質粒DNA提取方法的研究進展

摘?要：在生物實驗中，質粒DNA常常作為基因載體運載工具使用，應用非常廣泛，質粒DNA的提取通常在實驗室內進行，保證其提取的效率和質量對生物實驗研究具有重要意義，基于此本文對質粒DNA的提出方法進行了探討。

關鍵詞：質粒DNA;提取方法;研究

質粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，當前通常用其來特指細菌、真菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程領域，質粒常常被當做基因的載體使用。在分子生物學中，質粒DNA被當做基因運載工具具有非常廣泛的應用。在質粒DNA的應用過程中，其純度對于酶切、PCR擴增等實驗結果有著比較大的影響，因此需要保證質粒DNA提取的純度和效率。

在細菌中提取質粒DNA通常按照以下步驟進行：第一步，培養細菌，使質粒擴增;第一步，進行細菌的收集和裂解;第三步，質粒DNA的分離和純化。在質粒DNA的提取過程中，其提取效果和其大小呈現出正比例關系，越小越容易進行提取，這主要是由于，如果質粒DNA比較大的話，其特性機會和染色體DNA比較接近，這樣想要將二者分離開來難度就會變大。在進行質粒DNA的分離時，適宜的條件是非常重要的，主要包括pH值、SDS濃度、時間和溶菌溫度等，在適宜的條件下質粒DNA和染色體DNA才能夠更好的分離開來。細菌濃度對于質粒DNA的提取也是非常重要的，如果細菌的濃度比較高，那么在溶菌時，溶菌液很難和細菌液充分混合，導致溶菌不徹底的問題，這樣會造成質粒的回收率比較低;而如果細菌溶度比較低，溶菌液和菌液均分混合，會造成溶液中含有較多的蛋白質、染色體以及菌體碎片，在這樣的情況下，沉淀時質粒回合這些物質共沉，進而導致質粒的回收率也會比較低。在生物學的相關研究之中，細菌質粒DNA的提取是比較常規的技術和操作，主要的方法有堿裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等，下面對這些方法的最新研究進行介紹。

1 堿裂解法

堿裂解法是當前應用比較廣泛的質粒DNA提取方法，這種方法的優點在于提取的質粒DNA純度高，操作便捷，缺點是需要較長的提純時間。研究人員在縮短這一方法的提純時間方面做了大量的研究，但是沒有得到理想的效果，當前這一方法提取DNA的時間都在1.5h以上。堿裂解法提取質粒DNA的基本原理：首選，在菌液中加入溶液Ⅰ，使細菌細胞懸浮，同時其中的EDTA會和Ca2+以及Mg2+螯合，起到抑制DNase活性的作用;然后，加入溶液Ⅱ，將細胞裂解，在這個過程中蛋白質和少量質粒將會變質;再次，加入溶液Ⅲ，使多數蛋白質以及染色體DNA被沉淀，并使得質粒DNA復性。其中，該方法中起到裂解細菌作用的主要是溶液Ⅱ中的NaOH，正因如此該方法被稱為堿裂解法，如果將其換為SDS，也能夠提取出少量的質粒DNA，這是由于SDS也是堿性的，可以一定程度上破壞細菌的細胞膜。在這一方法中需要注意，NaOH溶液要現用現配，這個主要是由于其能夠和空氣中的CO2反應，從而使溶液的堿性降低，這樣會影響提純的效率，另外在加入溶液Ⅱ之后，操作時間不能夠過長，這是因為染色體DNA在堿性條件下片段會慢慢斷裂。另外需要注意的是，在操作過程中，混勻是一定要輕柔，從而在保證細菌沉淀可以充分的擴散在試劑中的前提下，避免已變性質粒DNA和染色體基因組DNA被機械剪切。此外，在溶液Ⅲ加入之后，其中的SDS會和蛋白質結合，會產生大量的沉淀，SDS還會和醋酸鉀結合，生成PDS，這一物質的溶解度遠低于SDS，從而可以將大部分蛋白質和染色體DNA共沉淀。

2 煮沸法

煮沸法的優點在于，能夠在高菌體濃度的條件下進行質粒DNA的提取，應用這種方法可以是菌體裂解液濃度達到OD600等于100，能夠達到堿裂解法的2.5倍。在進行質粒的提取時，提高提取效率十分重要，因此需要更提高處理樣品的能力。在提取時，同一時間內，最好處理盡可能多的菌體，而菌體濃度比較高的情況下，可能會導致裂解不充分的問題，并增加后續操作的難度，影響到質粒DNA的提取效率和質量。通過煮沸法則可以有效的解決這一問題，這是特點也是煮沸法的主要優勢所在。在傳統的煮沸法中，裂解通常在100℃的熱水浴中進行，如果溫度過高的話，不僅難以控制好溫度，同時會浪費比較多的能源。研究人員對煮沸法進行了優化，在連續熱裂解方法中，增加了37℃溫浴這一步驟，在熱裂解之前先37℃溫浴20min，在這樣的條件下，裂解緩沖液中的溶菌酶以及Triton-X100可以充分的和菌體進行通，在這樣的條件下，可以降低熱裂解的溫度，只需要70℃就可以滿足要求，溫度更加容易控制，而且能夠節約能源。

3 SDS裂解法

SDS裂解法中，需要應用到3種裂解溶液，每種溶液的作用各不相同。其中，溶液Ⅰ的作用是對反應的pH值進行控制，通過控制pH值來使細胞壁溶解，從而增加細胞比重，從而使細胞懸浮起來;溶液Ⅱ的主要作用是使長鏈基因組DNA變性，并使其和蛋白質、細胞碎片等相互纏繞，最終形成大型的復合物，SDS會將這一復合物包覆起來，在這一過程中部分超螺旋的閉環環狀質粒DNA也會出現可逆變性;在加入溶液Ⅲ之后，該溶液能夠使整個系統恢復中性條件，從而使出現可逆變性的質粒DNA復性，同時接入溶液Ⅲ后，SDS還會和其中的醋酸鉀出現反應，生成溶解度較低的PDS，從而使SDS包覆的大型復合物沉淀，離心之后就可以分離出質粒DNA。

4 結論

堿裂解法、煮沸法和SDS裂解法是比較常規的質粒DNA提取方法，其中，堿裂解法的特點是操作簡便，提出的質粒DNA純度較高，具有較高的提取效率，因此應用的比較廣泛，應用此方法提取出的質粒DNA被廣泛應用轉化細菌、酶切分析以及DNA重組實驗中;煮沸法則由于過程比較劇烈，容易導致質粒DNA結構的破壞，其優點是可以處理高濃度的菌液;SDS裂解法具有良好的提出純度。

參考文獻：

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作者簡介：王佩菡（1997-），女，回族，山東濟寧人，本科三年級，研究方向：健康科學。