mRNA m6A甲基化修飾在心血管疾病中的研究進展

徐峰綜述 張艷達，梁春，吳宗貴審校

心血管疾病是目前威脅人類健康的主要疾病之一，具有高發病率和高病死率[1]，有效地防控心血管疾病依賴于對相關發病機制的闡明，以及在此基礎上的早期診斷和干預。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修飾可調控信使RNA (messenger RNA，mRNA)的合成、翻譯與降解，改變mRNA折疊和結構，影響mRNA的成熟[2]。m6A修飾是真核生物mRNA中最普遍也是最豐富的內部修飾，主要發生在mRNA分子的3'-非翻譯區和終止密碼子附近[3]。m6A的修飾由甲基轉移酶復合物完成，包括甲基轉移酶樣蛋白3 (methyltransferase-like 3, METTL3)、METTL14等[4]，METTL3在其中起關鍵作用。m6A去甲基酶的發現提示這一修飾是可逆的，可通過脂肪質量和肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO)、alkB同源物5(alkB homologue 5, ALKBH5)來實現m6A去甲基化，兩者都具有不同的亞細胞和組織分布[5]。m6A還受閱讀蛋白的調控，如YT521-B同源物域家族蛋白2(YT521-B homology domain family of proteins 2，YTHDF2)，這是一種m6A RNA結合蛋白，可以調控mRNA的穩定性和降解，影響mRNA翻譯效率。mRNA m6A甲基化作為連續、動態、可逆的修飾異常與多種心血管疾病的發生發展相關[6]。

1 mRNA m6A甲基化對心血管疾病危險因素的影響

1.1 mRNA m6A甲基化與肥胖 多種心血管疾病的發病率和病死率升高與肥胖密切相關[7]。與肥胖密切相關的FTO基因是能量穩態的積極調節因子，可通過脂質代謝調節人體RNA序列中m6A的水平[8]。在獨立的全基因組關聯研究中，FTO基因被證明是導致歐洲和印度尼西亞受試者早發和嚴重肥胖的高風險因素[9]。

脂肪細胞中FTO缺失以m6A依賴性的方式導致體質量增加，FTO通過調節脂肪細胞中脂肪酸的動員控制體質量[10]，其缺失可導致細胞外脂肪分解增多，使更多的脂肪酸被脂肪組織吸收；還可導致細胞內脂肪分解減少，促進脂肪組織中脂肪酸的儲存。FTO缺失可導致血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like 4, ANGPTL4)相關轉錄產物中m6A修飾增加，ANGPTL4蛋白表達水平降低，可能導致脂肪組織中脂肪酸沉積增多[11]。此外，序列相似家族134成員B (family with sequence similarity 134 member B，FAM134B)中m6A的缺失可導致豬脂肪細胞通過m6A-YTHDF2依賴途徑引發脂肪生成[12]。目前，FTO在脂肪酸代謝中的作用機制尚未完全闡明。m6A修飾是否也參與其他營養物質的代謝尚需進一步研究。

1.2 mRNA m6A甲基化與2型糖尿病 糖尿病是促進冠心病發病的重要危險因素。由糖尿病引起的血糖異常，包括低血糖和高血糖，已被認為是導致糖尿病患者心血管疾病和全因死亡的主要危險因素。除了控制血糖外，增加胰島素敏感性已成為治療糖尿病的一種新策略，特別是在胰島素抵抗的情況下[13]。此外，在2型糖尿病患者中，高血糖可能通過增強FTO或其他甲基轉移酶的表達而導致m6A水平下調，提示m6A在調節糖脂代謝紊亂中具有重要的表觀遺傳學作用[14]。糖尿病引起的FTO表達升高除了與葡萄糖氧化異常有關外，還與血糖受損引起的多種并發癥密切相關。

既往研究發現，m6A的改變與2型糖尿病密切相關，2型糖尿病患者和大鼠的mRNA中總體m6A的水平明顯低于對照組。2型糖尿病患者FTO mRNA表達水平明顯高于對照組。FTO mRNA表達水平升高可導致2型糖尿病中m6A修飾減少，增加2型糖尿病并發癥發生的風險[15]。m6A水平與METTL3、METTL14和FTO的mRNA表達水平呈負相關。高糖可上調FTO蛋白，但對METTL3和METTL14無顯著影響。較低的m6A水平可能是甲基轉移酶上調的原因。因此，m6A豐度可作為新的檢測2型糖尿病潛在的生物標志物。然而，m6A修飾是否在糖尿病中具有基因位點的特異性仍有待進一步闡明。

