供核細胞對綿羊體細胞克隆效率的影響

郭延華,徐方野，李迎利，張譯元，王立民，唐 紅，皮文輝，周 平

(1.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室/新疆農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000;2 .石河子市獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫所，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】自從克隆動物多莉羊[1]誕生以來，相繼有17種克隆動物[2-3]出現(xiàn)。目前克隆技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于家畜育種，但效率低下制約著克隆技術(shù)的應用，這種效率的低下是由供核細胞不完全重編程和胚胎發(fā)育異常引起的。在眾多影響克隆效率的因素當中，核供體細胞作為一種關(guān)鍵因素，不僅在類型，年齡，狀態(tài)和細胞周期方面對克隆效率產(chǎn)生巨大的影響[4]，而且制作克隆動物的原代細胞和從克隆動物身上取得繼代細胞在克隆效率方面也存在差異[5]。這種差異是由供核細胞表觀遺傳差異引起的，成纖維細胞作為核移植供核的常用細胞，對其進行優(yōu)化選擇與處理在進行克隆顯得十分必要?！厩叭搜芯窟M展】成纖維細胞的選擇除了上述方面的差異之外，在不同個體之間也有較大差異[6]，但綿羊依據(jù)品種有肉用、毛用、乳用方面的差異，這種差異是否會引起克隆效率的差異尚未可知。在同一供體方面，轉(zhuǎn)基因細胞與原代細胞在克隆效率方面是否有差異比較有爭議[7-8]，但應用基因編輯技術(shù)篩選獲得的同一供體細胞多個克隆株之間在克隆效率方面的差異尚未可知。成纖維細胞傳代次數(shù)高并不利于克隆，而傳代次數(shù)低因個各實驗室操作規(guī)范不同就造成克隆效率差異較大，因此傳代次數(shù)的多少與匯合法抑制時間上的處理對克隆效率影響就不得而知?！颈狙芯壳腥朦c】前期研究發(fā)現(xiàn)供核細胞膜的貼壁特性對重構(gòu)胚融合效率有很大影響[9]，并未獲得較為充分的胚胎發(fā)育數(shù)據(jù)。研究從供核細胞的靜置時間與狀態(tài)，傳代次數(shù)與匯合期生長時間，相同來源個體和不同來源個體細胞株之間進行比較，優(yōu)化供核細胞的處理與選擇?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從供核細胞的靜置時間，研究傳代次數(shù)與周期處理，供核細胞不同克隆株，不同羊源細胞等，以重構(gòu)胚融合率和囊胚發(fā)育率為檢測指標，判定單因素供核細胞對克隆胚胎的影響。為獲得更多數(shù)量的克隆胚胎材料奠定科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試劑除特別說明外，均為日本和光藥業(yè)株式會社藥品。M199 (GIBCO)，、DMEM (GIBCO)、FCS (Hyclone)，胰酶替代物 (Gbico)，四孔板 (NUNC)，60 mm 培養(yǎng)皿(NUNC)，顯微操作針(Narishige)，石蠟油(Sigma M8410)，體式顯微鏡(Nikon SMZ800)，拉針儀 (NARISHIGE PN-30)，磨針儀(NARISHIGEEG-400)，煅燒儀(NARISHIGE MF-900)，顯微操作儀 (Eppendorf Transferman NK2)，CO2培養(yǎng)箱(New Branswick Galaxy 170S)，融合儀(Voltain EP-1 Australia)，0.5 mm 融合槽(BTX)。

1.2 方 法

1.2.1 卵母細胞的采集

從新疆石河子市活畜屠宰場收集綿羊卵巢，投入生理鹽水中，用0.4 L 保溫壺收集卵巢后 0.5～3 h 內(nèi)運回實驗室。室溫平衡30 min 后，清洗1次后剪去輸卵管連接部及多余的結(jié)締組織，用生理鹽水再清洗3～4 次，供采卵用。刺剖法采集：簡述如下，卵巢瀝干放入加好采卵液(M199+0.1% BSA+0.1 mg/mL 肝素+0.1 mg/mL慶大霉素)的100 mm 培養(yǎng)皿中，左手持尖頭眼科鑷子將卵巢固定在采卵液中，右手持手術(shù)刀片將突出卵巢皮質(zhì)、明亮的卵泡刺破并多剖數(shù)刀使其進入采卵液中，采完的卵巢在采卵液中輕輕晃動防止黏附。沉淀數(shù)分鐘后棄去上清液，用手拉巴氏管在體式顯微鏡下選取形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細胞復合體(Cumulus-oocyte complexs，COCs)進行成熟。

