角膜緣干細胞缺乏的臨床診斷及手術治療進展

潘玉苗，楊燕寧

(武漢大學人民醫(yī)院眼科中心，武漢 430060)

角膜緣干細胞缺乏(limbal stem cell deficiency，LSCD)是由于角膜上皮干細胞或前體細胞在數量上和(或)功能上的降低而導致角膜上皮正常動態(tài)平衡不能維持的眼表疾病[1]。臨床上表現(xiàn)為角膜緣屏障功能受損，甚至角膜上皮的結膜化，最終可導致角膜盲。LSCD的準確診斷至關重要，因為正確的診斷以及對角膜緣受累范圍的評估是制訂治療策略的基礎。以往對LSCD的診斷主要依據病史及臨床表現(xiàn)[2]，但是對于臨床體征的解釋存在一定的主觀性。隨著眼部成像技術及分子診斷標志物的發(fā)展，LSCD的診斷進入了一個新時代。LSCD可單眼發(fā)病也可雙眼發(fā)病，受累的角膜緣干細胞可以是部分也可以是全周。部分LSCD可局限于角膜的一個或多個部分，當中央角膜不受累時可采取保守治療策略；而對于全周LSCD無論是單側還是雙側，通過手術干預來替換受損或缺失的干細胞可能是目前唯一的治療方法[3]。在目前的幾種角膜緣干細胞移植技術中，自體角膜緣干細胞移植是最佳的方法，但供體組織的匱乏以及對自身健眼的損害使其發(fā)展受到一定限制?，F(xiàn)就LSCD的臨床診斷及手術治療進展予以綜述。

1 LSCD的診斷方法

1.1傳統(tǒng)診斷方法

1.1.1臨床表現(xiàn)及裂隙燈顯微鏡檢查 LSCD患者的癥狀主要與角膜上皮愈合不良和復發(fā)性角膜上皮缺損相關，如眼紅、視力下降、畏光、異物感、流淚、眼瞼痙攣和疼痛等[1]，但這些癥狀均具非特異性，不足以明確診斷。LSCD的體征主要包括角膜上皮的結膜化、持續(xù)性或復發(fā)性上皮缺損、伴或不伴眼表新生血管及眼表炎癥以及瘢痕形成等，其中角膜上皮的結膜化是診斷最具特異性的指標[4]。角膜上皮熒光素染色可見異常的上皮變薄甚至螺紋樣上皮改變，另外Vogt柵欄的丟失也是LSCD的一種表現(xiàn)，但角膜緣區(qū)域Vogt柵欄結構差異較大，同一患者角膜緣的Vogt柵欄在上下角膜緣數量最多且顯著，在鼻側及顳側數量最少[5]，并且Vogt柵欄的丟失也與年齡有關[6]。因此，在診斷中缺乏一定的特異性。

1.1.2印跡細胞學 印跡細胞學是一種簡單、無創(chuàng)的技術，可檢測角膜表面的杯狀細胞和結膜上皮細胞。角膜上存在結膜杯狀細胞是LSCD角膜上皮結膜化的有力證據，目前認為是診斷LSCD的“金標準”，但對于病變早期或結膜化程度輕微者缺乏靈敏度[7]。此外，在某些眼表疾病晚期也會出現(xiàn)完全角化，如Steven′s Johnson綜合征患者結膜杯狀細胞可能完全缺失，通過印跡細胞學無法檢測到[8-9]。因此，陽性印跡細胞學結果可以確診，而陰性結果不能排除該診斷。