1.3 mRNA m6A甲基化與心臟內穩態及心肌肥厚調控 通常認為人體心肌細胞在進入成年后僅有少量更新，這些細胞在應激刺激下，如壓力超負荷或心肌梗死，會發生肥厚性生長。這種代償最初是一種適應性過程，以產生足夠的力量來應對心臟房室壁張力的增加或工作負荷的增加，但最終可能導致心臟衰竭[16]。心肌肥厚是由心肌細胞中產生特定蛋白的基因轉錄和翻譯增加所介導的[17]。以往研究集中在能夠導致促肥厚轉錄因子激活的信號通路上，這些因子可選擇性地增強基因在心臟的表達[18]。在心肌肥厚過程中，盡管基因轉錄調控方面的研究已經取得了重大進展，但現在已發現轉錄后調控也是控制心肌肥厚的關鍵機制[19]。研究發現，mRNA m6A甲基化在心肌肥厚和心力衰竭中會發生顯著改變[20]。

為了確定mRNA m6A甲基化在心臟中的作用，研究人員分離了原代心肌細胞，通過控制體外和體內的METTL3水平來調節心肌細胞中的m6A水平。該研究建立了心臟功能受限的小鼠模型，以評估METTL3-m6A通路在心臟內穩態中的作用，發現在致心肌肥厚刺激因素作用下m6A甲基化水平顯著升高，提示m6A甲基化可能在心肌細胞肥厚的發生發展中發揮關鍵作用。減少METTL3的表達可抑制心肌細胞在應激下發生肥大的能力，而增加METTL3的表達足以在體外和體內促進心肌細胞肥大。該研究發現，METTL3介導的mRNA m6A甲基化增加可導致心肌代償性肥厚，而m6A降低可導致異常的心肌細胞重構和功能障礙[21]。近來有學者進一步完善了相關研究，把小鼠動物模型分為3組：METTL3過表達的主動脈縮窄術后組、單純主動脈縮窄術后組、假手術組。2周后發現，METTL3過表達小鼠心臟的病理增生性細胞生長有所減弱，與假手術組相比，過表達METTL3組的心肌細胞在主動脈縮窄術后2周明顯肥大，但小于單純主動脈縮窄術的小鼠[22]。這項研究結果與前者的研究結果相反，可能與實驗動物模型的不同有關。2項研究都證實了METTL3能夠控制心肌細胞中負責調節心臟重構和功能的基因表達程序，提示METTL3在心臟中發揮關鍵作用，以該通路為靶點對病理性心臟重構具有潛在的治療價值。

1.4 mRNA m6A甲基化與缺血性心臟病 隨著生活和醫療水平的提高，一些發達國家的心血管病死率顯著下降，但心血管疾病仍然是全球范圍內死亡的主要原因[23]。表觀遺傳學在調節心血管修復功能中發揮主導作用[24]。目前的治療方法在缺血性心臟病治療和減輕心肌缺血后不良重構方面作用有限。因此，必須探究心肌修復和再生的新治療策略。由心肌冠狀動脈狹窄或閉塞引起的缺血性心臟病，包括心肌梗死和心力衰竭，直接影響心肌細胞的氧合能力[25]。在低氧/復氧處理的心肌細胞和缺血/再灌注處理的小鼠心臟組織中，METTL3對m6A的修飾增加，是m6A異常調控的主要因素。這是由于其促進了特定mRNA的翻譯而引起的。沉默METTL3可增加心肌細胞的自噬通量，抑制缺氧/復氧細胞凋亡，提示METTL3是自噬的負調控因子。進一步研究表明，METTL3缺乏導致的自噬通量增加依賴于轉錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)。

FTO作為一種m6A去甲基酶，在缺血缺氧等應激狀態下，心臟的穩態、重構和再生過程中發揮著重要功能。FTO在哺乳動物衰竭心臟和缺氧心肌細胞中表達減少，可增加RNA中m6A甲基化的程度，降低心肌細胞的收縮功能。改善FTO在小鼠衰竭心臟中的表達，可減輕缺血引起的m6A升高和心肌收縮功能下降。這是通過FTO的去甲基化活性來實現的，FTO選擇性地去甲基化心臟收縮相關轉錄產物，防止其降解，改善缺血時的心肌收縮蛋白表達，從而改善心肌收縮力。該研究還證明FTO在心肌梗死小鼠模型中的過表達，可以減少纖維化并促進血管生成。由此可得出依賴FTO的心臟m6A甲基化在心力衰竭時心臟收縮中的重要功能，提示使用FTO或FTO類似物進行靶向治療的可行性[26]。

2 mRNA m6A甲基化調節心血管疾病的可能機制

2.1 mRNA m6A甲基化與脂質代謝 晝夜節律相關蛋白的轉錄調控對維持脂質代謝穩態至關重要，如果晝夜節律調節紊亂導致脂質代謝穩態被破壞，則可引起代謝性疾病。近來有研究證實，小鼠肝臟mRNA m6A甲基化波動依賴于一個功能性生物鐘的調節，小鼠肝臟晝夜節律基因芳香烴受體核轉位蛋白樣1 (brain and muscle arnt-like 1, Bmal1)缺失可導致活性氧(reactive oxygen species, ROS)積聚，進而通過提高METTL3來增加mRNA m6A甲基化，尤其是增加過氧化物酶體增殖劑激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARα)的mRNA甲基化，同時活性氧的積聚會顯著誘導 YTHDF2的表達，兩者共同影響PPARα的轉錄和翻譯，影響下游的脂質代謝，最終導致脂質積聚增加。這些發現進一步揭示了晝夜節律基因缺失、mRNA m6A修飾和代謝狀態之間的關系，mRNA m6A甲基化，特別是PPARα甲基化在下游基因和脂質代謝的生物鐘調節機制中起重要作用[27]。