1.2.2 卵母細胞的成熟與處理

將采集到的COCs 用采卵液清洗2～3 遍，然后用成熟液清洗1～2 遍，放入預平衡2 h 的四孔板成熟液中 (M199+15% FBS+0.1 IU/mL FSH+0.2 IU/mL LH+1.0 μg/mL 雌二醇)，培養(yǎng)密度80 枚/mL，培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2、飽和濕度。體外成熟18 h 后，將擴散的顆粒細胞用移液器吹打除去，0.1%透明質(zhì)酸酶消化1 min 后繼續(xù)吹打以除盡顆粒細胞，用成熟液清洗2～3 次，移入預先平衡于60 mm平皿的成熟培養(yǎng)滴中，在體式顯微鏡下挑出排有第一極體的成熟卵母細胞以備用。

1.2.3 供體成纖維細胞的處理

用刀片剔除綿羊耳部邊緣的絨毛，75%酒精棉球擦洗耳組織2～3 次，棉片“C”包埋耳源消毒30 sec后，用取樣鉗夾取耳組織投入生理鹽水 (含 200 IU/mL 青霉素和220 μg/mL 鏈霉素)中帶回實驗室(運輸時間：東弗里生羊 6 h 、黑頭薩?？?2 h 、哈薩克羊 2 h 、澳洲白 24 h 、白頭薩?？?6 h )，移入超凈臺用眼科剪和鑷子剔除軟骨組織，生理鹽水清洗4～5 次，再投入75%酒精中浸15～20 s，生理鹽水清洗2～3次，移入30 mm 平皿中剪碎耳部皮膚組織，組織塊法培養(yǎng)在30 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為DMEM 加15% FBS。原代培養(yǎng)3～5 d后觀察組織塊貼壁和成纖維細胞遷出情況，每隔2 d換液1次。待原代成纖維細胞生長至80%～90%連成片后，用胰酶替代物消化3～5 min，用含15% FBS的DMEM 培養(yǎng)液 (含EGF 10 ng/mL，IGF10 ng/mL)進行傳代培養(yǎng)，每2 d 換液1次，傳1～2代之后凍存?zhèn)溆谩?/p>

供體細胞的靜置狀態(tài)與處理：在前期的研究中[9]，發(fā)現(xiàn)在15 min內(nèi)有30%以上的細胞發(fā)生貼壁行為具有較好的融合性。為了進一步規(guī)范核移植操作，發(fā)現(xiàn) 15～30 min 內(nèi)的供核細胞發(fā)生輕度的貼壁行為，而靜置時間在 2 h 左右的供核細胞有超過50%以上的貼壁行為。在此區(qū)分細胞靜置狀態(tài)并設置分組，15～30 min 內(nèi)更換1次供核細胞的處理稱為懸浮組，而 2 h 左右更換1次供核細胞的處理稱為貼壁組。

供體細胞的傳代與匯合抑制處理：將供體細胞解凍后，3 d后生長匯集至90% 以上進行1次傳代，依據(jù)試驗要求將解凍后代供體細胞進行1、2、3次傳代，細胞生長到平臺抑制期24和48 h 收集，200 μL培養(yǎng)液重懸浮供體細胞，4℃保存以備用。

供體細胞單克隆株挑選：將供體細胞用胰酶替代物進行消化3 min，輕拍或圓周運動晃動30 mm培養(yǎng)皿，使供體細胞脫離皿底漂浮，超過消化時間(3～5 min)的供核細胞丟棄。吸出漂浮的細胞2 500 r/mim離心收集至1.5 mL EP管，100 μL 懸浮，用含10%胰酶替代物的PBS清洗液懸浮少量細胞并晃動均勻，以體式顯微鏡能夠觀察到松散分離的單個供體細胞為準，貼壁的細胞放棄種植單克隆。在超凈臺內(nèi)的體視顯微鏡下，用口吸巴士玻璃管挑取表面光滑圓潤的單克隆細胞，然后種入96孔板，培養(yǎng)皿中含有100 μL 15%FBS的DMEM培養(yǎng)液，3 d換液1次，觀察細胞直至長滿進行收集。

