血清微小RNA-106b-5p、RNA-30a-5p水平與結直腸癌患者預后的關系及其診斷價值

張煌，魯恒珍，周帥躍，鄭華理，朱愛萍

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，發病率和病死率僅次于胃癌，嚴重威脅人民身體健康及生命安全。近年來，受飲食結構、生活方式改變等諸多因素影響，我國結直腸癌發病率呈逐年上升趨勢[1]。結直腸癌早期發病癥狀隱匿，不易被察覺，大多數患者就診時已處于中晚期并伴有遠處轉移，錯過了最佳手術治療時機，導致患者5年生存率低、預后差[2]。尋找有效的輔助預測結直腸癌預后并具有診斷價值的血清標志物，對提高患者生存率、改善患者預后具有積極意義。微小RNA(microRNA，miR)是一類高度保守的非編碼小RNA，參與調節多種生理過程。因其在血液、尿液及腦脊液等體液中的穩定性較好，miR已被證實具有成為多種疾病血清生物標志物的潛能，也是目前腫瘤研究領域的熱點[3]。miR-106b-5p具有調控腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移等功能[4]；miR-30a-5p與多種惡性腫瘤發生發展密切相關[5]，可能通過多種途徑發揮抑癌功能，但miR-106b-5p、miR-30a-5p在結直腸癌中的意義尚不十分明確。現分析結直腸癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p檢測的應用價值，為臨床提供依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月—2014年12月安徽省安慶市第一人民醫院腫瘤科手術治療的結直腸癌患者(結直腸癌組)、門診確診的結直腸腺瘤患者(結直腸腺瘤組)和同期健康體檢者(健康對照組)作為研究對象，各90例。結直腸癌組男53例，女37例，年齡42～73(45.13±7.58)歲，≤60歲56例，>60歲34例；腫瘤直徑：<5 cm 46例，≥5 cm 44例；腫瘤分化程度：中高分化 60例，低分化30例；腫瘤浸潤深度：T1+T2 57例，T3+T4 33例；有淋巴結轉移49例，無淋巴結轉移41例；有遠處轉移患者57例，無遠處轉移患者33例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期65例，Ⅲ+Ⅳ期25例。結直腸腺瘤組男49例，女41例，年齡41～74(44.98±6.95)歲，≤60歲54例，>60歲36例；患者均無惡性腫瘤、家族性息肉病及潰瘍性結腸炎等結直腸疾病。健康對照組男54例，女36例，年齡43～75(45.64±6.73)歲，≤60歲52例，>60歲38例；納入健康體檢者均無惡性腫瘤、肝腎疾病及其他嚴重疾病史。3組研究對象的性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會核準，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①完整的病歷資料及術后隨訪資料；②術后經病理組織學確診；③卡氏(Karnofsky)評分≥70分。(2)排除標準：①結直腸癌復發病例；②合并家族性腺瘤性息肉病；③合并胃癌等其他惡性腫瘤；④合并免疫系統、血液系統等疾病；⑤合并糖尿病等慢性疾病。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 樣本采集： 結直腸癌組于術前1天、結直腸腺瘤組于確診后次日、健康對照組于體檢時，抽取所有研究對象的空腹外周靜脈血5 ml，在4℃時離心收集上層血清，置于-80℃冰箱保存備用。

1.3.2 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達檢測：血清樣本中加入cel-miR-39(終濃度500 fmol/ml，購自美國ABI公司)，RNA提取試劑盒(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)提取血清總RNA，微量紫外分光光度計(Nanodrop 1000，美國賽默飛世爾科技公司)檢測RNA濃度及純度，TaqMan miR逆轉錄試劑盒(美國ABI公司)進行逆轉錄反應，miRNA特異性TaqMan miR試劑盒(美國ABI公司)，7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行TaqMan real-time PCR檢測；每個樣本設置3個復孔，采用2-△△Ct計算miRNA相對表達量。引物序列(由上海生工生物工程股份有限公司設計)如下，miR-106b-5p正向引物5’-TGCGGCAACACCAGTCGA TGG-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-30a-5p正向引物5’-CACTCTCATGTAAACATCCTCGAC-3’，miR-30a-5p反向引物5’-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3’；正向引物5’-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT，內參cel-miR-39反向引物5’-CCAGTGCGTGTCGTGGAGTC-3’。

