miR-144在心血管系統疾病中的研究進展

馬明仁，王菲，胡威，蔡曉慶，張鵬，原斌，馬凌

解放軍聯勤保障部隊第940醫院心血管內科，蘭州 730050

MicroRNA(miRNA)是動、植物中普遍存在的控制重要生物學進程的調節因子，也是研究最為廣泛的一類非編碼調節RNA[1-3]，包括外顯子miRNA及內含子miRNA，長度18～25個核苷酸。miRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成前體miRNA(pri-miRNA)，然后經Drosha/pasha切割形成70個核苷酸左右的primiRNA，通過exportin-5等分子作用轉運出核，在細胞質中由Dicer等加工為成熟miRNA，最后成熟miRNA分子與Argonaute蛋白等形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，并作用于特異靶mRNA的3'UTR，從而抑制翻譯過程，通過去腺苷酸化和脫帽引起靶mRNA降解[4-5]。隨著核酸高通量測序技術和生物信息學的逐步發展，利用基因芯片結合mRNA質/核比篩選及生物預測軟件，眾多與疾病相關的miRNAs及其靶基因相繼被發掘。在心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)中，許多研究已經將miRNA作為病理生理過程及疾病預后的潛在生物標志物[6]。miR-144作為一種在進化上高度保守的miRNA，在人類定位于17號染色體上，以miR-144/miR-451基因簇形式存在，兩個基因相隔93bp[7]。研究發現，miR-144在心肌細胞中高表達，其高表達可促進心肌氧化應激，從而誘發心肌損傷相關疾病的發生，并且已經證實其靶基因腫瘤抑制因子(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)涉及心肌細胞死亡信號通路，國內外多個臨床試驗也證實miR-144在心血管系統生理和正常發育以及CVD發生和發展中起關鍵作用[8]。本文就miR-144在CVD發生發展中的最新研究進展進行綜述。

1 miR-144與冠心病

冠心病(coronary heart disease，CHD)是最常見的CVD，主要因為長期慢性炎癥損傷動脈管壁，造成膽固醇沉積及血管重構而引起冠脈狹窄，主要病理過程為脂質代謝平衡的破壞及炎癥反應的激活。前期研究發現，miRNA與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)及CHD的發生發展密切相關[9]， 且AS是導致CHD的主要原因。Cao等[10]研究發現，CHD患者血清中miR-144的表達量明顯增高，可能在AS及CHD的病理過程中發揮重要作用，且miR-144水平與CHD嚴重程度相關，提示其可作為CHD的潛在生物標記物。脂代謝異常為CHD最主要的獨立危險因素之一，已經證實miR-144可通過靶向ATP結合蛋白1(ATP binding cassette protein 1，ABCA1)來調節膽固醇代謝[11]，而miR-144的模擬物(mimics)可通過抑制ABCA1的表達降低高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，加速AS進程。miR-144-3p mimics可在細胞水平上誘導不同類型膽固醇明顯上調，在復雜的體內平衡網絡中對膽固醇代謝起關鍵作用，器官或組織中ABCA1的表達及活性降低會對脂蛋白亞類不同的AS保護功能產生負面影響[12-13]。也有研究證實，miR-144通過抑制ABCA1表達降低血清中HDL-C的水平，并能促進炎性因子的表達[14]。 miR-144的調節或許可為血脂異常及AS等血管疾病提供潛在的治療手段。miR-144在脂質代謝及炎癥因子產生中發揮重要作用。最近研究發現，CHD患者的血漿miR-144水平明顯升高，且與CHD嚴重程度呈正相關，檢測血漿miR-144水平可能有助于預測CHD及其嚴重程度[15]。