1.2.4 卵母細胞與供核細胞的重構(gòu)

用60 mm 培養(yǎng)皿制作操作液(M199+25 mmol/L Hepes+20% FBS) 并覆蓋石蠟油，移入顯微操作臺將注射針與固定針移入操作視野內(nèi)。將受體卵母細胞用含7.5 μg/mL CB 的成熟液培養(yǎng)10 min，用巴氏管將供體細胞和卵母細胞移入操作液中進行盲吸去核，固定針吸住卵母細胞，第一極體指向12 點方向，去核針刺入剜除極體及周圍少量細胞質(zhì)，吐出卵母細胞質(zhì)，吸取供體細胞放入11 點方向。

1.2.5 融合、激活與培養(yǎng)

將重構(gòu)的卵母細胞-供核細胞復合體放入成熟液中恢復30 min 后，移入融合液中平衡2 min，然后把卵子放入覆蓋融合液(0.3 mol/L 甘露醇+0.5 mmol/L Hepes+0.1 mmol/L CaCl2+0.1 mmol/L MgCl2) 的融合槽電極之間，調(diào)整細胞膜的接觸面與電極平行，施加直流電脈沖，融合參數(shù)根據(jù)試驗調(diào)整脈沖場強125 V，脈沖次數(shù)2 次，脈沖時程20 μs。每批5～8 枚/次，操作完后卵子/供核細胞復合體放入培養(yǎng)液，30～60 min 后觀察融合情況，剔除沒有融合的復合體。放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，從重構(gòu)胚融合完計時2 h 后進行激活，激活液與激活時間分別為7%乙醇7 min、2 μmol/L 6-DMAP 4 h，激活完畢后移入SOFaa清洗3 遍。38.5℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d 后檢查囊胚率并統(tǒng)計。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPASS18.0 進行卡方或方差檢驗，P<0.01為差異極顯著；0.010.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體細胞的懸浮狀態(tài)對重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響

研究表明,在融合率方面，貼壁組2 h更換1次供核細胞的融合效率比懸浮組15～30 min更換1次供核細胞的融合效率要低，差異極顯著(78.84% vs 90.10%)(P<0.01)，但囊胚率差異不顯著(15.58%vs 14.65%)(P>0.05)。表1

表1 供核細胞的靜置狀態(tài)下重構(gòu)胚體外發(fā)育變化
Table 1 Effect of statical state on development of reconstructed embryos in vitro

2.2 復蘇的供體細胞傳代次數(shù)和匯合期抑制時間對克隆胚體外發(fā)育的影響

研究表明,在融合率方面，供體細胞生長匯合24和48 h時的差異不顯著(70.37%、76.03%、71.92%vs 72.97%)(P>0.05)。在囊胚率方面，解凍的供核細胞d2代比d1代高(9.06% vs 5.96%)，但差異不顯著(P>0.05)；d3代比d2代高(15.85% vs 9.06%)，差異顯著(P<0.05);d3組與d1組相比(15.85% vs 5.96%)差異極顯著(P<0.01)。而d3組，平臺期抑制48 h的供核細胞組囊胚率比抑制24 h的供核細胞組囊胚率高(20.16% vs 15.85%)，但差異不顯著(P>0.05)。表2

2.3 同一細胞不同克隆株對克隆胚胎發(fā)育的影響

研究表明,同一供體(東佛里生羊)早期原代細胞挑選2個96孔板即192個單克隆株培養(yǎng)后，其中7株具有較好的傳代性。在制作重構(gòu)胚時，供核細胞在融合方面存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的差異性，但無規(guī)律可尋。在囊胚率方面，供核細胞對囊胚率的貢獻表現(xiàn)為顯著(P<0.05)或者極顯著性(P<0.01)，但無規(guī)律可尋。表3

表2 供核細胞的傳代和匯合期G0/G1抑制時間下重構(gòu)胚發(fā)育變化
Table 2 Effect ofpassages and G0/G1 phase period of confluency cell on development of reconstructed embryos in vitro

解凍傳代次數(shù)Passagesof thawed cell G0/G1抑制時程G0/G1 phase period of confluency cell(h)核移植數(shù)Couplets融合率Fusion rate(%)囊胚率Blastocyst rate(%)d12440570.37(285)5.96Aa(17)d22436376.03(276)9.06Aa(25)d32434271.92(246)15.85Bb(39)d34833372.97(243)20.16Bb(49)

