銅綠假單胞菌超廣譜β-內酰胺酶耐藥基因的研究進展

李 越，鞠曉紅，李 瑤，駱曉峰 (吉林醫藥學院,吉林 吉林 132013)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)，也稱為綠膿桿菌，是臨床實踐中相對多見的一種條件致病菌,現已發展成為院內感染的重要病原菌之一。PA的抗性機制主要是水解酶的生成，超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases，ESBLs)的生成是導致超廣譜β-內酰胺類抗生素耐藥的重要原因。ESBLs是以將廣譜和窄譜頭孢菌素、單環類抗生素和盤尼西林等滅活為特征的一種β-內酰胺酶。臨床上抗生素的應用越來越多，導致PA對ESBLs耐藥的情況呈現出明顯上升的趨勢。現就PAESBLs耐藥基因的分類、流行情況及檢測方法進行綜述。

1 PA ESBLs耐藥基因的分類

PA對超廣譜β-內酰胺類藥物耐藥引起的院內感染是抗菌治療中最具挑戰性的目標之一。經過對PA的不斷研究與探索,在其中檢測出了多種類型的ESBLs耐藥基因。據悉國外已發現150多種基因類型[1]，主要分為GES、OXA、VEB、PER、SHV及其他少見類型，其中在中國以OXA和SHV最為常見。經研究在PA中已經檢測出的GES型耐藥基因有GES-1、GES-8和GES9等[2]，SHV包括SHV-1、SHV-2、SHV-2a、SHV-5及SHV-12等類型，其他的SHV型耐藥基因主要存在于大腸桿菌中[3]，還檢測出了PER-1、PER-2、PER-3和VEB-1等類型的耐藥基因[4]。并且主要存在于PA中的OXA型耐藥基因也被檢測出來了，至今OXA型耐藥基因已經被分離出58種以上的類型，分別命名為OXA-1～OXA-58，其中發現OXA-2、OXA-10、OXA-11及OXA-17等具有ESBLs活性[5]。對于ESBLs耐藥基因國內也在不斷對其進行深入的探索，近年來繼在一位老年重癥患者標本首次中發現了GES-5型后[6],相繼發現了OXA30、OXA-48、SHV-11和PER-3等耐藥基因型[7]。

1.1 GES型耐藥基因

在分子分類中，GES被歸為A類酶。它的性質與ESBLs的一般特性相似，通常對盤尼西林、超廣譜頭孢菌素和氨噻酸單胺菌素類抗生素具有耐藥性，對頭霉素類抗生素較敏感，其活性可被克拉維酸、三唑巴坦抑制[8]。因為GES蛋白中含有可以自身轉移的質粒，其轉化的接合子插入到質粒上使細菌對超廣譜β-內酰胺類抗生素產生耐藥性[9]，使得不一樣的基因型對抑制劑的敏感性和底物譜的水解能力存在一些差別[10]。在法國、南非、希臘及土耳其等地由GES引起的院內感染都被多次報道過[11]，通常都是引起爆發式感染。但在國內GES引起的感染比較少見，至今被國內報道的只有GES-1和GES-5，對此國內研究還不是很透徹。

1.2 OXA型耐藥基因

OXA主要在PA中檢測到，在其他細菌中偶見。OXA在分子分類上歸于D類酶，在OXA-10、OXA-2和OXA-1基因中都可以形成OXA型耐藥基因。其中以OXA-10的發展為主，它們間的同源性在20%～30%之間，PI值介于5.5～8.1[12]。OXA能夠誘導細菌外排泵的高表達，而被誘導的外排泵具有主動外排的機制，能夠將進入的藥物排出體外，形成耐藥機制。因此OXA型ESBLs耐藥基因對苯唑青霉素和甲氧西林的水解作用比較強，對于頭孢菌素類的水解能力低于盤尼西林類。克拉維酸等抑制劑也不能完全抑制OXA型耐藥基因的活性,但是在體外可以被NaCI強烈抑制[13]。OXA最初主要在法國和土耳被檢測出[14]，近年來我國也發現并報道了OXA型耐藥基因型，其中OXA在PA中的檢出率比較高，并對其耐藥機制及基因型的分布情況做了初步研究。

1.3 VEB型耐藥基因

VEB是一種不是很典型的小型ESBLs耐藥基因[15]。它的編碼基因主要定位于質粒，并且該質粒同時攜帶其他多種非β-內酰胺酶抗性基因[16]，誘導PA產生不同的滅活酶、鈍化酶和修飾酶,從而形成完整的耐藥機制[17]。該酶對頭孢噻甲羧虧和氨基曲南有高度的抗性,對克拉維酸具有敏感性,使頭孢噻甲羧虧與克拉維酸有明顯的協同作用[18]。VEB首次在越南被發現和報告，是在綠膿桿菌中被發現的，隨后在東南亞大量的腸桿菌和綠膿桿菌中被發現。VEB在中國比較少見[19]，目前國內正在致力于VEB-1的深入探索。

1.4 PER型耐藥基因

在分子分類中，PER被歸為A類酶，到目前為止，已發現3種耐藥基因型，分別是PER-1、PER-2與PER-3[20]。因為耐藥表型與基因型之間有良好的相關性，使得它具有水解氨曲南和氧亞氨基頭孢菌素的性質。并且PER型耐藥基因的活性可以被克拉維酸抑制劑所抑制,但其對EDTA和與氯唑西林并非特別敏感，對頭孢他啶有高度的耐藥性,對哌拉西林-三唑巴坦在一定程度上也有抗藥性[21]。目前，國內外對PER的研究報道都不是很多，對其引起的感染嚴重程度及傳播范圍也不是很清楚。