2 結 果

2.1 3組血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達水平比較 血清miR-106b-5p相對表達量比較，結直腸癌組>結直腸腺瘤組>健康對照組(P均<0.01)；血清miR-30a-5p相對表達量比較，結直腸癌組<結直腸腺瘤組<健康對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 3組血清miR-106b-5p、miR-30a-5p相對表達水平比較

2.2 結直腸癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達水平在不同臨床病理特征中比較 結直腸癌患者血清miR-106b-5p水平在不同性別、年齡、腫瘤位置、分化程度及浸潤深度方面比較，差異無統計學意義

(P均>0.05)，而在不同腫瘤直徑、淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期方面比較，差異有統計學意義(P均<0.05)；結直腸癌患者血清miR-30a-5p水平在不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑及遠處轉移方面比較，差異無統計學意義(P均>0.05)，而在不同腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期方面比較，差異有統計學意義(P均<0.05)，見表2。

2.3 結直腸癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達水平在不同預后情況中比較 以血清miR-106b-5p中位數(4.64)、miR-30a-5p中位數(0.39)分別為界，將結直腸癌患者分為高表達亞組(45例)和 低表達亞組(45例)，Kaplan-Meier結果顯示，血清miR-106b-5p高表達亞組患者術后5年總生存率為22.22%(10/45)，中位生存時間為(35.24±2.98)個月，低表達亞組為64.44%(29/45)，中位生存時間為(44.47±3.19)個月，2亞組比較差異有統計學意義(χ2=11.449，P=0.001)，見圖1。血清miR-30a-5p高表達亞組患者術后5年總生存率為60.00%(27/45)，中位生存時間為(31.36±3.06)個月，低表達亞組為26.67%(12/45)，中位生存時間為(46.89±2.75)個月，2亞組比較差異有統計學意義(χ2=12.613，P=0.000)，見圖1。

2.4 結直腸癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達水平與預后的相關性 結直腸癌患者血清miR-106b-5p與患者預后呈負相關(r=-0.429，P=0.039), 血清miR-30a-5p表達水平與患者預后呈正相關(r=0.458，P=0.041)。

表2 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達水平在不同臨床病理特征中比較

2.5 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達水平診斷結直腸癌的價值 ROC分析結果顯示，miR-106b-5p、miR-30a-5p診斷結直腸癌的cut-off值分別為4.52、0.39，AUC為0.785、0.692、0.824，血清miR-106b-5p、miR-30a-5p聯合檢測對結直腸癌的診斷價值較大，AUC為0.824，見表3，圖2。

3 討 論

越來越多的研究發現，結直腸癌組織和細胞中存在異常表達的miR分子，如高表達的miR-19a-3p和低表達的miR-874[6-7]，miR可通過轉錄后調控機制影響結直腸癌細胞的增殖、浸潤、侵襲等活動，參與結直腸癌的癌變、病情進展，且與結直腸癌患者預后密切相關[8-9]。癌胚抗原、糖類抗原19-9(CA19-9)等均是臨床上篩查結直腸癌的常用血清標志物，但由于上述指標在多種癌癥中亦有類似的變化，因此對患者預后預測特異性不高[10-12]。近年來，隨著miR研究深入，發現其不僅存在于細胞和組織中，在體液中也能穩定表達，血清miR在腫瘤預后預測及輔助診斷等方面具有重要作用[13-15]。