表3 同一細胞不同克隆株下重構(gòu)胚體外發(fā)育變化
Table 3 The developmental of reconstructed embryos in vitro from Different line of mono adult fibroblast cell

同一細胞不同克隆株Different lines of mono donor核移植數(shù)Couplets融合率Fusion rate(%)囊胚率Blastocyst rate(%)424774.89Aa(185)18.92aA(35)1026482.19b(217)23.96aA(52)1141684.13Bb(350)34.57Bb(121)1922577.33Aa(174)22.99aC(40)2355678.95ab(439)32.12Bc(141)3824087.08Bb(209)25.84ac(54)11222786.34Bb(196)22.96aC(45)

2.4 不同供體羊細胞株對克隆胚胎發(fā)育的影響

研究表明,由不同供體羊建立的細胞株，在細胞直徑方面存在差異性，在融合率方面存在極顯著的差異性(P<0.01)。在囊胚率方面，肉羊重構(gòu)胚囊胚率極顯著(P<0.01)高于其他品種的囊胚率。表4

3 討 論

目前用于構(gòu)建克隆動物和胚胎的供核細胞主要有乳腺上皮細胞[1]、顆粒細胞[10]、輸卵管上皮細胞、幼齡或成年動物成纖維細胞[11-12]，以及小鼠腦組織細胞[5]。但在這些供核細胞建立時，每種細胞都有自己的培養(yǎng)特性和傳代特性，尤其是2種類型以上的細胞在同一組織中，在細胞建系時通常用到差速貼壁法建立并純化細胞[13]，在早期的研究中依據(jù)該原理發(fā)現(xiàn)成纖維細胞通過差速消化獲得的供核細胞對重構(gòu)胚的融合率有影響[8]，后來通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)在貼壁效率上有差異的供核細胞其生長曲線也有差異性[9]，因此，試驗進一步規(guī)范操作過程，發(fā)現(xiàn)15～30 min內(nèi)懸浮的供核細胞用于重構(gòu)胚的融合效率極顯著高于長時間靜止在操作液中的供體細胞制作重構(gòu)胚的融合效率。推斷重構(gòu)胚的融合效率與供核細胞在短時間內(nèi)的細胞膜貼壁粘性有較大的關(guān)系，而長時間的靜置造成供核細胞膜粘性降低，而不利于couplets細胞膜的融合，但與克隆胚胎的囊胚率沒有顯著的相關(guān)性。

表4 不同供體羊細胞株下克隆胚胎發(fā)育變化
Table 4 The developmental of reconstructed embryos in vitro from Different line of multiple adult fibroblast cell

綿羊細胞品種Breeds of owe cell供核細胞直徑Cell diameter(μm)核移植數(shù)Couplets融合率Fusion rate(%)囊胚率Blastocyst rate(%)東佛里生羊East Friensian Milk sheep14.53±2.7476781.22B(623)12.52A(78)哈薩克羊Kazakh sheep18.13±2.722 71075.68A(2 051)13.90A(286)黑頭薩福克Black suffolk21.33±2.411 82983.82B(1 533)18.66B(286)澳洲白Australian white sheep20.34±1.971 64177.51A(1 272)24.06C(306)白頭薩?？薟hite suffolk22.23±2.861 91681.89B(1 569)26.45C(415)