1.5 SHV型耐藥基因

SHV型是較早發現的酶型之一[22],它的結構基因發生突變導致酶的催化腔變大，無法阻止第三代頭孢菌素入酶體而被水解，使酶對第三代頭孢菌素的親和力被大大提高，從而擴大了SHV酶的耐藥譜，使臨床抗感染救治變的很艱巨，并在世界各地已經引起了高度重視[23]。在分子分類中SHV被歸為A類酶。現發現SHV的種類已經有一百多種了，SHV型ESBLs抗性基因的PI在7.0～8.2之間，固呈堿性[24]。SHV不能水解苯唑西林、廣譜頭孢菌素和頭霉素，但是水解氨芐西林的能力非常強，它還能夠高效地水解窄譜頭孢菌素與青霉素[25]。近年來SHV的研究已經成為熱潮，國內外相關報道明顯增多了不少，而中國報道最多的是SHV-12。

1.6 其他少見類型基因

除了GES、OXA、VEB、PER、SHV型耐藥基因外還有BEL、OXY、OKP、PSE等少見類型。因為不確定它們的流行范圍，檢出率極低，國內外對其的研究也特別少。因此關于這些少見基因型的研究還有很大的上升空間。

2 PA ESBLs耐藥基因的流行病學情況

1998年于法國圭亞那地區首次發GES型ESBLs耐藥基因之后就陸續被其他國家所發現，并且分離出GES-1、GES-2、GES-3及GES亞型等多種類型[26]。關于GES的流行病學情況在法國、南非、希臘等被多次報道過，通常都是由GES引起的爆發式院內感染[27]。國外文獻曾報道OXA型ESBLs耐藥基因主要存在于綠膿桿菌中，傳播途徑廣泛，傳播能力強。OXA的許多類型最初是在法國和土耳其被發現的，北非曾報道了由OXA-18引起了醫院感染的暴發流行[28]，目前GES和OXA型主要地理分布情況還不是特別明確。繼在越南發現綠膿桿菌中的VEB-1后，2001年9月,蔣曉飛等在上海瑞金醫院燒傷科重癥監護室檢測到綠膿桿菌中的VEB-1型耐藥基因，這是中國首次有VEB的報道。2003年，駱俊在華山醫院的陰溝腸桿菌中發現了VEB型耐藥基因[29]，VEB在國內還沒有被報道引起院內感染。PER-1型耐藥基因首次被發現是在法國，也是在PA中被檢測到。PER-2在阿根廷沙門菌分離株中以及玻利維亞的PA分離株中被依次檢測出來[30]。1974年Matth首次發現了于TEM相似的SHV-1，之后相繼分離出了SHV-2、SHV-3、SHV-4及SHV-7等一百多種基因型。SHV型耐藥基因相對其他類型的耐藥基因分布比較廣泛，在中國、法國、美國、韓國、意大利、日本及非洲北部的阿爾及利亞等許多國家都有關于其引起院內感染的報道[31]。全世界流行的耐藥基因類型各不相同，在中國以SHV-12為主。近年來，PA ESBLs抗性基因引起的院內感染逐漸增多，主要發生在有代謝性疾病、血液病、膿腫的患者及重癥患者術后抵抗力低下的人群中。然而治療情況卻沒有特別好，國內外關于它的報道在逐漸增多，也在研究控制的方法，院方應對此也給予高度重視。

3 PA ESBLs耐藥基因的檢測方法

PA ESBLs耐藥基因的檢測方法分為微生物學檢測法和分子生物學檢測法。微生物檢測法包括①藥敏紙片擴散法：選取所需的藥敏紙片，用標準紙片擴散法對涂有該菌液的MH瓊脂平板進行檢測，通過測量抑菌環直徑來確定基因類型；②E-test試驗：將藥物分別置于試紙條兩端，貼于涂好菌液的帶有刻度的平板上，進行培養，通過讀取試紙條兩端對應的刻度值確定所檢測的基因類型；③三維檢測法：該試驗是在紙片法的基礎上進行改良而形成的，將待測的菌液涂布在MH瓊脂平板上，在距離藥敏紙片3 mm的位置挖一個環形裂隙，吸取109～1010CFU/mL的菌液，加入裂縫中，菌液不能溢，進行培養，細菌生長過程中產生的水解酶會擴散開來，經過培養后分析所檢測的基因型;④自動化儀器法：通過相應的檢測儀器來檢測基因型。然而這些方法受溫度，濕度，酸堿度，培養環境等外部影響因素太多，導致檢測結果不是很準確。分子生物學檢測法包括聚合酶鏈反應(PCR)和PCR-單鏈構象多態性檢測,這些方法都是從基因的相關水平上進行檢測的，不易檢錯，外部影響因素少，因此特異性和靈敏度都非常的高，結果也更為準確。

由于超廣譜類抗生素使用的越來越多，使得ESBLs耐藥基因的耐藥性越來越強。目前，法國、美國等國耐藥基因的研究比較多并且不斷地有新的基因型被發現。國內主要致力于SHV及OXA型耐藥基因的研究及院內感染的控制。針對這兩種基因型我國研制出了克拉維酸等抑制劑，但是沒有顯著效果。因此對于ESBLs耐藥基因引起感染的控制已經成為目前首要的研究任務。