骨髓間充質干細胞及其外泌體治療椎間盤退變的研究進展

張曉勃，施錦濤，張凱，胡一村，王克平，周海宇*

1蘭州大學第二醫院骨科，蘭州 730030；2甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，蘭州 730030；3西固區人民醫院骨科，蘭州 730060

下腰痛(low back pain，LBP)是最常見的肌肉骨骼疾病之一，與椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)密切相關[1]。據統計，多達80%的人一生中至少遭受一次LBP困擾[2]。IDD的主要病理改變為髓核(nucleus pulposus，NP)細胞減少和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)分解，而目前的治療策略(包括手術治療和非手術治療)均無法補充減少的NP細胞或逆轉椎間盤退變的病理變化。近期研究發現，間充質干細胞可在一定條件下分化為NP樣細胞，通過補充椎間盤內減少的NP細胞而延緩IDD進展[3-4]。目前用于研究治療IDD的常用外源性干細胞主要包括髓核間充質干細胞、骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、脂肪間充質干細胞(adipose mesenchymal stem cells，AMSCs)、臍帶間充質干細胞及肌肉源性干細胞。其中BMSCs作為細胞治療和組織工程中最常用的干細胞，在IDD治療中表現出巨大優勢，不僅可減緩椎間盤高度的下降，還可明顯緩解患者的臨床癥狀[5-6]。本文就近年來BMSCs及其外泌體在IDD治療中的研究進展予以綜述，以期為臨床提供參考。

1 BMSCs概況

1.1 生物學特性 BMSCs是一類存在于骨髓中的非造血干細胞群，具有自我更新能力和多向分化潛能[7-9]，以及一定的歸巢能力。其中歸巢能力是指BMSCs能夠遷移到受損部位然后分化為損傷部位的局部成分，并分泌有助于組織再生的趨化因子、細胞因子和生長因子。有研究證實，BMSCs的歸巢能力可增強椎間盤細胞的存活和再生能力，預防IDD進一步惡化[10]，但其治療效果在一定程度上取決于移植入損傷部位的時間以及歸巢時各種化學因素(如趨化因子、細胞因子、生長因子等)和機械因素(剪切應力等)的影響[11]。有研究表明，腫瘤壞死因子超家族中的Fas可誘導BMSCs歸巢[12]。如何通過技術手段提高BMSCs的歸巢能力并適當調節外界因素以進一步提高其治愈能力，可能會成為新的研究方向。

1.2 治療優勢 目前干細胞研究主要集中于BMSCs和AMSCs，后者對IDD具有一定的治療效果，干預后椎間盤高度下降速度減慢，Pfirrmann分級降低，組織學改變減輕[13]。Zhou等[14]將BMSCs和AMSCs分別與纖維環細胞共培養21 d，采用免疫組化、二甲基亞甲基藍(DMMB)測定法以及定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測纖維環標記物膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖的表達，結果顯示，在共培養的一段時間內，三種基因在BMSCs和ADSCs中的表達均增加，且可分化為纖維環(annulus fibrosus，AF)樣細胞。其中纖維環標記物膠原蛋白Ⅰ在BMSCs中表達量最多，提示BMSCs具有更強的向纖維環樣細胞分化的能力，作為纖維環修復的細胞來源可能更好。此外，BMSCs修復退變椎間盤內NP的能力強于AMSCs[15]。BMSCs移植治療IDD是一種潛在的誘導椎間盤再生、ECM生長、向良好的合成代謝平衡轉變以及減輕疼痛的方法，可能是治療IDD的最佳種子細胞。

1.3 治療潛能 BMSCs向骨、軟骨等組織分化的能力及較強的自我增殖和免疫耐受特性為細胞移植治療提供了可能。2003年Sakai等[16]首次發現BMSCs可以減緩兔椎間盤退變，為后續BMSCs在IDD中的研究奠定了基礎。