供核細胞在生長階段G0、G1、S、G2/M期中、G1期停留的時間較長，為了使核移植供核細胞達到同期化，主要有血清饑餓法和生長匯合抑制法。多數(shù)研究人員支持血清饑餓處理法[14]以提高G0/G1期中G0期供核細胞比例，而生長抑制法并不能顯著提高G0的供核細胞比例[15]，卻是G1期細胞比例增加。隨著傳代次數(shù)的增加，這種處理不僅增加了染色體的異常率，而且會降低克隆胚胎和動物的制作效率[16]，同時血清饑餓法隨著血清饑餓時間的增加，會逐漸引起供核細胞的凋亡和克隆囊胚凋亡小體比例增加[17-18]，因此，降低傳代次數(shù)，如何改善供核細胞以提高效率就成為一個重要的問題。通過試驗發(fā)現(xiàn)，解凍的早期供核細胞隨著傳代次數(shù)的增加其重構(gòu)胚囊胚率越來越高，尤其是增加匯合期生長時間，囊胚率有漸進性的提高，推測隨著匯合期生長時間的延長能夠提高G1期細胞的比例。Sangho Roh等[16]研究供核細胞隨著匯合時間的延長，G1期的細胞比例有所增加，而LiBing Ma等[19]用改進的先匯合再饑餓法也有提高G0/G1期細胞比例從而改善克隆效率，這就表明匯合期增加供核細胞接觸抑制的時間能促進重構(gòu)囊胚的發(fā)育。此外目前的觀點認為傳代次數(shù)的增加不利于提高克隆效率，但Chikara Kubota等[20]將體細胞連續(xù)傳代后再進行血清饑餓反而提高了克隆動物的效率，換句話說這是否解釋為原代細胞或者解凍細胞通過短暫的幾次傳代能夠得到改善，但不是因為傳代多次染色體的異常而提高了克隆囊胚的效率[21]，上述試驗證實這種假設是成立的。此外值得注意的是生長期階段的細胞通過控制時間差拍打法(shake-off，30～60 sec at medium speed)也能夠獲得較高G1期的細胞比例[16]，從而促進克隆效率。

生長狀態(tài)良好的細胞不僅表現(xiàn)出良好的傳代貼壁特性，而且后期凋亡的細胞數(shù)量也小[9]。同時隨著短暫傳代次數(shù)的增加也逐漸表現(xiàn)出供體細胞對克隆囊胚的貢獻特性如試驗2結(jié)果。對于單細胞克隆株，依據(jù)觀察記錄來看，傳代過程中尤其需要注意定時、及時更換液體以除去早期凋亡、生長能力差或者衰老的細胞。在制作轉(zhuǎn)基因克隆動物時，不論是那種轉(zhuǎn)基因方法，單一細胞的穩(wěn)定遺傳信息更有助于研究，那么同一細胞不同細胞株之間是否有差異，通過研究發(fā)現(xiàn)，同一成纖維細胞來源不同單細胞株之間不僅在融合方面表現(xiàn)出較大的差異性，而且在重構(gòu)胚囊胚率方面也表現(xiàn)出較大的差異性，這就進一步表明同一供核細胞株在傳代過程中，更多因為人為的因素而造成細胞株之間的差異性，但也有研究表明轉(zhuǎn)基因與否并不影響克隆動物的獲得[22]。此外試驗結(jié)果也表明,融合特性較好的供體細胞組在囊胚率方面也稍微高于融合特性較差的細胞組，但不排除融合特性差的供體細胞能夠獲得較多數(shù)量的克隆囊胚。

在同一細胞來源不同單細胞株之間進行了比較，而且在不同個體羊建立的細胞株之間也進行了比較。結(jié)果表明，不同品種的羊不僅在供核細胞直徑方面是有差異性的，而且在重構(gòu)胚制作效率方面也具有差異性。在制作重構(gòu)胚時，因供核細胞的選擇具有較大的隨意性，與操作人員有很大的關(guān)系，也直接影響著克隆胚的效率，研究表明,進行小中大區(qū)分的供核細胞中，同批次細胞直徑越小的細胞G1期(生長匯合法)或者G0(血清饑餓法)比例越高[15]，這就解釋了重構(gòu)胚囊胚率差異較大的試驗現(xiàn)象。此外，Nisar A也發(fā)現(xiàn)不同個體之間的供體細胞在克隆效率和動物妊娠方面存在較大的差異[23-34]?？寺∨咝什粌H受到細胞直徑(或人為判斷)的影響，而且受到供體細胞株本身的影響，研究中，肉羊細胞株的克隆效率高于其他品種綿羊細胞株的克隆效率，進一步講這是否說明克隆效率是否與采樣時供體的營養(yǎng)水平或肉用品種有直接關(guān)系有待進一步證實，但可以肯定的是克隆胚效率的高低具有較大的隨機性。

4 結(jié) 論

復蘇的供核細胞經(jīng)過短暫的3次傳代，延長匯合期細胞生長時間至48 h，在操作液中短時間(15～30 min)的靜置，為避免細胞培養(yǎng)時的人為因素，同批次供核細胞或不同個體多選擇幾株供核細胞更有利于克隆胚的制作，可以獲得較多數(shù)量的克隆胚。