2.2 mRNA m6A甲基化對巨噬細胞清除受體1表達的影響 動脈粥樣硬化是一種慢性炎性疾病，其特征是動脈壁上脂質、細胞及纖維成分的逐漸積累[28]。巨噬細胞在動脈粥樣硬化的各個階段起著關鍵作用，受損的動脈壁促使單核細胞在內膜中分化為巨噬細胞，巨噬細胞吸收并代謝過多的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)，導致酯化膽固醇在細胞質中沉積，產生泡沫細胞。巨噬細胞清除受體1(macrophage scavenger receptor A, MSR1)和白細胞分化抗原36(cluster of differentiation 36, CD36)在巨噬細胞表面大量表達，是結合、攝取和清除oxLDL的主要受體[29]。

近來有學者發現，oxLDL可誘導死盒蛋白5(dead box protein 5，DDX5)表達，進而促進巨噬細胞MSR1的表達，接受oxLDL處理的巨噬細胞DDX5上調，抑制了METTL3作用于MSR1 mRNA的甲基轉移酶活性，降低MSR1 mRNA中m6A的甲基化程度，從而維持MSR1 mRNA的穩定性，增加MSR1表達并促進脂質攝取。該研究提示，DDX5通過抑制METTL3與MSR1 mRNA結合并抑制METTL3甲基轉移酶活性起作用[30]。但DDX5抑制METTL3甲基轉移酶活性的具體機制尚不明確，且DDX5是否影響巨噬細胞分泌各種促炎因子和趨化因子也有待進一步研究。

2.3 mRNA m6A甲基化與炎性反應 各種慢性炎癥性疾病可刺激心血管疾病的發生和發展。這些異常的生化特征是通過氧化應激途徑、細胞因子和腎素—血管緊張素系統的相互作用而產生[31]。炎性反應是動脈粥樣硬化各階段的主要和基本危險因素之一[32]。由于炎性反應與動脈粥樣硬化關聯的具體機制尚未完全闡明，m6A成為研究心血管疾病臨床治療策略的新焦點。最近的研究表明，METTL3敲除可以抑制一些炎性細胞因子的增加和各種與炎性反應相關的基因表達，主要是通過改變相關信號通路的磷酸化水平，如在脂多糖誘導的人牙髓炎中，可調節骨髓分化因子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)的剪切變體。這提示m6A在炎性反應過程中可能參與心血管疾病的病理生理過程[33]。

METTL3可驅動M1巨噬細胞極化，發揮促炎作用。METTL3直接甲基化信號傳導與轉錄活化因子1(signal transducers and activators of transcription 1，STAT1)的mRNA，提高其mRNA的穩定性，從而上調STAT1的表達，促進M1巨噬細胞極化。STAT1是啟動促炎巨噬細胞的關鍵轉錄因子。鑒于M1巨噬細胞在各種炎性疾病發病機制中的關鍵作用，METTL3-STAT1介導的巨噬細胞極化可能導致動脈粥樣硬化、肥胖相關的脂肪重構、腹主動脈瘤等疾病的發生和發展，因此可以作為潛在的抗炎目標[34]。

2.4 mRNA m6A甲基化與下游基因調控 不同病理刺激下心肌基因表達水平的改變在一些動物心力衰竭模型發生和進展中發揮了重要作用。最近的一項研究強調了可逆mRNA序列中特定修飾的重要性，可逆mRNA序列在表觀遺傳水平上控制基因表達。由于m6A甲基化水平的升高與心肌病相關，因此研究m6A內部修飾對相關基因表達的影響具有重要意義。m6A的動態甲基化通過調節應激心肌細胞mRNA翻譯的效率影響轉錄的穩定性。例如，除心肌細胞的大小和心臟功能外，與肥厚相關的下游標志物利鈉肽前體的表達也會受到METTL3酶活性的影響。這表明m6A修飾在體內外調節心臟基因表達和細胞生長反應中發揮著綜合作用[22]。

總之，m6A相關酶或任何其他類型的小分子在特定位點的調控，可能是治療一些由m6A失調引起的心臟病的新途徑。然而，m6A與其他心血管相關疾病(如高血壓和先天性心臟病)之間的聯系仍需進一步的探索。

3 小結和展望

mRNA m6A甲基化異常可作為潛在的心血管疾病標志物，其與泡沫細胞的形成、血管內皮炎性反應、肥胖和2型糖尿病、心臟內穩態、心肌肥厚、心臟重構與修復高度相關，對認識心血管疾病發病機制、診斷和治療提供新的線索。開發多種m6A調節劑治療m6A修飾相關心血管疾病具有廣闊的前景，也可為研究心血管疾病的分子機制及治療藥物的開發提供理論依據。