫熒光 將感染病毒24 h 后的細胞用PBS-4%多聚甲醛固定20 min，用PBS 洗凈后分別或共同與μNS 及σNS 多克隆抗體在37℃條件下孵育1 h。用PBS 沖洗3 次后，將細胞分別或共同與Alexa 594羊抗鼠抗體及Alexa 488 羊抗兔抗體在37℃條件下孵育1 h，然后PBS 洗3 次。采用熒光顯微鏡觀察并獲取圖像。分別或共同轉染pCAG-M3 及pCAG-S3 質粒BSR 細胞的免疫熒光實驗方法同上，所用抗體同上。通過免疫熒光方法在共聚焦顯微鏡下觀察μNS和σNS 蛋白在NBV 感染細胞和質粒轉染細胞中的定位。為確定μNS 和σNS 是否在病毒包涵體樣結構中共定位，將NBV 病毒以0.1 PFU/細胞的感染復數感染BSR 細胞，孵育24 h，免疫熒光后用共聚焦顯微鏡觀察。先后用μNS 多克隆抗體、Alexa488 的羊抗兔抗體對μNS 蛋白進行免疫染色。先后用σNS 多克隆抗體、Alexa594 的羊抗鼠抗體對σNS 蛋白進行免疫染色，未感染細胞作為對照。為證明當在沒有其他NBV 蛋白表達的情況下，μNS 可以形成病毒包涵體樣結構，用pCAG-M3 質粒（含有來自NBV 的M3基因表達載體）轉染BSR 細胞，通過免疫熒光方法在24 h 共聚焦顯微鏡下觀察μNS 在細胞中的分布。將pCAG-M3 及pCAG-S3 質粒共轉染至BSR 細胞，細胞孵育24 h 后用共聚焦顯微鏡觀察。先后用μNS 多克隆抗體和Alexa488 羊抗兔抗體對μNS 蛋白進行免疫染色。先后用σNS 多克隆抗體和Alexa594 羊抗小鼠抗體對σNS 蛋白進行免疫染色。未轉染質粒的細胞用作對照。

1.2.4 免疫印跡檢測細胞μNS 的表達 用PBS 將細胞從培養皿上吹下，以1 000 r/min 離心3 min，棄上清，加入500μl NP-40 細胞裂解液、5μl PMSF 于4℃搖動1 h 裂解細胞，5 000 r/min 離心5 min，取上清液。取20μl 上清液加入10μl 2×樣本液106℃加熱10 min，靜置為室溫后取實驗組及對照組各20μl蛋白樣品于聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE，結束后20V 電轉印至PVDF。使用5%脫脂牛奶封閉液中室溫封閉1 h，稀釋μNS 或σNS 多克隆抗體，4℃孵育過夜。PBS 洗膜4 次，加入稀釋HRP 羊抗兔抗體或HRP 羊抗鼠抗體，37℃孵育1 h，洗膜。加入電化學發光液曝光顯色。為進一步證明NBV 病毒感染細胞中μNS 及σNS 蛋白的表達，將NBV 病毒感染細胞的裂解物進行免疫印跡分析，一抗使用μNS 和σNS 多克隆抗體，二抗使用HRP 羊抗兔抗體和HRP 羊抗鼠抗體。轉染pCAG-S3 質粒細胞的免疫印跡分析使用兔制備的μNS 多克隆抗體作為一抗，二抗使用HRP羊抗兔抗體。轉染pCAG-M3 質粒細胞的免疫印跡分析實驗使用兔制備的μNS 多克隆抗體作為一抗，二抗是HRP 羊抗兔抗體。

2 結果

2.1 感染細胞中確認μNS and σNS 的蛋白表達

μNS 和σNS 蛋白都以類似的點狀致密結構呈現，這種小的點狀致密結構即為包涵體樣結構，且這2 種蛋白在細胞質中，尤其是在病毒包涵體樣結構中共定位（見圖1）。在未感染的細胞中未觀察到μNS和σNS 蛋白。免疫印跡結果可見感染細胞裂解物75 kD 大小處有蛋白表達即為μNS 蛋白，感染細胞裂解物34 kD 處有蛋白表達即為σNS 蛋白，未感染的細胞作陰性對照（見圖2）。

圖1 μNS 和σNS 蛋白在NBV 感染BSR 細胞中的定位 （×400）

圖2 μNS 和σNS 蛋白在NBV 感染BSR 細胞中的表達

2.2 單獨轉染pCAG-M3 或pCAG-S3 質粒細胞中μNS 和σNS 蛋白的表達

細胞質中觀察到小點狀結構，即病毒包涵體樣結構。用pCAG-S3 質粒（含有來自NBV 的S3 基因表達載體）轉染BSR 細胞時，觀察到σNS 蛋白在整個細胞質中表現出彌散分布，沒有形成點狀結構。未轉染細胞為陰性對照。見圖3。

免疫印跡結果可見質粒轉染細胞裂解物75 kD 大小處有蛋白表達即為μNS 蛋白，未轉染細胞用作對照。免疫印跡結果可見質粒轉染細胞裂解物34 kD 處有蛋白表達即為σNS 蛋白，未轉染細胞用作對照。見圖4。

圖3 單獨轉染細胞中NBV μNS 和σNS 蛋白的定位 （×400）

圖4 單獨轉染質粒的細胞中μNS 和σNS 蛋白的表達

2.3 μNS 和σNS 蛋白共定位于pCAG-M3 和pCAG-S3 質粒共轉染的BSR 細胞

在μNS 和σNS 2 個質粒共轉染24 h 后的BSR細胞中，觀察到與NBV 病毒感染的BSR 細胞相同現象：μNS 和σNS 蛋白在細胞質中，特別是在病毒包涵體樣結構中共定位，可知σNS 蛋白通過與μNS蛋白的相互作用和μNS 蛋白在細胞中共定位。見 圖5。