目前BMSCs治療退變椎間盤的作用機制已取得突破性進展。Risbud等[17]首次在體外條件下發現，BMSCs在低氧和轉化生長因子-β1(TGF-β1)的誘導作用下可向NP樣細胞分化，有助于補充退變椎間盤內減少的NP細胞。IDD常見于老年人群，與椎間盤細胞的過早衰老和功能障礙有關。Li等[18]采用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導NP細胞衰老后與鼠BMSCs共培養，發現BMSCs可誘導NP細胞中衰老相關分泌表型的減少，并可促進NP細胞增殖和Ⅱ型膠原蛋白表達。衰老相關的鋅金屬肽酶STE24(ZMPSTE24)在衰老NP細胞中表達有所降低，但在與BMSCs共培養后得以恢復。BMSCs可能通過上調ZMPSTE24來減輕或預防NP纖維化并恢復NP的活力和功能狀態。另有研究發現，BMSCs可通過抑制TLR2/NF-κB通路減緩IDD進展[19]。以上研究不同程度地證實了BMSCs對IDD的治療是有 效的。

2 BMSCs移植治療IDD

2.1 動物實驗 近年來，BMSCs移植治療IDD已在動物退變模型中得到證實。Teixeira等[20]將人BMSCs培養于牛退變椎間盤NP孔中，通過檢測BMSCs的凋亡和遷移分析其對炎性環境的反應發現，退變椎間盤環境不影響干細胞的活力，可促進細胞向損傷部位遷移；干細胞可能通過旁分泌方式下調IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子的表達，提示BMSCs可能通過分泌細胞因子延緩IDD。

單純注射BMSCs雖然具有一定療效，但有時并不能取得較好的修復效果。Yan等[21]在兔IDD模型中通過檢測移植后椎間盤內Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖、TGF-β1和水分含量，比較BMSCs移植和BMSCs聯合不同濃度丹參酚酸移植的治療效果，結果顯示，丹參酚酸B(1～10 mg/L)聯合BMSCs修復退變椎間盤的效果更優。Yi等[22]從新西蘭兔中提取BMSCs，針刺誘導兔IDD模型，通過攜帶金屬蛋白酶組織抑制因子1(hTIMP-1)的重組腺病毒載體轉染獲得轉基因BMSCs(TBT組)。建模成功后分別移植到損傷誘導的變性椎間盤模型的NP中，然后檢測椎間盤ECM含量和hTIMP-1的表達。與對照組(接受無細胞磷酸鹽緩沖生理鹽水)相比，TBT組和BT組(接受未改變的BMSCs移植)的退行性改變明顯減輕，ECM含量明顯增加，TBT組ECM含量高于BT組，hTIMP-1 mRNA和蛋白水平高于BT組。該研究表明，細胞移植通過攜帶藥物或基因可能具有更佳的治療效果，這可能會成為未來IDD細胞移植療法的新途徑。

2.2 人體實驗 目前干細胞療法已被廣泛應用于臨床治療急性肺損傷、糖尿病、移植物抗宿主病、慢性缺血性心臟病、心力衰竭等疾病并取得了顯著效果[23-27]。BMSCs已初步應用于臨床IDD試驗。一項研究調查了與自體BMSCs共培養后的NP細胞移植治療IDD的安全性，共9例Ⅲ級IDD患者隨訪3年期間無不良事件發生，所有患者的椎間盤均未進一步退變，1例有明顯改善，患者LBP評分降低，表明與BMSCs共培養后的NP細胞移植治療有效，可在受試者中安全應用[28]。2019年Henriksson等[29]探討了BMSCs移植后在4例(年齡分別為41、45、47和47歲)IDD患者體內的存在和分布規律。BMSCs用蔗糖鐵標記，在移植8個月后可檢測到BMSCs存活于椎間盤不同部位并分化為軟骨細胞，刺激原有細胞產生ECM。一項經皮自體BMSCs注射再生椎間盤研究共納入98例患者，注射前均接受非手術治療，治療后生活質量顯著改善，在一年的隨訪中，平均殘疾指數(ODI)從“嚴重殘疾”提高到“最低殘疾”，在注射部位未觀察到其他不良事件，且無論干細胞的來源如何，患者的臨床和放射學結果的整體改善均得到證實，隨訪期間并發癥發生率很低[30]。

雖然上述少數病例研究臨床療效顯著，且無明顯不良反應，但存在較大的偏倚風險，以及樣本量小和缺乏比較等問題，干細胞移植治療IDD的有效性和安全性證據受到質疑。2019年Meisel等[31]從1039篇相關文獻中篩選了10篇關于腰椎椎間盤細胞治療的文獻，最終納入的8篇均為小規模病例研究，病例系列中有限的數據表明，細胞治療對自體細胞來源的疼痛和功能可能有所改善，但這些變化是否具有臨床意義尚不清楚，相關安全數據和報道較少。因此，尚需進行高質量的對比研究以及更多的臨床試驗研究證明細胞移植的可行性和安全性。