早期研究發現心臟中的關鍵轉錄因子GATA-4對miR-144/miR-451啟動子有激活作用，miR-144/miR-451過表達增加了心肌細胞存活率，敲除則顯示了相反的作用[16]。miR-144/miR-451靶向CUG三聯體重復結合蛋白2(CUG triplet repeat,RNA binding protein 2，CUGBP2)，后者是一種廣泛表達的RNA結合蛋白，可與環氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2) 的3'端相結合，在miR-144/miR-451過表達心肌細胞中，CUGBP2蛋白水平大大降低且COX-2活性明顯增加，miR-144/miR-451基因簇至少部分靶向調節CUGBP2-COX-2途徑，對模擬心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion injury，I/R)誘導的心肌細胞凋亡具有保護作用[16]。Lusha等[17]證實，在大鼠I/R 模型中miR-144表達下調，miR-144通過靶向調節FOXO1減輕I/R損傷，過表達miR-144能夠明顯減輕心肌缺血損傷及細胞凋亡，在H9C2細胞實驗中也驗證了相似現象。在低氧條件下，骨髓間充質干細胞衍生的外泌體所含miR-144通過靶向調節PTEN/Akt途徑來抑制心肌細胞凋亡[18]。研究發現，敲除miR-144能明顯抑制細胞外基質重塑，增加心肌梗死區域面積，阻礙心臟重塑及功能恢復[19]。細胞遷移實驗及體外成腔實驗結果表明，miR-144可抑制細胞遷移及成管[20]。

越來越多的研究證據表明，miR-144與脂質代謝、炎性反應及心肌細胞凋亡相關，而脂類代謝異常又是CHD發生的重要因素。因此，miR-144與CHD之間的相關性可能為CHD診療提供更多可行方案。

2 miR-144與心律失常

心律失常的發生往往伴隨多種離子通道及傳導結構的改變，而miRNA在其中扮演的角色也逐漸被揭示。心房顫動(atrial fibrillation，AF)心臟電生理紊亂而導致的心臟異常搏動，是臨床發病率最高的心律失常之一，其發病率隨年齡增長而增高，可誘發心力衰竭、卒中及外周血管栓塞等致死性CVD。其發病機制有心房的電重構及結構重構，心肌代謝、神經體液及分子表達異常，心臟離子通道功能失調等[21-22]，病理基礎主要是心房纖維化及心房擴張[23]。研究表明，miRNA與AF的發生及維持密切相關，循環miR-144在致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC)伴室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)患者中表達豐度升高，提示miR-144可能對ARVC診斷有用，但ARVC中循環miRNA與組織miRNA之間的相關性仍有待進一步研究[24]。miR-144-3p在人肺成纖維化細胞中可促進纖維化相關基因如Ⅰ型膠原α1鏈基因(COL1A2)、膠原蛋白3α1(COL3A1)、平滑肌肌動蛋白α2(ACTA2)及纖維連接蛋白(fibronectin)的表達，在纖維化調控過程中發揮了重要作用[25]。Smad蛋白是轉化生長因子-β(TGF-β)受體信號傳導的中介物質，是調控纖維化的重要信號通路。進一步研究發現，miR-144-3p通過激活Smad3信號通路發揮促心肌纖維化作用，circRNA_100395通過結合miR-144-3p發揮抑制心肌纖維化的作用，且Smad3信號通路介導miR-144-3p參與了circRNA_100395的作用，從而抑制人心房肌成纖維細胞(HAFs)纖維化相關基因表達的調控[25]。

采用miRNA芯片篩選出永久性房顫(permanent atrial fibrillation，pAF)與健康心房組織中表達有顯著差異的miRNAs，結果顯示miR-144上調最為明顯(10.44倍)，提示miR-144參與了pAF的發生及維持[26]。 有研究應用熒光定量PCR法檢測高原低壓低氧條件下大鼠血漿中miR-144的表達水平，結果發現，隨著低壓低氧暴露時間的延長，血漿miR-144表達水平逐漸升高，引起心肌損傷，繼而引發了一系列CVD的發生，包括心律失常、心肌梗死、心力衰竭等[27]。