有研究表明，miR-106b在胃癌中表達增加，且促進細胞侵襲[16]，發揮促癌功能，本研究也證實結直腸癌患者血清miR-106b-5p水平升高，且與腫瘤較大直徑、淋巴結轉移、遠處轉移及較晚臨床分期密切關聯，與以往研究證實的miR-106b-5p促進結直腸癌細胞增殖、侵襲的結論一致[17-19]，而其他相關研究團隊則認

為miR-106b-5p表達降低，促進了結直腸癌細胞侵襲[20]，以上研究結論相悖，筆者分析miR-106b呈現多種不同效應，可能與不同研究體系有關，后續需要從分子生物學層面深入探究miR-106b-5p在結直腸癌細胞侵襲過程的具體調控機制，以支持本研究結論。

miR-30家族中的miR-30a包含miR-30a-3p和miR-30a-5p 2個亞型，分別來源于miR-30a前體莖環的3’端和5’端。目前對miR-30a-5p的研究，大多集中在腫瘤細胞增殖、侵襲方面，miR-30a-5p定位于人類6號染色體q13，除被證實可作為炎性因子外[21-23]，miR-30a-5p在不同類型腫瘤中表達趨勢并不一致，如在Li等[24]的研究中，miR-30a-5p通過調控Erk/Ets信號通路活性，抑制乳腺癌增殖、侵襲，而Jia等[25]發現miR-30a-5p在膠質瘤中具有促癌基因功能，可能與不同腫瘤具有特異分子生物機制有關，說明miR-30a-5p參與調控腫瘤的復雜性。目前關于miR-30a-5p在結直腸癌中表達意義的研究有限，本研究發現，與結直腸腺瘤患者、健康體檢者相比，結直腸癌患者血清miR-30a-5p表達降低，結合患者臨床病理特征發現，血清miR-30a-5p低表達與腫瘤組織低分化、較深浸潤深度、淋巴結轉移及較晚臨床分期關系緊密，上述結果表明miR-30a-5p低表達促進了結直腸癌癌變，并參與了腫瘤細胞去分化過程，如miR-30a-5p可通過作用于多種靶蛋白，對非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤EMT過程產生抑制作用[26]，而miR-30a-5p在結直腸癌中的分子調控機制，值得進一步探究。

圖1 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達水平在結直腸癌患者不同預后中比較 圖2 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達水平診斷結直腸癌價值的ROC曲線圖

表3 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表達水平對結直腸癌診斷價值的ROC分析

對結直腸癌患者而言，腫瘤細胞浸潤侵襲，進而發生淋巴結轉移、遠處轉移是導致患者病情惡化、生存率低、預后差的重要因素。根據患者術后隨訪資料，繪制Kaplan-Meier生存曲線發現，血清miR-106b-5p高表達組、miR-30a-5p低表達組患者的預后均較差，術后5年生存率低且中位生存時間短，提示血清miR-106b-5p、miR-30a-5p可作為結直腸癌患者預后預測的分子標志物；ROC分析結果表明，血清miR-106b-5p、miR-30a-5p對結直腸癌均有較高的診斷價值，且二指標聯合檢測的敏感度、特異度明顯升高。活檢或術后的病理診斷是目前臨床上結直腸癌的主要診斷手段，同時輔以血清腫瘤標志物檢測，本研究結果表明，血清miR-106b-5p，miR-30a-5p檢測可用于結直腸癌患者的輔助診斷，減少患者篩查結直腸癌的負擔。但鑒于本研究為單中心回顧性研究，樣本量小，存在一定局限性，研究結論有待進一步證實。

綜上，結直腸癌患者血清miR-106b-5p呈現高表達、血清miR-30a-5p呈現低表達，且均與患者病情惡化進展、不良預后相關，檢測血清miR-106b-5p、miR-30a-5p水平或可作為輔助結直腸癌的預后預測和診斷的有效手段。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張煌：提出研究方向、起草論文、撰寫論文；魯恒珍：數據收集和分析整理；周帥躍、鄭華理：實施研究過程，進行文獻調研與整理；朱愛萍：設計研究方案、研究思路、研究選題、修訂論文、論文終審