1.2成像技術診斷方法

1.2.1體內激光掃描共聚焦顯微鏡(in vivo laser scanning confocal microscopy，IVCM) IVCM可在細胞水平觀察LSCD患者角膜及角膜緣的微觀結構改變。Vogt柵欄早期呈輕度形態(tài)改變，晚期結構完全消失[10]。角膜上皮結膜化的表現(xiàn)是角膜上出現(xiàn)杯狀細胞，但目前對杯狀細胞形態(tài)特征的認識還存在爭議，一些報道認為杯狀細胞的細胞質呈高反射性[11-12]，也有研究認為呈低反射性[13]，造成此現(xiàn)象的原因可能與杯狀細胞的分泌狀態(tài)不同有關。在LSCD的診斷方面，IVCM與印跡細胞學診斷具有較高的一致性(90%)(Kappa=0.85)[12]。近年來，隨著成像技術的發(fā)展，已有研究利用IVCM評估LSCD的嚴重程度，如在LSCD早、中期，上皮基底細胞密度和基底神經密度顯著減小，而晚期正常基底細胞形態(tài)完全喪失，基底神經不可見[10]。亦有研究利用IVCM早期診斷以及角膜上皮及角膜緣微結構的改變來監(jiān)測疾病的進展，結果發(fā)現(xiàn)，IVCM上LSCD的微觀結構改變要早于臨床表現(xiàn)，且基底細胞密度降低程度、中央區(qū)角膜上皮和角膜緣上皮變薄程度均與疾病嚴重程度呈正相關[14-15]。目前已有學者基于臨床表現(xiàn)及IVCM觀察提出了新的LSCD臨床評分系統(tǒng)[16]，有望對LSCD進行準確的臨床分期，便于監(jiān)測疾病的進展及治療。

1.2.2前段光學相干斷層掃描(anterior segment-optical coherence tomography，AS-OCT) AS-OCT是一種快速、簡便、非接觸式的角膜成像技術，主要用于分析各種眼表疾病角膜上皮厚度變化。超高分辨的AS-OCT使角膜緣的Vogt柵欄、血管、淋巴管和神經纖維結構可視化，協(xié)助LSCD病情評估，同時使角膜緣干細胞移植取材更具針對性[17-18]。有研究表明，AS-OCT上LSCD患者受累區(qū)域角膜及角膜緣上皮變薄，且上皮變薄程度與疾病嚴重程度相關[19]，同時也可看到Vogt柵欄及角膜緣隱窩消失[1,20]，但同樣存在年齡和檢查部位的差異。此外，隨著OCT技術的發(fā)展，血管造影技術使得角膜-鞏膜組織形態(tài)結構可視化，可評估LSCD角膜新生血管形成[21-22]。由于角膜新生血管不是LSCD的特異性征象，OCT血管造影在LSCD診斷中的應用價值有限，但它可能是量化LSCD角膜新血管形成的重要工具。

1.3分子生物學技術診斷方法 細胞角蛋白(cytokeratins，CK)是一組細胞骨架蛋白，可在上皮細胞中形成中間絲，并在上皮發(fā)育和分化過程中以不同的形式表達。CK19是結膜上皮細胞的標志物，印跡細胞學CK19陽性被認為是角膜上皮結膜化的依據，曾被用于LSCD的診斷，但CK19在角膜緣和外周角膜上皮中也有表達[23]，因此需進一步研究CK19在診斷中的特異性。CK12被認為是角膜上皮細胞的標志物，且可用于評估LSCD的嚴重程度，CK12陽性提示輕度LSCD，CK12陰性提示重度LSCD[24]。其他標志物(CK7[25]、CK13[24,26]、黏蛋白1[27]和黏蛋白5AC[23,28]等)也可用于LSCD的輔助診斷。

檢測CK的傳統(tǒng)技術為免疫組織化學染色。然而研究發(fā)現(xiàn)，逆轉錄聚合酶鏈反應檢測黏蛋白5AC轉錄物較免疫組織化學染色更客觀[28]。此外，還有學者應用高效液相色譜法、二維電泳以及液相色譜-串聯(lián)質譜法對先天性無虹膜患者的淚液進行蛋白質或細胞因子分析[29-30]。與印跡細胞學相比，淚液采集更容易且對上皮損傷較小，但先天性無虹膜患者僅占LSCD病因很小的一部分，因此其診斷價值有限。結膜和角膜上皮細胞特異性標志物以及檢測技術的進步提高了傳統(tǒng)印跡細胞學的靈敏度和特異度，結合分子生物學和體內成像，LSCD的診斷將更加可靠。

2 LSCD的手術治療

2.1羊膜移植 羊膜雖不提供干細胞，但能促進殘留干細胞的增殖和遷移，有助于角膜的修復、改善視力，減輕疼痛和畏光等癥狀，對于部分LSCD患者療效顯著。研究表明，將羊膜作為臨時補片用于角膜緣干細胞的急性損傷，可減少瘢痕形成和角膜渾濁，降低LSCD進展風險[31-33]。羊膜移植與傳統(tǒng)手術結合可提高手術成功率，如聯(lián)合角膜清創(chuàng)和各種類型的角膜緣上皮移植術等均取得了良好的療效[34]。