細胞移植可能引起免疫排異而導致移植失敗。Shi等[32]比較了新生兒和兔真皮成纖維細胞在兔退變椎間盤中的宿主免疫應答，發現移植入兔椎間盤的人體細胞未較兔細胞引起更高的免疫應答，表明椎間盤能夠耐受同種或異種移植。有研究證實，椎間盤退變、外傷等情況導致生理性屏障破壞，NP組織與免疫系統接觸后會引起較嚴重的免疫反應，而在生理性屏障未破壞時免疫反應的發生風險較 低[33-34]。因此，在一定條件下細胞移植治療人IDD的干細胞理論上也可來源于動物，但動物干細胞是否可在特定環境下如椎間盤纖維環未破裂時起作用，尚未發現相關報道。

2.3 生物材料支架 適當的細胞支架可以維持移植細胞的活力和功能，而水凝膠可模擬NP的天然ECM環境，并可為細胞提供結合位點，可能成為合適的細胞支架。Nakashima等[35]向兔受損椎間盤內注射交聯透明質酸水凝膠和交聯硫酸軟骨素水凝膠發現，注射后椎間盤大多保留了MR的正常信號強度。Wang等[36]發現，在大鼠IDD模型中注射水凝膠加載的BMSCs可以延緩IDD，促進退化的椎間盤再生。Vickers等[37]從細胞水平驗證了干細胞在NP凝膠中的生存能力和分化能力，證實N'-二甲基丙烯酰胺水凝膠可在不需要額外生長因子的情況下誘導人干細胞向NP細胞分化，并同時表達蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白。另有學者發現，氧化還原聚合的羧甲基纖維素水凝膠作為BMSCs載體也具有一定療效[38]。 總之，以水凝膠為載體攜帶BMSCs植入退變的椎間盤可能是一種有效的治療方案。

Zhang等[39]制備微囊化兔軟骨細胞與BMSCs共培養，通過檢測BMSCs細胞活性、Ⅱ型膠原蛋白和糖胺聚糖的表達發現，微囊共培養體系不會影響BMSCs的增殖，反而增強了其生成Ⅱ型膠原蛋白和糖胺聚糖的能力。體內實驗結果顯示，微囊化骨軟骨細胞和BMSCs共培養組的椎間盤修復效果優于其他非微囊化骨軟骨細胞組。此外，低溫保存的微囊化BMSCs被證實具有修復退變椎間盤的效果，BMSCs包埋在藻酸鹽微膠囊中，低氧低溫貯藏后將微膠囊注射入牛離體的椎間盤NP中，發現NP細胞與BMSCs微膠囊共培養能產生更多的基質成分，相比于微囊化BMSCs，BMSCs在基質合成方面存在不足，這種差異在體外器官培養模型中得到了驗 證[40]。隨著研究的不斷深入，Zhang等[41]在納米水平研究發現，裝載基質細胞衍生因子(SDF-1α)的白蛋白/肝素納米粒子注入退變椎間盤可以誘導椎間盤再生，且對BMSCs歸巢具有強有力的趨化作用。越來越多的研究表明，利用細胞與生物材料支架相結合的組織工程方法可以恢復椎間盤高度、再生ECM，從而延緩IDD，未來組織工程可能成為一個很有前景的治療方案。

2.4 BMSCs移植療法的局限性 干細胞在再生醫學中表現出巨大的潛力，但目前誘導分化方案尚未完善，常用的誘導方案包括低氧環境、轉化生長因子(如TGF-β1)、生長分化因子(GDF)家族成員等，部分方案脫離了NP的細胞外環境[17,42-44]。Xu等[45]開發了一種優化的脫細胞NP支架，保留了大部分的生物成分和規則的微觀結構，并可在體外誘導干細胞分化成NP樣細胞，但仍缺乏一定的實驗依據。