圖5 μNS 和σNS 蛋白在共轉染pCAG-M3 及pCAG-S3 細胞的細胞質中共定位 （×400）

3 討論

NBV 是融合性正呼腸孤病毒家族中的一員，在呼腸孤病毒的培養過程中，根據病毒在感染細胞時是否具有誘導細胞融合的能力，將呼腸孤病毒分為細胞融合病毒與非融合病毒。禽類呼腸孤病毒（avian reovirus,ARV）、狒狒呼腸孤病毒、爬行類呼腸孤病毒、Broome 呼腸孤病毒及NBV 屬于融合病毒。典型的哺乳動物呼腸孤病毒（mammalian reoviruses,MRV）屬于非融合病毒[4-6]。正常情況下，非融合病毒MRV 十分常見，可引起人類無癥狀感染。融合性病毒感染雖可引起嚴重的動物疾病。在2006年之前，還未有過該病毒引起人類疾病的報道。然而2006年，NBV 病毒先后在馬來西亞、香港等地的急性呼吸道感染患者體內被分離出來[7]。由此可知，NBV 已經進化成一種可以引起人畜共患病的病原體。

NBV 病毒感染細胞早期，細胞質中可觀察到一種小型相密包涵體結構[8]，隨著感染的進展逐漸變得更大且向細胞核移動。有研究稱這種小型的相密包涵體結構為inclusion body，筆者將其譯為包涵體樣結構。有文獻證明，包涵體樣結構是由dsRNA、多種蛋白質和完全組裝的顆粒組成[9]。μNS 是呼腸孤病毒一種主要的非結構蛋白，由M3 基因組區段編碼，蛋白質大小為75 kD。針對MRV 和ARV 的研究表明，非結構蛋白μNS 在細胞中獨自表達，即可以在胞質內形成包涵體樣結構，顯微鏡下觀察該包涵體樣結構與某些呼腸孤病毒株感染細胞期間形成的結構極為相 似[10-11]。其他MRV 和ARV 的研究結果還表明，μNS在質粒轉染和病毒感染的細胞中都可形成包涵體樣結構。當通過RNA 干擾敲除μNS 表達時，包涵體樣結構的形成和病毒增殖被嚴重抑制；當以野生型μNS通過質粒轉染方式在該細胞內表達時，病毒又得以繼續增殖[12-13]。這些結果有力的表明，包涵體樣結構的形成是MRV 成功增殖的重要且必要的條件。第2 種主要的呼腸孤病毒非結構蛋白σNS 也與包涵體樣結構的形成有關[14]。σNS 是由S3 基因組區段編碼的含有366 個殘基、大小為41 kD 的蛋白質。σNS 蛋白對包括呼腸孤病毒mRNA 在內的單鏈RNA 具有很強的親和力。有研究在從感染的細胞中分離呼腸孤病毒時，用核糖核酸酶A 處理后發現有大的（40～60 S）復合物解離[15]，這暗示σNS 和RNA 在感染期間形成大的核蛋白復合物。在相關的MRV 研究中，已從病毒感染細胞后形成的單鏈RNA 復合物中分離出σNS、μNS 蛋白和結構蛋白σ3，表明這些蛋白質參與制備用于負鏈合成的病毒轉錄物，并將其包裝到子代病毒的核心中。由于σNS 在感染過程中在包涵體樣結構內定位，所以被認為可招募其他病毒蛋白并且參與dsRNA 的合成[16]。還有研究表明，其他呼腸孤病毒σNS 和μNS 蛋白有重塑內質網，構建新細胞器的功能[17]。本研究發現，μNS 與σNS 可以相互作用，且這種相互作用是造成病毒感染細胞中包涵體樣結構中σNS 存在的直接原因。關于MRV、ARV 的研究都已說明μNS、σNS 蛋白在病毒增殖過程中的重要作用，但這2 種蛋白在可引起人類疾病的NBV 中的表達情況至今還未見報道。

本研究中筆者觀察到，盡管σNS 在感染期間與包涵體樣結構中的μNS 共定位，但當在沒有μNS 表達的情況下，其在整個細胞中彌散分布。當與μNS共表達時，σNS 被重新分布并與μNS 在包涵體樣結構中共定位。因此，σNS 對于功能性病毒包涵體樣結構的形成是必需的，但是在不存在μNS 蛋白的情況下不能建立包涵體樣結構。μNS 和σNS 在沒有其他病毒蛋白的情況下相關聯，表明這種關聯可能介導σNS 定位于病毒感染細胞的包涵體樣結構。與MRV和ARV的μNS和σNS蛋白相同，筆者的結果還表明，NBV 的μNS 蛋白在轉染細胞中可獨立表達，且在無任何其他病毒蛋白表達時即具有形成包涵體樣結構的能力。上述結果說明，μNS 是NBV 病毒感染期間包涵體樣結構形成的關鍵因素，且該蛋白質是包涵體形成所需的最小病毒成分。因此可知，μNS 在NBV 病毒增殖的早期階段，通過形成病毒復制位點及募集病毒復制所必需蛋白的方式起重要作用。

綜上所述，μNS 蛋白可在μNS 轉染和NBV 病毒感染細胞中形成包涵體，σNS 蛋白可與μNS 蛋白相互作用。上述結果揭示σNS 蛋白可通過與μNS蛋白關聯的方式被招募到包涵體樣結構中，這對于病毒的復制和裝配都非常重要，對呼腸孤病毒感染機制的研究、抗呼腸孤病毒藥物的研發具有重要意義。