2.2角膜緣上皮干細胞移植

2.2.1自體結膜角膜緣干細胞移植術(conjunctival limbal autograft，CLAU) 由于CLAU取材于自身對側眼，不存在免疫排斥且移植成功率較高，故目前仍是單側LSCD的首選術式。有研究顯示，CLAU的短期和中期隨訪手術成功率為80%～100%，且視力提高25%～100%[35]。長期隨訪顯示，術后3年和術后6年的成功率分別為76%和62%[36]。Baradaran-Rafii等[37]回顧分析了34例單側LSCD患者CLAU術后的病例資料，結果發(fā)現(xiàn)，CLAU常見的術后并發(fā)癥與植片(大小、厚度、位置和排列)及慢性眼表暴露有關。上皮延遲愈合和持續(xù)性的上皮缺損是術后最常見的并發(fā)癥。但關于植片的最佳尺寸尚未達成共識，經典的植片大小為兩個60°的植片，目前認為<180°的植片對供眼不會造成影響，過小的植片會影響手術成功率[38]。Baradaran-Rafii等[39]報道了5例采用單一植片取材范圍60°的CLAU，結果顯示，5例患者均出現(xiàn)持續(xù)角膜上皮缺損，其中2例患者出現(xiàn)角膜穿孔。雖然CLAU是比較可靠且成熟的手術方式，但仍有造成對側眼損傷的風險，因此應重視術前對側眼的評估及術后并發(fā)癥的預防。

2.2.2同種異體結膜角膜緣干細胞移植術(conjunctival limbal allograft，CLAL) CLAL取材可來源于健在親屬或死亡供體，植片取材與CLAU相同。CLAL可用于雙側LSCD的治療，但由于免疫反應和同種異體移植排斥的風險，影響了CLAL的成功率[40]。有研究采用組織相容性抗原供體-受體匹配、全身免疫制劑、術中取材時使用環(huán)磷酰胺取結膜緣移植物以及用纖維蛋白膠固定移植物等方法降低了免疫和排斥反應[41-42]，但移植失敗也可能與LSCD的病因相關[43]。

2.2.3環(huán)形同種異體角膜緣移植術(keratolimbal allograft，KLAL) KLAL主要取材于新鮮尸體，植片由兩個半環(huán)的板層、小部分鞏膜、全角膜緣以及周邊透明角膜部分組成，不包括結膜，可提供大量的干細胞用于單側或雙側LSCD。由于KLAL不提供結膜組織，更適用于先天性無虹膜、接觸鏡相關以及醫(yī)源性等LSCD。伴有結膜受損的LSCD可采用改良的新技術，即KLAL聯(lián)合CLAL[44]。急性免疫排斥反應是KLAL最常見的術后并發(fā)癥，故KLAL術后患者需要使用全身免疫抑制劑以減輕免疫排斥反應和慢性炎癥[45]。

2.2.4離體培養(yǎng)的角膜緣上皮干細胞移植(cultured limbal epithelial transplantation，CLET) CLET取大小為1 mm×2 mm的角膜緣組織進行離體培養(yǎng)后移植到病變角膜上，取材可取自體對側健眼、活體親屬眼或新鮮尸眼。CLET取材所需的供體細胞數量較少，降低了供眼患LSCD風險，復合移植物培養(yǎng)中缺乏朗格漢斯細胞，可降低免疫排斥反應[40]。CLET的缺點為目前離體細胞的培養(yǎng)主要為組織塊培養(yǎng)和細胞懸浮培養(yǎng)，嚴格的無菌環(huán)境和較高的硬件設施使得成本增加，而培養(yǎng)基使用的動物衍生品等增加了人畜共患病的風險，且該方法不能提供結膜組織，有嚴重結膜疾病的患者不能從中受益[40,46]。近年研究表明，CLET術后總體成功率約為70%，且自體移植物和同種異體移植物的CLET差異無統(tǒng)計學意義[47-48]。已報道的CLET術后并發(fā)癥包括移植物下出血、感染性角膜炎、皰疹病毒性角膜炎、排斥反應、青光眼、持續(xù)性上皮缺損、角膜穿孔以及環(huán)孢素相關的不良反應等[40,48-50]。