既往研究表明，采用移植NP樣細胞修復退變椎間盤，椎間盤無血管化時移植并不會引起炎癥反應，可以降低排斥風險，但在已有異常血管長入NP組織時移植風險無法預測[46]。Maidhof等[47]評估了介入時機對椎間盤生物化學和生物力學的影響，在大鼠椎間盤穿刺損傷后第3、14和30天分別注入干細胞，結果顯示，損傷后第3天給予的干細胞在椎間盤部位保留得最多，表明在疾病進展的早期階段進行細胞治療可能更有效，這可能是因為損傷相關的炎性微環境增強了間充質干細胞的活性，但早期細胞移植是否會帶來其他風險尚未可知，且臨床就診患者多數已進入退變晚期。此外，在選擇用于臨床的NP干細胞來源時，應考慮由于椎間盤的退變環境而引起NP干細胞衰老的問題[48]。組織工程的應用似乎是目前較為有效的新型治療措施，Vaudreuil等[49]利用一種可光聚合的生物凝膠支架將干細胞植入兔NP中，結果發現無法避免骨贅形成和纖維環破壞。

綜上，雖然細胞移植療法具有一定的治療前景，但仍面臨著巨大挑戰：①如何確定細胞移植的最佳時間，以及如何準確判斷退變開始的時間； ②移植后如何減少骨贅形成，減少不定向分化以及降低腫瘤發生的風險；③移植后的細胞存活率問題；④因移植操作而導致的纖維環破壞或其他并發癥反而加快IDD；⑤如何避免或減緩干細胞衰老；⑥移植排斥反應。

3 BMSCs外泌體在IDD中的研究

3.1 外泌體的特點 隨著細胞研究的不斷深入，從細胞中分離的外泌體(exosomes)作為干細胞潛在的替代品成為現今關注的焦點。外泌體是幾乎所有細胞類型都可產生的一種膜性囊泡，是細胞間通訊的關鍵信使[50]。干細胞是外泌體最常用的來源，干細胞來源的外泌體包含多種功能蛋白、mRNA、miRNA和信號脂質[51]，其直徑在30～100 nm，來源于核內體并儲存在多泡體中，通過與細胞膜融合將脂質、核酸、蛋白質等多種生物活性物質傳遞給受體細胞，引起受體細胞功能或活性改變，發揮細胞間物質交換和信息交流的作用[52-53]。外泌體具有性質穩定，易保存、易獲取、易轉化，無免疫原性等特點，具有廣闊的應用空間。鑒于外泌體的多種功能和優勢，注射攜帶特定基因和治療藥物的外泌體可能會成為IDD無細胞治療策略的合適選擇[54]。

3.2 外泌體在其他疾病中的應用 外泌體在醫學治療上具有多種潛能，目前的研究集中于腫瘤、藥物輸送和再生醫學領域[55]。外泌體的特征是小RNA的聚集，包括mRNA、miRNA、tRNA和lncRNA[56-57]。這些RNA分子和蛋白質一起作為遺傳物質，通過外泌體的轉移在細胞通訊中發揮至關重要的作用[58]。外泌體中的RNA主要是miRNA，具有多種生物功能。Valadi等[59]研究發現，小鼠外泌體miRNA轉移至人肥大細胞后，在受體細胞中發現了新的小鼠蛋白。外泌體作為載體轉運遺傳物質，通過誘導受體細胞功能和活性的改變，引起細胞行為的改變。隨著生物醫學的發展，外泌體正迅速發展為一種新的腫瘤治療方法，臨床上可用于疾病診斷(標志物、液體活檢)[60]、藥物載體[61-62]、疾病靶標[63]以及預后監測[64]。目前干細胞外泌體已在多種疾病的診斷和治療中發揮重要作用，包括骨關節炎、膀胱癌、惡性腫瘤、皮瓣損傷修復、眼病等[65-69]，但在IDD中的研究目前仍處于起步階段，深入了解外泌體形成的亞細胞成分和機制以及特定的細胞靶向具有重要意義。