AF及pAF的病理基礎均與心房纖維化密切相關，miR-144在心房纖維化進程中發揮了重要調控作用[28]。因此，隨著對心律失常與miR-144相關性研究的不斷深入，miR-144有望為心律失常的診療提供潛在靶點。

3 miR-144與先天性心臟病

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是先天性畸形中最常見的類型[29]，約占各種先天性畸形的28%。CHD是指在胚胎發育時期由于心臟及大血管形成障礙或發育異常而引起的解剖結構異常，或出生后應自動關閉的通道未能閉合的情形。CHD種類復雜且繁多，一般分為3種：發紺型心臟病、左側堵塞性缺陷及隔膜缺損。臨床常見的類型主要包括房間隔缺損(atrial septal defect，ASD)、室間隔缺損(ventricular septum defect，VSD)及法洛四聯癥(tetralogy of Fallot，TOF)等。CHD發病原因較多，遺傳因素僅占8%，而絕大多數則為環境因素所致。miRNA表達譜分析可檢測到多種miRNAs在CHD中的表達發生變化，它們在心力衰竭、心律失常、心肌重構、心肌細胞生長分化及心臟發育等過程中發揮重要調控作用[30-32]。

目前認為TBX1基因是CHD的核心基因之一，但關于TBX1基因表達異常的研究較少。Cao等[33]研究發現，miR-144通過JAK2/STAT1途徑靶向TBX1調節心肌細胞的增殖及凋亡。VSD是最常見的CHD，Li等[34]發現，與對照組兒童相比，VSD患兒心臟組織中miRNAs表達有顯著變化。 TOF是存活嬰兒中最常見的青紫型CHD，Zhang等[35]發現，與非配對捐贈心臟對照相比，TOF患兒心臟標本中有47個表達顯著變化的miRNAs，包括miR-144，其中16個表達下調，31個表達上調。已證實雙鏈復合蛋白8(paired box gene 8，Pax-8)參與了胚胎的心臟發育過程，與心肌細胞凋亡相關。在Pax-8基因敲除小鼠中，心臟出現VSD，心臟左心室壁及室間隔部位的心肌細胞存在明顯的凋亡現象；通過篩選Pax-8基因敲除小鼠的miRNA表達譜，結合RT-PCR驗證，發現miR-144明顯上調，提示miR-144為促進心肌細胞凋亡的基因，并推測其參與了Pax-8基因敲除小鼠心肌細胞凋亡的發生[36]。有研究發現，轉基因斑馬魚高表達miR-144可明顯影響胚胎內皮系統發育，胚胎節間血管(intersegmental blood vessel，ISV)生成嚴重受阻，miR-144靶向meis1基因表達在斑馬魚胚胎血管發育中有著重要的生物學功能[37]。 有學者將miR-144 mimics轉染至大鼠胚胎心肌細胞H9C2使其高表達miR-144，結果發現，轉染后caspase-3活性明顯升高，而細胞增殖明顯降低，細胞凋亡明顯增加，推測miR-144可能通過增加caspase-3表達而促進心肌細胞凋亡，并抑制心肌細胞增殖[38]。miRNA可作為無創生物標志物應用于預測小兒CHD患者術后心肌損傷的程度及預后[39]。 孕婦孕前糖尿病(maternal pregestational diabetes mellitus，PGDM)會誘發胎兒CHD，PGDM誘導CHD的分子機制尚不清楚，生物信息學分析表明，PGDM明顯改變了包括miR-144在內的149個miRNAs的表達，且發現了2111個與心臟發育途徑相關的miRNAs靶基因，為進一步研究PGDM誘導CHD的分子機制提供了理論依據。