2.2.5其他來源的黏膜上皮細胞移植 目前對雙側LSCD的治療仍是一個挑戰(zhàn)。為了解決供體組織匱乏的問題，已有研究尋找其他來源的干細胞用于眼表重建，其中體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮移植已被證明是安全、有效的替代品，成功率高達80%[51-52]。體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮移植失敗主要與持續(xù)的角膜上皮缺損、角膜表面新生血管形成以及角膜表面的纖維化有關[53]。Bardag-Gorce等[54]報道，術后發(fā)生角膜表面新生血管生成可能是由于缺乏抗血管生成因子。但目前對于術后新生血管生成的具體機制尚不清楚。此外，人體胚胎干細胞、皮膚表皮干細胞、毛囊干細胞、骨髓間充質干細胞和未成熟牙髓干細胞等其他細胞來源正在研究中[55]，但需要進一步的實驗證據證明它們在LSCD中的功效。

2.2.6單純角膜緣上皮移植術(simple limbal epithelial transplantation，SLET) 2012年，Sangwan等[56]提出應用SLET治療單側LSCD，從健康眼睛獲得2 mm×2 mm角膜緣組織并分成8～10個小塊保存于平衡鹽溶液中，然后360°環(huán)形剪開球結膜，去除角膜表面的新生血管及結膜上皮，將新鮮羊膜置于角膜上，并通過纖維蛋白膠將移植物均勻地分布在新鮮羊膜上，最后表面覆以繃帶鏡，該技術需要的角膜緣組織非常少，降低了CLAU供體眼LSCD的風險，成功率較高。Amescua等[57]用冷凍保存的羊膜改進了SLET方法，他們將角膜緣組織置于雙層羊膜之間，為干細胞增殖建立胚胎時期的微環(huán)境，稱之為“夾心技術”，術后移植成功率達100%，且術中及術后隨訪期間未見明顯并發(fā)癥，視力也均有所提高。Vazirani等[58]的多中心研究顯示，自體SLET成功率高達80%，兩行視力提高率約為65%。Basu等[59]的單中心研究報道了對125例單側LSCD患者行自體SLET平均隨訪1.5年的結果，成功率為76%，兩行視力提高率為75%。Arora等[60]的前瞻性研究比較了SLET和CLAU，兩者在眼表重建的成功率均為100%，且兩者在眼表重建及視力改善方面療效相當。在已報道的受體眼的并發(fā)癥中局部LSCD復發(fā)最常見，在不影響視軸的情況下可密切觀察，必要時行手術干預；其他并發(fā)癥還包括角膜結膜化進一步進展、瞼球粘連、羊膜下出血、植片與羊膜間的不粘連移位、無菌性或細菌性角膜炎、角膜新生血管的復發(fā)、持續(xù)性角膜上皮缺損以及角膜上皮過度增生等，可行相應的對癥處理[50,58- 59,61-62]。雖然大多數報道SLET用于單眼疾病，且主要是自體來源的SLET，不需要免疫抑制劑，但Bhalekar等[63]報道了異體來源的SLET也可治療雙側LSCD，雖然術后3個月內出現(xiàn)了同種異體移植物排斥反應，但予以局部及全身激素治療后好轉，研究強調了異體來源的SLET需持續(xù)使用免疫抑制劑。可見，SLET為角膜盲病例提供了實用的解決方案，特別是在離體擴增技術不實用的地區(qū)。

3 小 結

眼部成像技術及分子標志物檢測技術的發(fā)展使人們對角膜及角膜緣細胞的結構有了進一步的認識，同時提高了對LSCD的精確診斷。建立LSCD發(fā)生閾、對LSCD的嚴重程度進行分層仍處于臨床研究中。目前尚未確定角膜緣上皮干細胞的特定分子標志物。近年來，在供體來源相對匱乏的情況下，培養(yǎng)的角膜緣上皮干細胞移植顯示了良好的應用前景。但培養(yǎng)后的角膜干細胞的分化、生理生化的變化以及異體移植后如何降低排斥反應等一系列問題均亟待解決?？傊?，隨著培養(yǎng)和擴增技術的發(fā)展以及支架和基質的改進，新一代干細胞技術將用于臨床以最終解決LSCD的問題。