3.3 外泌體的分離、鑒定和儲存 目前外泌體的分離方法主要包括超速離心法和聚合物沉淀法，其中超速離心法包括簡單超速離心、密度緩沖離心和密度梯度離心，在產量上差異很小。簡單超速離心是分離外泌體最常用的方法，會產生更多的蛋白質污染和外泌體的聚集[70]。而外泌體商業試劑由于會引起嚴重的聚集和污染并不適用于臨床。因此，目前外泌體治療面臨的最大困境是外泌體的提取產量較低，以及如何維持提取外泌體的物理性質并防止其污染。外泌體鑒定方法包括形態學鑒定(電鏡)、粒子大小分析(粒徑分析)及標志蛋白鑒定(Western blotting)。其中透射電鏡可以清楚地觀察到外泌體的大小、形態，屬于鑒定方法的金標準。外泌體的儲存條件為-80 ℃下存儲于磷酸鹽緩沖液中，先前研究表明在較高溫度下儲存會減少外泌體及其內含物的數量，而在-80 ℃下儲存則變化較小[71]。

3.4 BMSCs外泌體治療IDD

3.4.1 作用機制 目前BMSCs外泌體(BMSCs-exo)修復退變椎間盤的作用機制研究已取得一定成果。2019年一項研究表明，椎間盤內NP細胞來源的外泌體可促進BMSCs遷移并誘導其向NP樣細胞分化，可能與Notch1通路的抑制相關，并且其分化能力強于細胞間接共培養[72]。Cheng等[73]發現BMSCsexo可以抑制TNF-α誘導的NP細胞凋亡，這可能與外泌體miR-21通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt通路靶向磷酸酶和緊張素同系物(PTEN)轉入NP細胞有關。Liao等[74]采用RNA干擾、免疫組化等方式評價了BMSCs-exo的作用機制和治療效果，發現退變椎間盤組織內質網應激水平和凋亡率升高，外泌體通過激活Akt和ERK信號通路減弱內質網應激誘導的細胞凋亡，并且在大鼠模型中得到驗證，首次證實了BMSCs-exo可以調節年齡相關椎間盤變性時應激誘導的細胞凋亡。有研究表明，過度的氧化應激和炎癥反應是IDD發生的關鍵早期事件，而NLRP3炎性小體是引起氧化應激和炎癥反應的主要原因。Xia等[75]發現，在兔退變椎間盤內，BMSCs-exo通過抑制炎性介質和NLRP3炎性小體的活化在NP細胞中發揮抗炎作用，顯著阻止了退行性變的發生。此外還發現，外泌體可為NP細胞提供線粒體蛋白，通過補充外泌體可以修復受損的線粒體。

3.4.2 應用優缺點 外泌體的應用避免了干細胞移植的免疫排斥反應，其性質穩定，易保存、易獲取、易轉化，并具有較低的免疫原性。基因治療和細胞因子治療是延緩甚至逆轉IDD的新途徑[76]，但將外源性基因導入椎間盤細胞仍是一個難題，而外泌體是一種有希望的非病毒基因治療載體，越來越多的實驗證實了外泌體在IDD中的治療作用，進一步研究其作用機制具有重要意義。

外泌體治療劑的開發面臨諸多挑戰，生產率較低，商業化制備的外泌體因具有嚴重的蛋白質污染和聚集而無法用于臨床治療。由于其異質性和低生產率，生產外泌體制劑是治療應用的主要障礙，需要開發和優化生產方法，包括分離和儲存外泌體制劑的方法。此外，外泌體的治療潛力和遞送效率的提高對其臨床應用亦非常重要[77]。外泌體有望成為治療各種疾病的有效治療劑，因此應開發用于大規模生產的方法，同時優化分離和儲存的方法。

3.4.3 治療前景 已有研究初步表明了BMSCs-exo在治療IDD中的巨大潛力。BMSCs-exo可促進退化NP細胞增殖和健康ECM生成[54]。NP細胞來源的外泌體可促進BMSCs遷移并誘導BMSCs分化為NP樣表型。外泌體作為BMSCs與NP細胞間信息交流的重要工具，具有多種功能和多重優勢，單獨應用或裝載特定基因和藥物是無細胞治療IDD的新型策 略[54]。一旦外泌體的特性和生物學特征得到更好的闡釋，將具有非常廣闊的應用前景。

4 總結與展望

綜上所述，BMSCs移植可以延緩IDD，但其局限性限制了干細胞組織工程療法的普及。外泌體由于其易保存、無免疫原性等優勢而受到研究者的廣泛關注，但存在提取率低、量少等問題，隨著研究的不斷深入，推測在不久的將來注射攜帶外源性基因或藥物的BMSCs-exo以減緩人椎間盤的退變，可能成為一種新型有效的治療策略。