4 總結與展望

CVD是導致人類死亡的重要因素，約1/4的死亡與心臟疾病相關[40]。而miRNA作為一類新型基因調控小分子，在CVD各種生物學過程中具有舉足輕重的作用。miRNA是目前研究最為廣泛的一類內源性非編碼RNA，人類20%～30%的基因轉錄受miRNA的調控。miRNA廣泛參與了各個系統不同疾病的發生、發展，在CVD中也發揮了重要的調控作用。對miRNA的研究最早始于1993年Lee等[41]在秀麗隱形線蟲中發現的miRNA lin-4，之后Reinhart等[42]發現了miRNA let-7及其調控基因，至此才引起人們對miRNA的高度關注。成熟miRNA序列很短(18～25個核苷酸)，且具有家族序列高度相似及低表達的特點。miRNA在病理狀態下的差異表達、穩定性及組織特異性使其具有作為生物標志物的優勢。隨著生命科學研究的不斷進步和發展，越來越多與疾病相關的功能性miRNA被發現和驗證。

生物信息學預測分析miR-144序列高度保守，在參與調控信號通路過程中功能相對穩定，高度保守性決定了miR-144作為生物標志物的前提。miR-144在疾病中的調控作用研究主要集中在調控紅系分化及腫瘤等領域，在心血管系統的報道相對較少。通過查閱相關文獻發現，miR-144在CVD中的研究主要集中在膽固醇代謝、心肌細胞增殖和凋亡，以及心肌細胞纖維化等方面。miR-144在心肌細胞中高表達，可促進心肌氧化應激，從而誘發心肌損傷相關疾病。Pickard等[43]提出，最有前景且具有實驗證據的心肌保護因子是基質衍生因子1α(stromal derived factor 1α，SDF-1α)、一氧化氮及miR-144，對肢體實施遠程缺血后適應，則以上3種物質在血漿中濃度明顯升高，而阻斷這些因子可去除遠程缺血后適應的心肌保護作用。遠程缺血后適應及靜脈內注射miR-144可明顯減少急性I/R模型小鼠的心肌梗死面積[44]。miR-144通過靶向Rac-1改善線粒體的生物發生并減少細胞凋亡，從而保護心臟免受高血糖造成的損傷[45]。在小型豬心肌梗死模型中鑒定出84個與對照組表達有差異的miRNAs，且miR-144-3p在梗死區域的表達更高，miR-144-3p通過靶向PTEN增強心肌梗死后的心臟纖維化[46]。miR-144可能通過波形蛋白信號傳導而調控AS的發展[37]。上述研究充分說明miR-144與CVD的發生發展密切相關，miR-144通過調節脂類代謝、抑制心肌細胞凋亡、促進心肌纖維化等參與了CVD的發生發展進程。

人的機體是一個復雜的體系，目前大多數研究只停留在單純分析miR-144及其靶基因在某種疾病中的作用，且其研究方法均為通過生物信息學軟件來預測miR-144靶基因，然后在細胞水平進行驗證，但在體內的驗證實驗相對較少，尚不能全面系統地反映miR-144在體內的整體調控作用。大量實驗證據表明，疾病的發生發展受到眾多miRNAs調控，miR-144只是miRNA調控網絡中的一個節點，在不同疾病中其表達和分布有高低之分，發揮的作用也有主次之別。已證實miR-144在心血管系統生理過程和正常發育以及CVD發生發展中起重要作用，因此，miR-144具備診斷及預測CVD的潛力。但miR-144作為CVD生物標記物也存在一些不足和弊端，如miR-144在CVD中發揮主要作用的同時，其他miRNA與miR-144的協調作用也會對CVD產生間接影響。miR-144水平的變化可能與特定的心臟病理生理機制存在交叉作用有關。miR-144作為CVD診斷和預后分析的生物標記物的有效性和安全性有待進一步考證。隨著生物預測軟件匹配度及準確性的提高以及高通量測序技術的不斷發展，通過系統的實驗逐步完善miR-144在CVD中作用的研究，全面了解miR-144在CVD中發揮的調控機制，將miR-144作為診療CVD的新靶點指日可待。